CN111549153A - 一种双重实时荧光定量pcr引物和探针以及检测方法 - Google Patents

一种双重实时荧光定量pcr引物和探针以及检测方法 Download PDF

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王光华
王戈平
马利青
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Abstract

本发明公开了一种双重实时荧光定量PCR引物和探针以及检测方法，属于病原体检测技术领域。本发明采用双重实时荧光定量PCR技术建立快速检测羊布鲁氏菌、流产衣原体的方法，该方法与单重实时荧光定量PCR相比，灵敏度上无明显差异，重复性实验结果显示本方法具有良好的稳定性。本发明方法简化了实验步骤，节约了试剂及样本用量，节约成本，为快速检测羊群中流产因素提供参考信息，为相关流产类疾病的鉴别诊断提供技术支持，从而减少养殖业损失。

Description

一种双重实时荧光定量PCR引物和探针以及检测方法
技术领域
本发明涉及病原体检测技术领域，更具体的说是涉及一种用于同时检测布鲁氏菌、流产衣原体的双重实时荧光定量PCR引物和探针以及检测方法。
背景技术
布鲁氏菌是一种革兰氏阴性、细胞内寄生菌，为小球杆状菌；主要感染动物，牛、羊、猪、狗以及骆驼、鹿等动物都可能被感染，通过接触感染动物或者被感染的食物以及实验室接触可传播给人类。布鲁氏菌细胞膜是一个三层膜的结构，最内层的膜称为细胞质膜、外层膜称为外周胞质膜，最外层膜称为外膜；能引起人和多种动物的急性和慢急性感染，被感染的人和动物表现为流产及不孕不育等症状。
流产衣原体属于衣原体科、衣原体属，系一类细胞内寄生的革兰阴性原核型微生物。流产衣原体可以引起羊地方性流产，表现为流产、死产和产弱羔，也可以引起子宫内膜炎、结膜炎和关节炎。同时，流产衣原体能够感染怀孕妇女，导致怀孕妇女流产，这给人类公共卫生构成了巨大威胁。
目前已存在多种单独针对布鲁氏菌、流产衣原体的PCR检测方法，但同时对布鲁氏菌、流产衣原体进行检测的双重实时荧光定量PCR方法未见报道。
因此，提供一种双重实时荧光定量PCR引物和探针以及检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种双重实时荧光定量PCR引物和探针以及检测方法，特异性强，灵敏度高。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种双重实时荧光定量PCR引物和探针，用于同时检测布鲁氏菌和流产衣原体；
用于检测布鲁氏菌的引物序列如下：
Brucella-F：5’-CACGTCCGAATTCAAGCCGA-3’；SEQ ID NO.1；
Brucella-R：5’-GCGTCAAGGCCGAGAATGAA-3’；SEQ ID NO.2；
用于检测布鲁氏菌的探针序列如下：
Brucella-P：5’-TCGGCGGCCTTTACACCGGCTACA-3’，SEQ ID NO.3；其中5’端标记的荧光基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为BHQ1；
用于检测流产衣原体的引物序列如下：
Chlamydia-F：5’-GGCATGGGTGCAGTTCCTAC-3’；SEQ ID NO.4；
Chlamydia-R：5’-GGTGAACCATTCGGCGTCTT-3’；SEQ ID NO.5；
用于检测流产衣原体的探针序列如下：
Chlamydia-P：5’-CCTACGGATAGACCCAACATCGCTTACGGCA-3’，SEQ ID NO.6；其中5’端标记的荧光基团为VIC，3’端标记的淬灭基团为BHQ1；
进一步，一种双重实时荧光定量PCR检测试剂盒，含有上述双重实时荧光定量PCR引物和探针。
进一步，一种双重实时荧光定量PCR检测试剂盒，还含有标准阳性模板：布鲁氏菌阳性样品DNA模板、流产衣原体阳性样品DNA模板；阴性对照样品：RNase free H2O。
进一步，一种双重实时荧光定量PCR检测方法，具体步骤如下：
(1)提取样品DNA；
(2)以所述样品DNA为模板，利用所述的双重实时荧光定量PCR引物和探针进行实时荧光定量PCR扩增，得到扩增曲线；
(3)对所述扩增曲线进行分析，并作出判断。
进一步，步骤(2)所述扩增体系为：模板2μl、10μm/L Brucella-F 0.4μl、10μm/LBrucella-R 0.4μl、10μm/L Brucella-P 0.2μl、10μm/L Chlamydia-F 0.4μl、10μm/LChlamydia-R 0.4μl、10μm/L Chlamydia-P 0.2μl、2×Probe PCR Master mix 10μl、RNAfree H2O 6μl。
进一步，步骤(2)所述扩增程序为：95℃2min；95℃5s，60℃30sec，45个循环；从60℃步骤开始收集荧光信号。
进一步，步骤(3)所述对扩增曲线进行分析判断的原则为：
当FAM荧光通道中Ct≤38时，荧光通道有扩增曲线时，判断样品为布鲁氏菌阳性；
当FAM荧光通道中38<Ct≤45时，荧光通道有扩增曲线时，重复一次实验，如果FAM荧光通道Ct还是在此范围之内或小于等于38就判断样品为布鲁氏菌阳性，否则判断样品为布鲁氏菌阴性；
当FAM荧光通道中无扩增曲线时，判断样品为布鲁氏菌阴性；
当VIC荧光通道中Ct≤38时，荧光通道有扩增曲线时，判断样品为流产衣原体阳性；
当VIC荧光通道中38<Ct≤45时，荧光通道有扩增曲线时，重复一次实验，如果FAM荧光通道Ct还是在此范围之内或小于等于38就判断样品为流产衣原体阳性，否则判断样品为流产衣原体阴性；
当VIC荧光通道中无扩增曲线时，判断样品为流产衣原体阴性。
进一步，所述的一种双重实时荧光定量PCR引物和探针在制备用于同时检测布鲁氏菌和流产衣原体的试剂盒中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种双重实时荧光定量PCR引物和探针以及检测方法，能够同时检测两种病原，大大提高了检测效率，节约了检测时间及检测成本，一般的普通PCR检测方法或者常用的血清学检测方法时间均在3个小时以上，本发明将检测时间缩短至1个小时；本发明特异性强，对其他常见引发流产的病毒、细菌和寄生虫基因样本都没有非特异性扩增；灵敏度高，高达10拷贝/ml。本发明的引物对、探针、试剂盒及检测方法，解决了用两对引物对和两个探针就可以同时检测出布鲁氏菌、流产衣原体两种病原，且使其特异性强，灵敏度高的问题，这也是本发明最大的技术难点。本发明检测时间周期短、检测效率高，具有潜在的应用价值；本发明所涉及的引物和探针序列特异性的靶向布鲁氏菌、流产衣原体，探针序列长达24bp、33bp，使得与其他生物产生非特异性扩增的概率为(1/4)24和(1/4)33，几乎为零，这也保证了本发明的特异性和准确率高；在进行病原体定性分析的同时还能进行病原体定量分析，定量线性范围好；检测灵敏度高；操作简单、易于推广；实验结果重复性好，精密度高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明布鲁氏菌、流产衣原体标准品扩增曲线；
其中，曲线1-10为实线，为布鲁氏菌扩增曲线图，曲线1-9的阳性质粒浓度分别为109拷贝/ml、108拷贝/ml、107拷贝/ml、106拷贝/ml、105拷贝/ml、104拷贝/ml、103拷贝/ml、102拷贝/ml、101拷贝/ml，曲线10为阴性对照(阴性对照模板为RNA free H2O)；曲线11-20为虚线，为流产衣原体扩增曲线图，曲线11-19阳性质粒浓度分别为109拷贝/ml、108拷贝/ml、107拷贝/ml、106拷贝/ml、105拷贝/ml、104拷贝/ml、103拷贝/ml、102拷贝/ml、101拷贝/ml，曲线20为阴性对照(阴性对照模板为RNA free H2O)；
图2附图为本发明布鲁氏菌标准品浓度标准曲线；
图3附图为本发明流产衣原体标准品浓度标准曲线；
图4附图为本发明特异性试验结果图；
其中，曲线1为标准阳性质粒扩增结果(布鲁氏菌阳性)，曲线2为标准阳性质粒扩增结果(流产衣原体阳性)，曲线3-8(虚线)为绵羊肺炎支原体、沙门氏菌、巴氏杆菌、弓形虫、住肉孢子虫、羊传染性脓疱病毒对照样品(流产衣原体)扩增阴性；曲线10-15(实线)为绵羊肺炎支原体、沙门氏菌、巴氏杆菌、弓形虫、住肉孢子虫、羊传染性脓疱病毒对照样品(流产衣原体)扩增阴性，虚线9为阴性对照(RNA free H2O)流产衣原体扩增阴性，实线16为阴性对照(RNA free H2O)布鲁氏菌扩增阴性；
图5附图为本发明布鲁氏菌灵敏度试验结果图；
其中，曲线1-10阳性质粒浓度分别为109拷贝/ml、108拷贝/ml、107拷贝/ml、106拷贝/ml、105拷贝/ml、104拷贝/ml、103拷贝/ml、102拷贝/ml、101拷贝/ml、100拷贝/ml，曲线11为阴性对照(阴性对照模板为RNAfreeH2O)；
图6附图为本发明流产衣原体灵敏度试验结果图；
其中，曲线12-21阳性质粒浓度分别为109拷贝/ml、108拷贝/ml、107拷贝/ml、106拷贝/ml、105拷贝/ml、104拷贝/ml、103拷贝/ml、102拷贝/ml、101拷贝/ml、100拷贝/ml，曲线22为阴性对照(阴性对照模板为RNA free H2O)；
图7附图为本发明布鲁氏菌重复性试验结果图；
其中，曲线1-3对应质粒浓度3.6x109拷贝/ml，4-6对应质粒浓度109拷贝/ml，7-9对应质粒浓度108拷贝/ml，10-12对应质粒浓度107拷贝/ml，13-15对应质粒浓度106拷贝/ml，16-18对应质粒浓度105拷贝/ml，19-21对应质粒浓度104拷贝/ml，22-24对应质粒浓度103拷贝/ml，25-27对应质粒浓度102拷贝/ml，28-30对应性对照模板为RNAfreeH2O；
图8附图为本发明流产衣原体重复性试验结果图；
其中，曲线31-33对应质粒浓度3.6x109拷贝/ml，34-36对应质粒浓度109拷贝/ml，37-39对应质粒浓度108拷贝/ml，40-42对应质粒浓度107拷贝/ml，43-45对应质粒浓度106拷贝/ml，46-48对应质粒浓度105拷贝/ml，49-51对应质粒浓度104拷贝/ml，52-54对应质粒浓度103拷贝/ml，55-57对应质粒浓度102拷贝/ml，58-60对应阴性对照模板为RNA free H2O。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1布鲁氏菌、流产衣原体标准品扩增
试验过程：其中模板为标准品，即阳性质粒(该质粒中连接了布鲁氏菌、流产衣原体阳性片段)，质粒浓度为109拷贝/ml，108拷贝/ml，107拷贝/ml，106拷贝/ml，105拷贝/ml，104拷贝/ml，103拷贝/ml，102拷贝/ml及101拷贝/ml。
扩增体系为：模板2μl、10μm/L Brucella-F 0.4μl、10μm/L Brucella-R 0.4μl、10μm/L Brucella-P 0.2μl、10μm/L Chlamydia-F 0.4μl、10μm/L Chlamydia-R0.4μl、10μm/LChlamydia-P 0.2μl、2×Probe PCR Master mix 10μl、RNA free H2O6μl。
扩增程序为：95℃2min；95℃5s，60℃30sec，45个循环；从60℃步骤开始收集荧光信号。
扩增结果见图1，其中质粒浓度与循环数结果见表1。
表1
Figure BDA0002488583320000061
根据表1结果获得图2的布鲁氏菌标准曲线，和图3的流产衣原体标准曲线(纵坐标为标准品CT值，横坐标为标准品浓度的对数)，其相关度均为0.992。
实施例2特异性试验
以细菌阳性基因组DNA(绵羊肺炎支原体、沙门氏菌、巴氏杆菌)，寄生虫阳性基因组DNA(弓形虫、住肉孢子虫)，病毒样品DNA(羊传染性脓疱病毒)为对照进行特异性试验，结果见图4；图4结果显示仅有布鲁氏菌、流产衣原体阳性样品即标准阳性质粒检测结果有扩增曲线，为阳性，其余对照检测样品均为阴性，说明该方法特异性好。
实施例3灵敏度试验
将阳性标准质粒浓度稀释至浓度分别为109拷贝/ml，108拷贝/ml，107拷贝/ml，106拷贝/ml，105拷贝/ml，104拷贝/ml，103拷贝/ml，102拷贝/ml，101拷贝/ml及100拷贝/ml，作为模板，进行灵敏度试验。
扩增程序为：95℃2min；95℃5s，60℃30sec，45个循环；从60℃步骤开始收集荧光信号。
其中，布鲁氏菌敏感试验结果见图5，结果显示，曲线1-9均有扩增，为布鲁氏菌阳性，10-11无扩增，为布鲁氏菌阴性；即敏感度可扩增至101拷贝/ml。流产衣原体敏感性试验结果见图6，结果显示，曲线12-20均有扩增，为流产衣原体阳性，21-22无扩增，为流产衣原体阴性，即敏感度可扩增至101拷贝/ml。
实施例4重复性试验
以标准阳性质粒为模板，每个样品3个重复，9个不同稀释度(3.6x109拷贝/ml，109拷贝/ml，108拷贝/ml，107拷贝/ml，106拷贝/ml，105拷贝/ml，104拷贝/ml，103拷贝/ml，102拷贝/ml)的样品以及1个阴性对照样品(阴性对照模板为RNA free H2O)，共10个样品，进行重复性试验。其中，布鲁氏菌重复性试验结果见图7，流产衣原体重复性试验结果见图8；图7-图8结果显示，试验扩增曲线重复性好，有良好的稳定性。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 青海省畜牧兽医科学院
<120> 一种双重实时荧光定量PCR引物和探针以及检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
cacgtccgaa ttcaagccga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gcgtcaaggc cgagaatgaa 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tcggcggcct ttacaccggc taca 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ggcatgggtg cagttcctac 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ggtgaaccat tcggcgtctt 20
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
cctacggata gacccaacat cgcttacggc a 31

Claims (8)

1.一种双重实时荧光定量PCR引物和探针，其特征在于，用于同时检测布鲁氏菌和流产衣原体；
用于检测布鲁氏菌的引物序列如下：
Brucella-F：5’-CACGTCCGAATTCAAGCCGA-3’；SEQ ID NO.1；
Brucella-R：5’-GCGTCAAGGCCGAGAATGAA-3’；SEQ ID NO.2；
用于检测布鲁氏菌的探针序列如下：
Brucella-P：5’-TCGGCGGCCTTTACACCGGCTACA-3’，SEQ ID NO.3；其中5’端标记的荧光基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为BHQ1；
用于检测流产衣原体的引物序列如下：
Chlamydia-F：5’-GGCATGGGTGCAGTTCCTAC-3’；SEQ ID NO.4；
Chlamydia-R：5’-GGTGAACCATTCGGCGTCTT-3’；SEQ ID NO.5；
用于检测流产衣原体的探针序列如下：
Chlamydia-P：5’-CCTACGGATAGACCCAACATCGCTTACGGCA-3’，SEQ ID NO.6；其中5’端标记的荧光基团为VIC，3’端标记的淬灭基团为BHQ1。
2.一种双重实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的双重实时荧光定量PCR引物和探针。
3.根据权利要求2所述的一种双重实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，还含有标准阳性模板：布鲁氏菌阳性样品DNA模板、流产衣原体阳性样品DNA模板；阴性对照样品：RNase free H2O。
4.一种双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)提取样品DNA；
(2)以所述样品DNA为模板，利用权利要求1所述的引物和探针进行实时荧光定量PCR扩增，得到扩增曲线；
(3)对所述扩增曲线进行分析，并作出判断。
5.根据权利要求4所述的一种双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤(2)所述扩增体系为：模板2μl、10μm/L Brucella-F 0.4μl、10μm/L Brucella-R 0.4μl、10μm/LBrucella-P 0.2μl、10μm/L Chlamydia-F 0.4μl、10μm/L Chlamydia-R 0.4μl、10μm/LChlamydia-P 0.2μl、2×Probe PCR Mastermix 10μl、RNA free H2O 6μl。
6.根据权利要求4所述的一种双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤(2)所述扩增程序为：95℃2min；95℃5s，60℃30sec，45个循环；从60℃步骤开始收集荧光信号。
7.根据权利要求4所述的一种双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤(3)所述对扩增曲线进行分析判断的原则为：
当FAM荧光通道中Ct≤38时，荧光通道有扩增曲线时，判断样品为布鲁氏菌阳性；
当FAM荧光通道中38<Ct≤45时，荧光通道有扩增曲线时，重复一次实验，如果FAM荧光通道Ct还是在此范围之内或小于等于38就判断样品为布鲁氏菌阳性，否则判断样品为布鲁氏菌阴性；
当FAM荧光通道中无扩增曲线时，判断样品为布鲁氏菌阴性；
当VIC荧光通道中Ct≤38时，荧光通道有扩增曲线时，判断样品为流产衣原体阳性；
当VIC荧光通道中38<Ct≤45时，荧光通道有扩增曲线时，重复一次实验，如果FAM荧光通道Ct还是在此范围之内或小于等于38就判断样品为流产衣原体阳性，否则判断样品为流产衣原体阴性；
当VIC荧光通道中无扩增曲线时，判断样品为流产衣原体阴性。
8.权利要求1所述的一种双重实时荧光定量PCR引物和探针在制备用于同时检测布鲁氏菌和流产衣原体的试剂盒中的应用。
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