CN111549123A - 环状rna 0089762的检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及环状RNA 0089762的检测试剂盒，所述试剂盒包含环状RNA 0089762的检测试剂，所述环状RNA 0089762的序列为SEQ ID NO.1；所述检测试剂包括扩增环状RNA 0089762的引物一对，所述引物包括上游引物如SEQ ID NO.2和下游引物如SEQ ID NO.3；本发明还提供环状RNA 0089762的检测试剂盒，所述试剂盒包含环状RNA 0089762的检测试剂；所述检测试剂包括地高辛标记的寡核苷酸探针如Probe 1，并将环状RNA 0089762的检测试剂盒应用于非酒精性脂肪性肝病的临床诊断中。

Description

环状RNA 0089762的检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及环状RNA 0089762的检测试剂盒及其在非酒精性脂肪性肝病中的应用。

背景技术

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是指除酒精外的其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，包括非酒精性单纯性脂肪肝（simplesteatosis）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）及其相关肝硬化（cirrhosis）。近年来，随着人们生活习惯和饮食结构的改变，非酒精性脂肪性肝病的患病率日益增高，我国已经达到15.35%，且呈不断升高趋势；在西方国家更是高达20-25%，已成为第一大肝病；NAFLD与肥胖、糖尿病、高脂血症等代谢性疾病密切相关。非酒精性单纯性脂肪肝是一种良性疾病，但NASH却可逐渐进展为肝硬化、肝癌等终末期肝病。回顾研究发现，NASH患者中41％的病人可以发展为肝纤维化，5.4％的病人进展为终末期肝病甚至肝癌。此外，由于脂变肝脏对很多药物和毒物的敏感性增加，增加了临床用药风险；再者，NAFLD可通过加剧机体代谢紊乱促进糖尿病、冠心病等的发展，导致代谢综合征相关肿瘤及心血管事件的高发；如果脂变肝脏作为供体，会引起移植后肝脏原发性无功能而导致移植失败，因此，加强NAFLD发病机制研究和发现新的防治手段迫在眉睫。

环状RNA是一种特殊的内源性非编码RNA，是继微小RNA及长链非编码RNA后RNA家族的又一研究热点。近年来，随着RNA测序技术和生物信息学的迅速发展，人们通过分析大规模转录组数据发现环状RNA大量存在，约占真核细胞转录本的10%，相较于miRNA和长链非编码RNA，环状RNA具有较为显著的一些特性，如：具有环状闭合结构，无polyA尾巴，不易被核酸外切酶降解，能够更加稳定地存在于真核细胞中，且序列多数高度保守，具有一定的组织结构特异性，使得环状RNA在基因表达及其他生物学过程中占据重要地位。环状RNA与多种疾病密切相关，在疾病的发生发展过程中起着至关重要的调控作用，因此，环状RNA在未来可能会成为一种高效能的临床诊断标志物。

最近有研究证实，一种环状RNA与NAFLD有着紧密联系，NAFLD患者肝成纤维细胞内线粒体定位的环状RNA 0089762表达显著下调，故环状RNA 0089762可作为NAFLD的分子靶标。

发明内容

本发明提供了环状RNA 0089762的检测试剂盒，并将其应用于NAFLD患者诊断，为临床诊断提供新思路。

本发明采用的技术方案如下：

在第一个方面，本发明提供一种环状RNA 0089762的检测试剂盒，所述试剂盒包含环状RNA 0089762的检测试剂，所述环状RNA 0089762的序列为SEQ ID NO.1。

进一步地，所述环状RNA 0089762的检测试剂包括扩增环状RNA 0089762的引物一对，所述引物包括上游引物如SEQ ID NO.2和下游引物如SEQ ID NO.3，其中，

SEQ ID NO.2：GCTGCATGTGCCATGTCGCC；

SEQ ID NO.3：GGCCACCAATGGTACTGAACC。

在第二个方面，本发明提供环状RNA 0089762的检测试剂盒通过qRT-PCR方法应用于非酒精性脂肪性肝病的临床诊断。

在第三个方面，本发明还提供了一种环状RNA 0089762的检测试剂盒，所述检测试剂包括地高辛标记的寡核苷酸探针如Probe 1，其中，

Probe 1：DIG-CCTAGAACCAGGCGACATGGCACATGCAGCGC-DIG。

在第四个方面，本发明还提供了一种环状RNA 0089762的检测试剂盒通过Northern blotting或荧光原位杂交方法应用于非酒精性脂肪性肝病的临床诊断。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

1、本发明通过设计针对于环状RNA 0089762的引物和探针并利用其制备环状RNA0089762的检测试剂盒，首先，分别设计了针对环状RNA 0089762的引物和针对线性RNA0089762的引物进行qRT-PCR，其次，分别设计了针对环状RNA 0089762和同时针对环状及线性RNA 0089762的地高辛标记的寡核苷酸探针进行Northern blotting和荧光原位杂交，最终证实了环状RNA 0089762的真实存在以及在非酒精性脂肪性肝病诊断方面的适用性。

2、本发明提供一种环状RNA 0089762的检测试剂盒，通过设计合成的引物和探针，利用qRT-PCR、Northern blotting以及FISH等方法有效检测到非酒精性脂肪性肝病患者肝成纤维细胞内线粒体定位的环状RNA 0089762表达明显下调，因此，环状RNA 0089762可作为非酒精性脂肪性肝病的分子靶标，可有效应用于非酒精性脂肪性肝病患者，为其临床诊断提供新思路。

附图说明

图1为经过本发明实施例1检测后在有和没有RNase R处理的情况下正常人和NASH患者的每个成纤维细胞内环状RNA 0089762和线性RNA 0089762的拷贝数变化示意图；

图2为经过本发明实施例1检测后在有和没有RNase R处理的情况下正常人和NASH患者的成纤维细胞的线粒体内和胞浆内环状RNA 0089762表达量变化示意图；

图3为本发明实施例2中针对环状RNA 0089762设计的地高辛标记的寡核苷酸探针Probe 1以及同时针对环状和线性RNA 0089762设计的地高辛标记的寡核苷酸探针Probe 2的示意图；

图4为经过本发明实施例2检测后在转染和未转染环状RNA 0089762过表达载体、有和没有RNase R处理的情况下，NASH患者成纤维细胞中环状和线性RNA 0089762的表达量比对示意图；

图5为经过本发明实施例3检测后正常人、非酒精性单纯性脂肪肝患者、非酒精性脂肪性肝炎伴轻度肝纤维化患者以及非酒精性脂肪性肝炎肝硬化患者的成纤维细胞中环状RNA0089762的表达量比对示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例来对发明进行详细的说明。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本发明提供环状RNA 0089762的检测试剂盒，所述试剂盒包含环状RNA 0089762的检测试剂；所述环状RNA 0089762的序列为SEQ ID NO.1。

进一步地，所述检测试剂包括扩增环状RNA 0089762的引物一对，所述引物包括上游引物如SEQ ID NO.2和下游引物如SEQ ID NO.3，其中，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的序列为：

SEQ ID NO.2：GCTGCATGTGCCATGTCGCC；

SEQ ID NO.3：GGCCACCAATGGTACTGAACC。

本实施例中还针对线性RNA 0089762设计引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，针对线性RNA 0089762设计引物的目的是与环状RNA 0089762进行比较，验证环状RNA 0089762不易被RNase R降解的特性，证实环状RNA 0089762的环状结构，SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.4的序列为：

SEQ ID NO.4：GGTCTGCGGCTAGGAGTCAA；

SEQ ID NO.5：TTCCTAGAACCAGGCGACCCAG。

进一步地，将所述环状RNA 0089762的检测试剂盒应用于非酒精性脂肪性肝病的临床诊断，通过qRT-PCR方法检测正常人和NASH患者每个肝成纤维细胞内环状RNA 0089762的拷贝数，具体方法如下所示：

首先，用TRIzol试剂分别提取正常人和NAFLD患者肝成纤维细胞的总RNA，部分样品的总RNA用1U/μg的核糖核酸酶R（RNase R）在37℃处理15min，其中，RNase R是一种可以消化线性RNA的酶；用随机引物和可去除基因组污染的反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA模板并扩增；通过染料法荧光定量试剂盒和罗氏实时荧光定量PCR仪进行半定量qRT-PCR；

其次，将线性RNA 0089762和环状RNA 0089762的母基因分别插入到带有T7启动子的pUC57-Amp载体中，用转录试剂盒体外转录RNA，将体外转录的分子量为250469.5 g/mol的线性RNA 0089762和分子量为128826.2 g/mol的环状RNA 0089762进行梯度稀释，得到标准曲线；基于每个细胞的总RNA为20pg的假设，通过标准曲线和半定量qRT-PCR得到的Ct值可以推断出每个细胞的拷贝数；

其中，绝对定量qRT-PCR的具体操作步骤参见如下文献：

Chen, F., Chen, J., Yang, L., Liu, J., Zhang, X., Zhang, Y., Tu, Q., Yin,D., Lin, D., Wong, P.P., et al. (2019). Extracellular vesicle-packaged HIF-1alpha-stabilizing lncRNA from tumour-associated macrophages regulatesaerobic glycolysis of breast cancer cells. Nature cell biology 21, 498-510；

Su, S., Zhao, Q., He, C., Huang, D., Liu, J., Chen, F., Chen, J., Liao,J.Y., Cui, X., Zeng, Y., et al. (2015). miR-142-5p and miR-130a-3p areregulated by IL-4 and IL-13 and control profibrogenic macrophage program. NatCommun 6, 8523；

标准曲线的具体制作步骤参见如下文献：

Liu, B., Sun, L., Liu, Q., Gong, C., Yao, Y., Lv, X., Lin, L., Yao, H.,Su, F., Li, D., et al. (2015). A cytoplasmic NF-kappaB interacting longnoncoding RNA blocks IkappaB phosphorylation and suppresses breast cancermetastasis. Cancer cell 27, 370-381。

本发明对现有技术的改进不在于绝对定量qRT-PCR和标准曲线的制作，故本发明对此不另做说明和限定。

通过上述实验可知，具体结果如图1，正常人和NASH患者的成纤维细胞在有和没有RNase R处理的情况下，环状RNA 0089762的拷贝数均未见显著差异，而线性RNA的拷贝数在RNase R处理时大幅减少，说明环状RNA 0089762不易被RNase R降解；在无RNase R处理时，NASH患者的环状RNA 0089762拷贝数显著低于正常人，NASH患者的环状RNA 0089762表达明显下调，说明了环状RNA 0089762能够作为诊断NASH的标志物。

最后，用培养细胞的线粒体分离试剂盒分别分离出正常人和NAFLD患者肝成纤维细胞的线粒体和胞浆部分。用TRIzol试剂分别提取线粒体和胞浆的总RNA，部分样品的总RNA用1U/μg的核糖核酸酶R（RNase R）在37℃处理15min；用随机引物和可去除基因组污染的反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA模板并扩增。通过染料法荧光定量试剂盒和罗氏实时荧光定量PCR仪进行半定量qRT-PCR，检测环状RNA 0089762的相对表达量；具体实验结果如图2所示，在无RNase R处理时，正常人肝成纤维细胞的线粒体内环状RNA 0089762表达量明显高于胞浆，即证明环状RNA 0089762定位于线粒体；在无RNase R处理时，NASH患者肝成纤维细胞线粒体内环状RNA 0089762的表达量显著低于正常人，即NASH患者肝成纤维细胞线粒体内环状RNA 0089762表达明显下调。

实施例2

本发明另外还提供一种环状RNA 0089762的检测试剂盒，所述试剂盒包含上述的环状RNA 0089762的检测试剂；所述检测试剂包括地高辛标记的寡核苷酸探针如Probe 1（如图3所示），其中，

Probe 1（探针1）的序列为：

DIG-CCTAGAACCAGGCGACATGGCACATGCAGCGC-DIG。

Probe 2（探针2）为针对环状RNA 0089762和线性RNA 0089762设计的地高辛标记的寡核苷酸探针，Probe 2设计的目的是与环状RNA 0089762进行比较，验证环状RNA0089762不易被RNase R降解，证实环状RNA 0089762的环状结构，Probe 2序列为：

DIG-ACTAACTAATACTAACATCTCAGACGCTCAGGA-DIG

进一步地，将环状RNA 0089762的检测试剂盒通过Northern blotting方法应用于非酒精性脂肪性肝病的临床诊断，具体检测方法如下所示：

首先，合成环状RNA 0089762基因序列，并将其插入到环状RNA过表达载体pcD-ciR中，同时将NASH患者的成纤维细胞接种于24孔板中，然后使用转染试剂Lipofectamine 3000，将环状RNA过表达载体转染至成纤维细胞内；

其次，用TRIzol试剂提取总RNA，部分样品的总RNA用1U/μg的核糖核酸酶R（RNase R）在37℃下处理15min，将10-20μg有或无RNase R预处理的RNA加到2%甲醛/MOPS/琼脂糖凝胶上，80V电泳，根据loading跑到合适位置时停止电泳。将RNA转移到阳性尼龙膜上，一般转膜时间为1.5-2h，转膜完成后置于电泳液中清洗10s，随后用1200×100 μJ/cm²紫外交联2min；

最后，将膜与地高辛杂交液（DIG Easy Hyb buffer）在52℃条件下预杂交30min，将地高辛标记的寡核苷酸探针(8 pM)在52℃条件下与膜杂交过夜，然后用强力洗涤液清洗膜3次，室温下用封闭液封闭30分钟，加入anti-digoxigenin-AP孵育30min，用CSPD化学发光液在Lumi-film胶片上曝光，以溴化乙锭染色的rRNA作为对照，用激光扫描仪Typhoon 9500scanner观察和量化条带，并用ImageQuant进行定量；结果如图4所示，与无RNase R处理组相比，RNase R处理组的环状RNA 0089762的表达量无明显差异，而线性RNA的表达量明显下降，即环状RNA 0089762不易被RNase R降解；与未转染环状RNA 0089762过表达载体的NASH成纤维细胞相比，转染过表达载体的NASH成纤维细胞中环状RNA 0089762的表达量显著增加，而线性RNA 0089762的表达量无明显差异，证明环状RNA 0089762能够作为诊断NASH的标志物。

其中，环状RNA过表达载体的具体合成步骤参见如下文献：Han, D., Li, J.,Wang, H., Su, X., Hou, J., Gu, Y., Qian, C., Lin, Y., Liu, X., Huang, M., etal.(2017). Circular RNA circMTO1 acts as the sponge of microRNA-9 to suppresshepatocellular carcinoma progression. Hepatology 66, 1151-1164。

实施例3

实施例3与实施例2采用相同的地高辛标记的寡核苷酸探针Probe 1，不同之处在于：将环状RNA 0089762的检测试剂盒通过荧光原位杂交方法应用于非酒精性脂肪性肝病的临床诊断，具体检测方法如下所示：

（1）抽样34名正常人、31名非酒精性单纯性脂肪肝患者、28名非酒精性脂肪性肝炎伴轻度肝纤维化患者以及13名非酒精性脂肪性肝炎肝硬化患者的肝组织石蜡包埋切片分别用二甲苯梯度无水乙醇脱蜡脱水，PBS（磷酸盐缓冲液）洗3次，多聚甲醛固定；

（2）切片在含有2×SSC（柠檬酸钠缓冲液）的50%甲酰胺溶液的环境中中，52°C预杂交2小时，然后加入实施例2中所述的针对环状RNA 0089762的地高辛标记的寡核苷酸探针Probe 1杂交过夜；

（3）将杂交后的切片在PBST（磷酸盐吐温缓冲液）中用3%H₂O₂处理30min以封闭内源性过氧化物酶活性，随后与5% BSA（牛血清白蛋白）孵育1小时，然后与抗地高辛-FITC抗体(体积比为1：300)、兔抗人/鼠COX IV抗体(体积比为1：200)以及山羊抗人/鼠α-SMA(体积比为1：200)在4°C孵育过夜；

（4）将孵育过夜后的切片在PBST中洗涤，然后与Alexa Fluor®647驴抗兔IgG(体积比为1：300)和Cy3驴抗山羊IgG(体积比为1：300)共同孵育；

（5）切片用Hoechst 33342染色，细胞信号在每个视野下被量化，使用共聚焦显微镜(Zeiss LSM 800)在400倍的放大倍数下对每个切片至少10个视野进行评估，使用Imaris9.0算法学习工具，通过FITC阳性斑点划分Alexa Fluor®647和FITC的共定位斑点，来计算0089762+α-SMA+细胞占α-SMA+细胞总数的百分比，每个样本在放大倍数为400倍时，对至少10个视野进行了评估和量化，具体结果如图5所示，与正常人相比，NAFLD患者环状RNA0089762的表达量明显减少，并呈现出从单纯性脂肪肝到非酒精性脂肪性肝炎肝硬化逐步下降的趋势。

综上所述，依据本发明设计合成的引物或探针，并利用上述实施例1-3的检测方法能够有效检测到NASH患者的肝成纤维细胞内线粒体定位的环状RNA 0089762表达下调，因此，利用本发明设计合成的引物或探针能够实现对非酒精性脂肪性肝病的诊断。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 中山大学附属第三医院

<120> 环状RNA 0089762的检测试剂盒及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 396

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

gtcgcctggt tctaggaata atgggggaag tatgtaggag ttgaagatta gtccgccgta 60

gtcggtgtac tcgtaggttc agtaccattg gtggccaatt gatttgatgg taagggaggg 120

atcgttgacc tcgtctgtta tgtaaaggat gcgtagggat gggagggcga tgaggactag 180

gatgatggcg ggcaggatag ttcagacggt ttctatttcc tgagcgtctg agatgttagt 240

attagttagt tttgttgtga gtgttaggaa aagggcatac aggactagga agcagataag 300

gaaaatgatt atgagggcgt gatcatgaaa ggtgataagc tcttctatga taggggaagt 360

agcgtcttgt agacctactt gcgctgcatg tgccat 396

Claims (5)

1.一种环状RNA 0089762的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含环状RNA0089762的检测试剂，所述环状RNA 0089762的序列为SEQ ID NO.1。

2.如权利要求1所述的一种环状RNA 0089762的检测试剂盒，其特征在于：所述环状RNA0089762的检测试剂包括扩增环状RNA 0089762的引物一对，所述引物包括上游引物如SEQID NO.2和下游引物如SEQ ID NO.3，其中，

SEQ ID NO.2：GCTGCATGTGCCATGTCGCC；

SEQ ID NO.3：GGCCACCAATGGTACTGAACC。

3.如权利要求2所述的一种环状RNA 0089762的检测试剂盒通过qRT-PCR方法应用于非酒精性脂肪性肝病的临床诊断。

4.如权利要求1所述的一种环状RNA 0089762的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂包括地高辛标记的寡核苷酸探针如Probe 1，其中，

Probe 1：DIG-CCTAGAACCAGGCGACATGGCACATGCAGCGC-DIG。

5.如权利要求4所述的一种环状RNA 0089762的检测试剂盒通过Northern blotting或荧光原位杂交方法应用于非酒精性脂肪性肝病的临床诊断。

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