CN111534442A - 一种耐盐米曲霉及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种耐盐米曲霉及其应用。所述的耐盐米曲霉保藏名称为米曲霉TN‑37，已于2019年12月19日，保藏至中国典型培养物保藏中心，分类命名为米曲霉(Aspergillus oryzae)，保藏编号为CCTCC NO：M20191067；米曲霉TN‑37单独应用于酱油渣的生物处理，或与德巴利汉逊酵母、海洋酵母混合应用于酱油渣的生物处理。本发明的耐盐米曲霉，具有良好的耐盐性和产酶特性，其对酱油渣进行生物处理，能够有快速消除异味，同时改善酱油渣中胞外酶的种类，提高酱油渣的酶活性，将处理后的酱油渣添加到饲料中，可以有效提高饲料的利用率。

Description

一种耐盐米曲霉及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种耐盐米曲霉及其应用。
背景技术
酱油渣又称酱油渣，是制作酱油后的残渣，其营养丰富，粗蛋白含量约为25％，粗脂肪9.7％、粗纤维13.5％、灰分10.5％，其中食盐含量较高，约10％，有的高达25％，还含有丰富的异黄酮及高生物活性物质等(阎杰，宋光泉，值得开发的“废物”一酱油渣，中国调味品，2006年10月，10:14-17)。
但是酱油渣水分含量大，极易腐败变质，长途运输困难，常常怪味扰民。正常生产的企业每天都要产生大量的废渣，需要立刻处理，否则环境污染极其严重，特别是夏季，处理不及时会产生强烈刺鼻的酸臭味，熏得周围的居民头晕、恶心。生产厂家常以低价售给农民作搭配饲料利用，处理不当会造成环境污染，而且没有处理的酱油渣动物适口性差，其中食盐含量较高，长期饲喂酱油渣或一次喂量过多，极易引起食盐中毒，轻者进食锐减、体重减轻，重则动物死亡。因此，酱油渣不宜直接作为动物饲料直接应用。
对于酱油渣的处理，通过烘干或进一步提取活性物质的方法，成本高，投入大，收益相对较小，还容易造成环境问题，而利用微生物对酱油渣进一步处理，经济方便，节能环保，性价比高。
对于微生物处理酱油渣，目前主要针对酱油渣残余蛋白的有效利用角度，如开发做饲料、栽培用复合基质、蛋白质酶解再利用三个方面进行研究，而开发饲料研究较多。但由于酱油渣中的盐分含量高，严重影响微生物的生长，一般需要添加大量的辅料，如麸皮、饼粕等，稀释降低含盐量，再经高温灭菌，作为发酵的基质，然后再外加菌种发酵，从而使粗纤维下降，适口性改善，也有对酱油渣直接发酵，但发酵时间较长，一般需要几周的发酵周期。
目前酱油渣的生物处理，研究主要集中在怎样利用其中的蛋白上，而对酱油渣的异味造成的环境污染问题关注严重不足。为了降低高盐对微生物生长的抑制作用，需要大量添加价值高的营养物质，还要经过灭菌处理后再发酵，大大增加了成本，处理后的产物也比较单一。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种耐盐米曲霉，其对酱油渣进行生物处理，能够有快速消除异味，同时改善酱油渣中胞外酶的种类，提高酱油渣的酶活性；本发明还提供其应用。
本发明所述的耐盐米曲霉，该菌株的保藏名称为米曲霉TN-37，已于2019年12月19日，保藏至中国典型培养物保藏中心，分类命名为米曲霉(Aspergillus oryzae)，保藏编号为CCTCC NO：M20191067。
米曲霉TN-37是从内蒙古自治区呼和浩特市土默特左旗的土壤中分离(北纬40.6197，东经110.7988)。
所述米曲霉TN-37的ITS序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID No.6所示。
在NCBI网站上，将将扩增的ITS的核苷酸序列用BLAST在GenBank数据库中查找和比对同源或相似的核苷酸序列。对比结果显示，此序列与登录号为MK503967、MN421000、MN410607等覆盖率100％，相似度达到100％。ITS序列在曲霉属真菌中，不能很好地区分到种，只能鉴定到群(group，许多相似的种组成的群)。而要鉴定到种，需要根据微管蛋白Tubulin基因(Ben)、钙调蛋白CAM基因、RNA聚合酶结合蛋白RPB2基因综合鉴定。
将所得序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行Blastn比对，从GenBank数据库中下载相似的序列，通过Bioedit对三种序列分别进行排列后校正，然后将三种合并为一个序列，采用PAUP 4.0b10软件的非加权简约法进行系统树的构建。通过1000次的bootstrap评估系统树分支的稳定性。我们以Aspergillus muricatus作为外群，构建系统发育树，分离到的菌株TN-37与Aspergillus oryzae聚类在一起，而与A.flavus明显区分开来，boostrap分析得到98％的支持。
菌株TN-37的形态特征为：在PDA培养基上生长迅速，菌落每天生长达到1.2厘米，气生菌丝发达，菌落边缘白色，菌落上产生黄绿色分生孢子。分生孢子头放射状，直径150-300μm。分生孢子梗2mm左右。分生孢子梗直立，分生长约0.1-2mm，近顶囊处直径达12-25μm，壁较薄，粗糙。顶囊烧瓶形，直径通常40-50μm。小梗一般为单层，12-15μm，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，成熟时大多变为球形或近球形，一般4.5μm，粗糙或近于光滑。形态特征与米曲霉形态特征相符。
根据生物学的形态特征及其ITS序列鉴定，本发明提供的菌株为米曲霉菌种。
本发明所述的米曲霉TN-37具有良好的耐盐性和产酶特性，其可以应用于酱油渣的生物处理，米曲霉TN-37接种量为4×105-2×106CFU/mL，处理温度为20-30℃。
本发明所述的米曲霉TN-37也可以与德巴利汉逊酵母(Debaryomyces hansenii，Y9)、海洋酵母(Kodamaea ohmeri，Y155)混合应用于酱油渣的生物处理，米曲霉TN-37、德巴利汉逊酵母、海洋酵母的接种量相同，均为4×105-2×106CFU/mL，处理温度为20-30℃。
上述酱油渣的盐含量为10-25wt％。
与现有技术相比，本发明有以下有益效果：
(1)本发明的米曲霉TN-37具有良好的耐盐性和产酶性能，单独应用于高盐含量的酱油渣的生物处理，能够快速消除异味，同时改善酱油渣中胞外酶的种类，提高酶活性；
(2)本发明的米曲霉TN-37与德巴利汉逊酵母、海洋酵母混合应用于高盐含量的酱油渣的生物处理，处理后的酱油渣带有一定的香味，酱油渣的蛋白酶活性、纤维酶活性、淀粉酶活性和植酸酶活性大大提高，将处理后的酱油渣添加到饲料中，可以有效提高饲料的利用率。
附图说明
图1为米曲霉菌株TN-37的形态特征图；
图1中：A、在直径6厘米的PDA上生长5天的菌落特征；B、分生孢子；C、生长在次生孢子梗上的分生孢子；D、分生孢子梗顶端和次生分生孢子梗；标尺＝10μm；
图2为米曲霉菌株TN-37与曲霉属flavus组中相关种类的聚类分析图；
图3为不同含盐量的YPD培养基上米曲霉菌株TN-37的生长情况图；
图3中：M1-M6分别是米曲霉菌株Mi在含盐量分别为6％、8％、10％、12％、14％、16％的YPD培养基上的菌落形态；T1-T6：分别是米曲霉菌株TN-37在含盐量分别为6％、8％、10％、12％、14％、16％的YPD培养基上的菌落形态；
图4为米曲霉菌株TN-37分别和德巴利汉逊酵母(Debaryomyces hansenii)、海洋酵母(Kodamaea ohmeri)在6％NaCl的YPD培养基上25℃共培养5天的生长情况图；
图4中：Y9为Debaryomyces hansenii，Y155为Kodamaea ohmeri；
图5为在5％含盐量的条件下，不同含盐量培养基上的蛋白酶活性检测；
图5中：M1-M5分别是米曲霉菌株Mi在含盐量分别为6％、8％、10％、12％、14％的蛋白酶作用脱脂奶粉后形成的透明圈大小；T1-T5分别是米曲霉菌株TN-37在含盐量分别为6％、8％、10％、12％、14％的蛋白酶作用脱脂奶粉后形成的透明圈大小；CK1-CK5分别是含盐量分别为6％、8％、10％、12％、14％的清水对照；
图6为米曲霉菌株TN-37在纤维素检测平板上的生长情况图；
图6中：M1、米曲霉菌株Mi在纤维素检测平板上的菌落形态；M2、米曲霉菌株Mi形成的透明圈；T1、米曲霉菌株TN-37在纤维素检测平板上的菌落形态；T2、米曲霉菌株TN-37形成的透明圈；
图7为各个测试样品的蛋白酶活性检测图；
图7中：1-14分别是编号1-14的测试样品形成的透明圈；CK是清水对照；
图8为各个样品中的纤维素酶活性检测图；
图8中：1-14分别是编号1-14的测试样品形成的透明圈；CK是清水对照；
图9为各测试样品中的淀粉酶活性检测图；
图9中：1-14分别是编号1-14的测试样品形成的透明圈；CK是清水对照；
图10为各测试样品中的植酸酶活性检测图；
图10中：1-14分别是编号1-14的测试样品；15是清水对照。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围不仅限于此，该领域专业人员对本发明技术方案所作的改变，均应属于本发明的保护范围内。
以下实施例中所采用的PDA培养基为：200g马铃薯，20g葡萄糖，18g琼脂，0.3g氯霉素(Chloramphenicol)，1000mL蒸馏水。
实施例1
米曲霉菌株TN-37的分离鉴定：
1、菌株分离：
采用选择性培养基稀释平板法分离，过程如下：称取10g土样，放入装有小钢珠与90mL无菌水的250mL三角瓶中，在摇床上以120r·min-1摇10min，使土样充分分散，即成10-1倍稀释液；再吸取搅拌中的10-1倍稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的离心管中，即成10-2倍稀释液；依次制成10-3倍稀释液。将已融化的含盐PDA培养基(在PDA培养基中加入7％的NaCl)倒入培养皿中，每皿15mL；待培养基冷却成平板后，分别吸取10-2、10-3倍的土样稀释液0.1mL于分离培养基平板上，再用无菌涂布器将稀释液涂匀，每个浓度重复3次。在25℃的光照培养箱中培养3d后观察菌落，挑取特征菌落的菌丝于PDA平板上，待菌落直径长到3cm时再次转接到PDA平板上。
菌株TN-37是从内蒙古自治区呼和浩特市土默特左旗的土壤中分离(北纬40.6197，东经110.7988)。
2、菌株形态鉴定：
菌株TN-37的形态特征如图1所示：在PDA培养基上生长迅速，菌落每天生长达到1.2厘米，气生菌丝发达，菌落边缘白色，菌落上产生黄绿色分生孢子。分生孢子头放射状，直径150-300μm。分生孢子梗2mm左右。分生孢子梗直立，分生长约0.1-2mm，近顶囊处直径达12-25μm，壁较薄，粗糙。顶囊烧瓶形，直径通常40-50μm。小梗一般为单层，12-15μm，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，成熟时大多变为球形或近球形，一般4.5μm，粗糙或近于光滑。形态特征与米曲霉形态特征相符。
3、菌株分子鉴定：
(1)DNA提取
a.在PDA平板上22℃培养菌株7天后，用牙签刮取平板上的菌丝，放入已灭菌的含有300μL提取缓冲液1.5mL离心管中；
提取缓冲液的配方为：1M KCl，100mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH＝8.0；
b.将挑取的菌丝用电磨机研碎，然后再加入300μL提取缓冲液，剧烈震荡2min；
c.10000rpm离心10min；
d.吸取上清液，转移至另一新的离心管中，弃沉淀；
e.在上清液中加入等体积的异丙醇(分析纯)，轻轻颠倒混匀数次后，12000rpm离心10min，沉淀核酸；
f.轻轻倒去上清液，将含有沉淀的离心管倒置在吸水纸上排干水分；
g.再加入300μL 70％乙醇，轻轻颠倒混匀数次后，12000rpm离心2min；
h.轻轻倒去上清液，重复步骤(g)一次；
i.将离心管倒置在吸水纸上排干水分，置于37℃下15min，使乙醇充分挥发；
j.用50μL ddH2O重悬沉淀，得到基因组DNA，浓度达到30ng/μL。
(2)真菌ITS
1)rDNA基因、微管蛋白Tubulin基因、钙调蛋白CAM基因、RNA聚合酶结合蛋白RPB2基因的PCR扩增
ITS引物：上游引物ITS1序列为：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，下游引物ITS4序列为：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；
微管蛋白Tubulin基因引物：上游引物Bt2a：GGT AAC CAA ATC GGT GCT GCT TTC，下游引物Bt2b：ACC CTC AGT GTA GTG ACC CTT GGC；
CAM引物：上游引物CMD5：CCG AGT ACA AGG ARG CCT TC，下游引物CMD6：CCG ATRGAG GTC ATR ACG TGG；
RPB2引物：上游引物5F：GAY GAY MGW GAT CAY TTY GG，下游引物7CR：CCC ATRGCT TGY TTR CCC AT。
PCR扩增在50μL反应体系中进行，体系中含有：上下游引物各2μM，dNTPs 200μM，MgCl2 1.5mM，10×PCR buffer 5μL，模版DNA 2μL，Taq酶2U。
PCR扩增反应在朗基MG96G型PCR仪上进行。反应条件：94℃预变性2min，然后35个循环包括：94℃变性30sec，55℃退火40sec，72℃延伸1min。最后72℃后延伸10min。
2)PCR产物的回收纯化
PCR反应结束后，PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，采用爱思进生物技术公司的DNA凝胶纯化试剂盒，按照试剂盒说明书的步骤进行，步骤如下：
a.将50μL PCR产物全部加到1％的琼脂糖凝胶的点样孔中，按5V/CM的电泳条件电泳30min；
b.电泳结束后，在紫外灯下用刀片切取含目的DNA片段的凝胶，置于2mL离心管中，称重；
c.按照1mg凝胶加入3mL的DE-A缓冲液的标准，加入DE-A缓冲液到收集凝胶的2mL离心管中，75℃保温10min，期间振荡数次，至完全融化；
d.加入0.5倍DE-A体积的DE-B缓冲液，混合均匀；
e.将DNA制备管放入2mL离心管中，将混合液转移到DNA制备管中，12000rpm离心1min，弃上清；
f.将DNA制备管放回2mL离心管中，加500μL缓冲液W1，12000rpm离心30s；
g.将DNA制备管放回2mL离心管中，加700μL缓冲液W2，12000rpm离心30s；
h.重复步骤(g)一次；
i.将DNA制备管放回2mL离心管中，12000rpm离心2min，以排干膜上洗涤液；
j.将DNA制备管放回2mL离心管中，加50μL的ddH2O，10000rpm离心1min，洗脱DNA置-20℃下保存。
3)基因的测序和序列分析
经电泳检测后的已经纯化回收的目的DNA片段送至上海生工用ABIPRISMA377型自动测序仪进行测序。测序结果经过严格核对后，得到如SEQ ID No.1-SEQ ID No.6所示的DNA片段序列。
在NCBI网站上，将测得菌株TN-37的ITS的核苷酸序列用BLAST在GenBank数据库中查找和比对同源或相似的核苷酸序列。对比结果显示，此序列与登录号为MK503967、MN421000、MN410607等覆盖率100％，相似度达到100％。ITS序列在曲霉属真菌中，不能很好地区分到种，只能鉴定到群(group，许多相似的种组成的群)。而要鉴定到种，需要根据微管蛋白Tubulin基因(Ben)、钙调蛋白CAM基因、RNA聚合酶结合蛋白RPB2基因综合鉴定。
将所得序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行Blastn比对，从GenBank数据库中下载相似的序列(见表1)，通过Bioedit对三种序列分别进行排列后校正，然后将三种合并为一个序列，采用PAUP 4.0b10软件的非加权简约法进行系统树的构建。通过1000次的bootstrap评估系统树分支的稳定性。我们以Aspergillus muricatus作为外群，构建系统发育树，结果如图2所示，本研究中分离到的菌株TN-37与Aspergillus oryzae聚类在一起，而与A.flavus明显区分开来，boostrap分析得到98％的支持。
根据微管蛋白Tubulin基因、钙调蛋白CAM基因、RNA聚合酶结合蛋白RPB2基因合并的序列，构建系统发育树。
表1从Genebank数据库中下载的用于构建系统发育树的基因序列
种名 Ben Cam RPB2
Aspergillus oryzae EF661483 EF661506 EF661438
A.flavus MG517618 MG518010 MG517800
A.minisclerotigenes EF203148 MG518009 MG517799
A.aflatoxiformans MG517719 MG518089 MG517910
A.austwickii MG517704 MG518074 MG517895
A.cerealis MG517692 MG518062 MG517883
A.parasiticus EF661481 EF661516 EF661449
A.sergii MG517688 MG518059 MG517879
A.mottae MG517687 MG518058 MG517878
A.subflavus MG517773 MG518143 MG517964
A.pseudocaelatus MG517626 MG517995 MG517809
A.bertholletius MG517689 JX198674 MG517880
A.luteovirescens MG517625 MG517998 MG517808
A.nomius EF661494 EF661531 EF661456
A.alliaceus EF661465 EF661534 MG517825
A.togoensis FJ491477 FJ491489 JN121479
A.aspearensis MG517669 MG518040 MG517857
A.avenaceus FJ491481 FJ491496 JN121424
A.muricatus EF661356 EF661365 EF661314
实施例2
米曲霉菌株TN-37的耐盐性和产酶特性研究：
1、米曲霉菌株TN-37在不同含盐量的PDA培养基上菌落的生长情况
在YPD中分别加入5％、6％、8％、10％、12％、14％、16％的NaCl，然后接种菌株TN-37，以本公司生产中用的米曲霉菌株Mi为对照，在25℃培养6天，检查生长情况，如图3所示。
从图3中可以看出，在6％含盐量以下，米曲霉菌株TN-37与对照菌株的菌落大小差别不大，但是产孢量大幅下降；在5％含盐量下，米曲霉菌株TN-37的产孢量是8×107孢子/平方厘米，而对照菌株的产孢量只有1×107孢子/平方厘米；在含盐量从8％开始，对照菌株的菌落比米曲霉菌株TN-37明显减小，对照菌株在14％的含盐量的培养基上停止生长，而米曲霉菌株TN-37在16％的PDA上还可以生长。
2、米曲霉菌株TN-37和两株酵母菌共培养：
将米曲霉菌株TN-37分别和德巴利汉逊酵母(Debaryomyces hansenii，Y9)、海洋酵母(Kodamaea ohmeri，Y155)在含6％NaCl的YPD培养基共培养，在25℃培养5天，生长情况如图4所示。
从图4可以看出，米曲霉菌株TN-37和两株酵母菌在共培养中没有相互抑制现象。
3、米曲霉菌株TN-37在高盐条件下的产酶情况：
(1)在YPD中分别加入6％、8％、10％、12％、14％的NaCl，然后接种米曲霉菌株TN-37，以本公司生产中用的米曲霉菌株Mi为对照，在25℃培养6天，然后将培养皿放在-70℃超低温冰箱中过夜。将培养基取出，用一个干净的培养皿盖挤压，取挤压出的液体作为酶粗提液。
蛋白酶的测定：取1克琼脂糖，5gNaCl在100毫升的50mM Tris-HCI(PH＝7.8)缓冲液中充分融化后，冷却到45℃，加入1g脱脂奶粉，充分溶解后倒入13×13cm的方形塑料培养皿中，冷却凝固后，用4mm直径的打孔器在平板上打孔。将酶粗提液40μL加到小孔中，25℃培养10h，观察透明圈的大小，结果如图5所示。
一般认为高盐条件下酶的活性受到很强的抑制。从图5可以看出，在高盐条件下米曲霉菌株TN-37蛋白酶活性比生产上用的米曲霉菌株Mi明显提高，一般情况下高一倍。在14％的含盐量情况下，米曲霉菌株Mi已经没有蛋白酶活性(停止生长)，而米曲霉菌株TN-37蛋白酶活性还存在。
(2)米曲霉菌株TN-37纤维素酶酶活测定
产纤维素酶菌株检测培养基：CMC 10g，(NH4)2SO4 4g，KH2PO4 2g，MgSO4·7H2O0.5g，蛋白胨1.0g，琼脂16g，去氧胆酸钠0.5g，加水1000ml，121℃高压灭菌10min。将木霉菌株在PDA培养基平板上于28℃下培养5天，用打孔器从PDA平板菌落边缘打取菌落小块，放置于初筛培养基平板上，28℃下培养4天。0.1％的刚果红染液覆盖平板，静置30min，再用1mol.L-1NaCl洗1h，观察各菌株是否产生水解透明圈，结果如图6所示。
从图6可以看出，以本公司生产中用的米曲霉菌株Mi为对照，米曲霉菌株TN-37在纤维素检测平板上生长速度明显比米曲霉菌株Mi快，说明米曲霉菌株TN-37能够降解纤维素为自己提供营养。米曲霉菌株TN-37的透明圈直径比米曲霉菌株Mi大一倍以上。
实施例3
利用米曲霉菌株TN-37处理酱油渣：
1、酱油渣处理方法：用灭菌水将米曲霉菌株TN-37、德巴利汉逊酵母(Debaryomyces hansenii，Y9)、海洋酵母(Kodamaea ohmeri，Y155)分别按照表2所示，配成相应的孢子液。本公司的酱油渣经过压榨，含水量为28-30％，含盐量在10％左右。在100g酱油渣中加入40mL真菌孢子液，混匀后置于不同的温度下进行静止培养，分别在24h和48h检查，用人工方式检查酱油渣异味的处理结果。
将处理过程中的酱油渣异味分为5级：
0级：无酱油渣异味；
1级：酱油渣很轻，但可以闻到；
2级：酱油渣有明显的异味；
3级：酱油渣有较强的异味，但比未处理的轻；
4级：酱油渣未处理，有强烈的异味。
(1)用米曲霉菌株TN-37，接种量在4×105CFU/mL-2×106CFU/mL，温度在20℃-30℃之间，经过24h处理，酱油渣的异味已经很轻；处理48h后，已经没有任何酱油渣的气味；在15℃时，处理结果较差，还有明显的酱油渣气味；在35℃时，处理24h产生了明显的刺激性氨味。Y9和Y155处理虽然也可以明显降低酱油渣的异味，但是明显不如米曲霉菌株TN-37。
表2不同浓度的真菌对酱油渣除味处理结果
Figure BDA0002469541980000091
Figure BDA0002469541980000101
*菌量：A：TN-37，2×106CFU/mL；
B：TN-37，8×105CFU/mL；
C：TN-37，4×105CFU/mL；
D：Y9，2×106CFU/mL；
E：Y9，8×105CFU/mL；
F：Y9，4×105CFU/mL；
G：Y155，2×106CFU/mL；
H：Y155，8×105CFU/mL；
I：Y155，4×105CFU/mL。
**表格中的数字代表处理后酱油渣异味的等级。
(2)将表2中的各个处理后的酱油渣按15％的量再接种未处理的酱油渣，进行生物处理，得到的结果与表2的相同。
米曲霉菌株TN-37在20℃-30℃之间处理酱油渣后，经检测，没有检测到黄曲霉等真菌毒素。
虽然米曲霉菌株TN-37可以去除酱油渣的异味，但是处理后有轻微的霉菌味。为了改善酱油渣生物处理后的适口性，并增加植酸酶的活力，我们在浓度为2×106CFU/mL的TN-37中加入2×106CFU/mL的Y9和2×106CFU/mL的Y115，在浓度8×105CFU/mL的TN-37中加入8×105CFU/mL的Y9和8×105CFU/mL的Y115，在浓度4×105CFU/mL的TN-37中加入4×105CFU/的Y9和4×105CFU/的Y115，再在20℃-30℃之间处理酱油渣。
结果发现，处理24h后，酱油渣的异味可以降低到1级，但带有了一定的香味，闻不到米曲霉菌株TN-37的菌味。处理48h后，酱油渣没有异味，但可以明显闻到一定的香味，闻不到米曲霉菌株TN-37的菌味。
2、酱油渣生物处理后酶活性的检测：
测试样品编号与特征见表3。
分别取各测试样品5g，加入50mL的蒸馏水，再加入灭菌的玻璃珠少许，在摇床上180rpm震荡0.5h，然后加入到50毫升的离心管中，10000rpm离心10min，取上清液作为各个样品的胞外酶粗提液，分别检测各个样品的蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、植酸酶的活性。
表3测定酶活的样品产生方式
样品编号 产生方式
1 编号2的样品按15％的接种量处理酱油渣24小时
2 TN-37菌株按2×10<sup>6</sup>CFU/mL孢子浓度处理酱油渣24小时
3 TN-37、Y9、Y155各按2×10<sup>6</sup>CFU/mL孢子浓度混合接种处理酱油渣24小时
4 编号3的样品按15％的接种量处理酱油渣24小时
5 TN-37菌株按4×10<sup>5</sup>CFU/mL孢子浓度处理酱油渣24小时
6 编号5的样品按15％的接种量处理酱油渣24小时
7 TN-37、Y9、Y155各按4×10<sup>5</sup>CFU/mL孢子浓度混合接种处理酱油渣24小时
8 编号7的样品按15％的接种量处理酱油渣24小时
9 编号10的样品按15％的接种量处理酱油渣24小时
10 Y9按2×10<sup>6</sup>CFU/mL孢子浓度混合接种处理酱油渣24小时
11 Y155按2×10<sup>6</sup>CFU/mL孢子浓度混合接种处理酱油渣24小时
12 编号11的样品按15％的接种量处理酱油渣24小时
13 酱油渣(作为对照)
14 TN-37菌株按8×10<sup>5</sup>CFU/mL孢子浓度处理酱油渣24小时
(1)蛋白酶的检测：
蛋白酶的测定：取1g琼脂糖，5gNaCl在100mL的50mM Tris-HCI(PH＝7.8)缓冲液中充分融化后，冷却到45℃，加入1g脱脂奶粉，充分溶解后倒入13×13cm的方形塑料培养皿中，冷却凝固后，用4mm直径的打孔器在平板上打孔。将酶粗提液40μL加到小孔中，25℃培养10h，观察透明圈的大小，结果如图7所示。
从图7中可以看出，TN-37、Y155在处理酱油渣过程中都可以产生高活性的蛋白酶，而Y9产生蛋白酶的能力比较差。TN-37、Y9、Y155各按4×105CFU/mL孢子浓度混合接种处理酱油渣产生了良好的蛋白酶活性。蛋白酶活性高，如果添加到饲料中，有助于提高饲料的利用率。
(2)纤维素酶的检测：
纤维素酶的检测方法：在100mL的50mM Tris-HCI(PH＝7.8)缓冲液中加入羧甲基纤维素钠(CMC)1g，1g琼脂糖，加热充分融化后，冷却到60℃，加入0.1％的刚果红，充分溶解后倒入13×13cm的方形塑料培养皿中，冷却凝固后，用4mm直径的打孔器在平板上打孔。将酶粗提液40μL加到小孔中，25℃培养10h，观察透明圈的大小，结果如图8所示。
从图8中可以看出，出厂的酱油渣没有纤维素酶的活性，而本研究中的各个菌株和菌株组合，都产生了较高的纤维素酶活性，纤维素酶活性高，可以将饲料中的大量纤维素降解成可以被动物有效利用的小分子糖类，因此，用本研究得到的菌株处理酱油渣添加到饲料中，可以有效提高饲料的利用率。
(3)淀粉酶的检测：
淀粉酶活性检测方法：在100mL的50mM Tris-HCI(PH＝7.8)缓冲液中加入可溶性淀粉2g，1g琼脂糖，加热充分融化后，冷却到50℃，加入碘-碘化钾溶液1mL，充分溶解后倒入13×13cm的方形塑料培养皿中，冷却凝固后，用4mm直径的打孔器在平板上打孔。将酶粗提液40μL加到小孔中，25℃培养10h，观察透明圈的大小，结果如图9所示。
从图9中可以看出，本研究中的各个菌株和菌株组合，都产生了较高的淀粉酶活性。而出厂的酱油渣中也有较高的淀粉酶活性。由于饲料中往往也含有大量的淀粉，用本研究得到的菌株处理酱油渣后添加到饲料中，将有效提高饲料的利用率。
(4)植酸酶的检测：
植酸酶检测方法：取40μL 3mM植酸钠溶液(用pH为5.5的0.2M醋酸钠/盐酸溶液配制而成)于1.5mL离心管中，然后加入10μL的酶粗提液，其中一支1.5mL离心管中加入10μL双蒸水作为空白对照。将离心管置于30℃水浴锅中孵化，水浴10min、20min、30min后将离心管取出混匀，最后一次取出后立即加入50μL 10％TCA并混匀。取200μL钼酸盐溶液(1体积10mM钼酸铵、1体积2.5M硫酸和2体积丙酮配制而成)加至酶标板中，而后取25μL上述溶液加至酶标板中，与钼酸盐溶液混合。室温下静置15min。每个样品做3次重复，并对酶标板上样品的添加情况做好相应记录。将酶标板置于酶标仪中，设置波长为355nm进行OD值的测量，测量前连续摇晃10s。以OD值的大小代表植酸酶活性的高低，结果如图10所示。
从图10中可以看出，各个检测样品中都检测到了植酸酶的活性，出厂酱油渣中也有少量的植酸酶。但是本研究筛选得到的三个菌株处理酱油渣后，产物中植酸酶的活性都有显著提高，其中Y155的活性最高。三个菌株组合后，处理酱油渣中的植酸酶活性比单独菌株处理后的还要好。植酸酶是一种水解酶，能降解饲料中的抗营养因子植酸并释放出无机磷及与植酸结合的蛋白质、微量元素等，特别是提高了饲料中植酸磷的利用率，减少磷的排放量，降低环境中磷的污染，并能消除植酸的抗营养作用，提高饲料各种营养组分的消化利用率。因此，用本研究得到的菌株处理酱油渣后添加到饲料中，将提高饲料中的植酸酶含量，提高饲料的利用率。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东巧媳妇食品集团有限公司
<120> 一种耐盐米曲霉及其应用
<130> 2020.4.27
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 541
<212> DNA
<213> Aspergillus oryzae
<400> 1
ctagcgagcc caacctccca cccgtgttta ctgtacctta gttgcttcgg cgggcccgcc 60
attcatggcc gccgggggct ctcagccccg ggcccgcgcc cgccggagac accacgaact 120
ctgtctgatc tagtgaagtc tgagttgatt gtatcgcaat cagttaaaac tttcaacaat 180
ggatctcttg gttccggcat cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataact agtgtgaatt 240
gcagaattcc gtgaatcatc gagtctttga acgcacattg cgccccctgg tattccgggg 300
ggcatgcctg tccgagcgtc attgctgccc atcaagcacg gcttgtgtgt tgggtcgtcg 360
tcccctctcc gggggggacg ggccccaaag gcagcggcgg caccgcgtcc gatcctcgag 420
cgtatggggc tttgtcaccc gctctgtagg cccggccggc gcttgccgaa cgcaaatcaa 480
tctttttcca ggttgacctc ggatcaggta gggatacccg ctgaacttaa gcatatcaat 540
a 541
<210> 2
<211> 493
<212> DNA
<213> Aspergillus oryzae
<400> 2
atgtctcaat gccttcgagt tagtatgctt tggaccaagg aactcctcaa aagcatgatc 60
tcggatgtgt cctgttatat ctgccacatg tttgctaaca actttgcagg caaaccatct 120
ctggcgagca cggccttgac ggctccggtg tgtaagtaca gcctgtatac acctcgaacg 180
aacgacgacc atatggcatt agaagttgga atggatctga cggcaaggat agttacaatg 240
gctcctccga tctccagctg gagcgtatga acgtctactt caacgaggtg cgtacctcaa 300
aatttcagca tctatgaaaa cgctttgcaa ctcctgaccg cttctccagg ccagcggaaa 360
caagtatgtc cctcgtgccg tcctcgttga tcttgagcct ggtaccatgg acgccgtccg 420
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<212> DNA
<213> Aspergillus oryzae
<400> 3
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attctccctt caaatgcgac caatatgttt tagccgccat aattttatcc agtttctgtt 180
cgatcggctg aagtcttggc attgatgaat tgacttgata tgcaggccag atcaccacca 240
aggagttggg cactgtcatg cgctctctgg gccaaaaccc ctctgagtcg gaactccagg 300
acatgattaa cgaggttgac gccgacaaca atggcaccat tgacttccct ggtacgagac 360
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gatggcgaga aagatgaagg ataccgactc tgaggaggag atccgggagg ctttcaaggt 480
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catcgga 547
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<211> 1048
<212> DNA
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<400> 4
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gactcctgaa ggtcaggcct gtggtctggt caagaacttg gccctcatgt gttatgtcac 420
tgttggtaca cccagcgaac ctatcattga cttcatgatt cagcgtaaca tggaagttct 480
tgaggagttt gagcctcagg tcactcccaa cgcaacgaag gtcttcgtca atggagtgtg 540
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aaatatgatc tcccacgagg tcagtttgat tcgtgatatc cgtgagcggg agttcaagat 660
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<213> Debaryomyces hansenii
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attaaattca aaaaatcttc aaaactttca acaacggatc tcttggttct cgcatcgatg 240
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tttgaacgca cattgcgccc tctggtattc cagagggcat gcctgtttga gcgtcatttc 360
tctctcaaac cttcgggttt ggtattgagt gatactctta gtcgaactag gcgtttgctt 420
gaaatgtatt ggcatgagtg gtactggata gtgctatatg actttcaatg tattaggttt 480
atccaactcg ttgaatagtt taatggtata tttctcggta ttctaggctc ggccttacaa 540
tataacaaac aagtttgacc tcaaatcagg taggattacc cgctgaactt aagcatatca 600
tagccgggaa agaagctggg gtcacaggga ccctaaatga ccaagaacac agcctctcgt 660
gttcttttag ggaatcctaa agacaaagag gggagagcgg tgagtttttt tgccacgg 718
<210> 6
<211> 399
<212> DNA
<213> Kodamaea ohmeri
<400> 6
gtgacctgcg gaagtatcat taacattaat ttactacaca ctgttttttt acaacaaaac 60
aaatctatct aaaaacaatt ctttacaaga aattcttaaa actttcaaca acggatctct 120
tggttctcgc atcgatgaag aacgcagcga aatgcgatac gtaatacgaa tcgcagctct 180
cggaatcatc gaatctttga acgcacattg caccattggg tattcccaat ggtatgcttg 240
tttgagcgaa tacttcccta atcctcacgg attgtattgt gtttgcacga aaataatgac 300
gacagtactc tacaaaacgg taccgtcagt acactcattt tttttcctca aatcaagtag 360
gactactcgc tgaacttaag catatcaaaa gcggaggaa 399

Claims (7)

1.一种耐盐米曲霉，其特征在于：该菌株的保藏名称为米曲霉TN-37，保藏编号为CCTCCNO：M20191067。
2.根据权利要求1所述的耐盐米曲霉，其特征在于：该菌株的ITS序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID No.6所示。
3.一种权利要求1所述的耐盐米曲霉的应用，其特征在于：米曲霉TN-37单独应用于酱油渣的生物处理。
4.一种权利要求1所述的耐盐米曲霉的应用，其特征在于：米曲霉TN-37与德巴利汉逊酵母、海洋酵母混合应用于酱油渣的生物处理。
5.根据权利要求3或4所述的耐盐米曲霉的应用，其特征在于：酱油渣的盐含量为10-25wt％。
6.根据权利要求3所述的耐盐米曲霉的应用，其特征在于：在对酱油渣进行生物处理时，米曲霉TN-37接种量为4×105-2×106CFU/mL，处理温度为20-30℃。
7.根据权利要求4所述的耐盐米曲霉的应用，其特征在于：在对酱油渣进行生物处理时，米曲霉TN-37、德巴利汉逊酵母、海洋酵母的接种量相同，均为4×105-2×106CFU/mL，处理温度为20-30℃。
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CN115851533B (zh) * 2022-12-05 2023-06-27 众乐(潍坊)生物科技有限公司 一种苏云金杆菌及其在抑制畜禽饲料霉菌中的应用

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