CN111529514A - 一种特丁基对苯二酚的应用及治疗椎间盘退变的药物 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于医药技术领域，提供了一种特丁基对苯二酚的应用及治疗椎间盘退变的药物，该治疗椎间盘退变的药物包括药物载体和特丁基对苯二酚。其中，特丁基对苯二酚是一种安全高效食用油脂抗氧化剂，具有良好的抗氧化作用。相比其他药物，特丁基对苯二酚作为一种食品添加成分可以更加温和地缓解椎间盘退变。本发明通过应用叔丁基过氧化氢诱导氧化应激构建椎间盘退变模型，通过观察氧化应激，细胞凋亡和椎间盘退变的各项指标来评估特丁基对苯二酚对于椎间盘退变的治疗作用，可以为椎间盘退变疾病的综合治疗提供一种替代治疗药物。

Description

一种特丁基对苯二酚的应用及治疗椎间盘退变的药物
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种特丁基对苯二酚的应用及治疗椎间盘退变的药物。
背景技术
椎间盘(Intervertebral Disc，IVD)退变是由于免疫学、分子生物学及生物力学等多种因素导致的脊柱退行性疾病。随着老龄化社会的到来,椎间盘退行性疾病的患病率越来愈高。患者后期可出现严重的脊髓和神经病变，严重影响患者的生命质量及造成巨大社会负担。临床上尚无确实有效的针对椎间盘退变的治疗药物。
椎间盘退变的病因多样，如异常的生物学应力，炎症反应，自然衰老，营养缺乏，异常增高的氧化应激反应。其中，氧化应激是目前公认的主要致病机制之一，过度的氧化应激引起细胞凋亡，造成髓核组织丢失，加速椎间盘退变。
另外，特丁基对苯二酚(Tert-butylhydroquinone，t-BHQ)是一种最常见的食用油脂类食物的酚类抗氧化剂，也是一种常见的Nrf2激动剂。作为一种FDA及我国批准使用的抗氧化剂，安全性好，抗氧化性高。但是，目前尚未报道有可以利用特丁基对苯二酚来有效治疗或延缓椎间盘退行性病变。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种特丁基对苯二酚在制备用于治疗椎间盘退变的药物中的应用，旨在解决背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种特丁基对苯二酚在制备用于治疗椎间盘退变的药物中的应用。
其中，特丁基对苯二酚的结构式如下：
Figure BDA0002553394810000021
本发明实施例的另一目的在于提供一种治疗椎间盘退变的药物，其包括药物载体以及特丁基对苯二酚。
作为本发明实施例的一个优选方案，所述药物载体为微乳或纳米脂质体。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述药物载体为微乳；所述药物中特丁基对苯二酚的含量为0.2～0.3g/g。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述微乳为油酸乙酯微乳。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述药物载体为纳米脂质体；所述药物中特丁基对苯二酚的含量为4～6mg/kg。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述药物的剂型为片剂、乳剂和胶囊中的一种。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述药物还包括促进细胞自噬药剂和/或抑制炎症药剂。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述促进细胞自噬药剂包括雷帕霉素、二甲双胍和褪黑素中的至少一种。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述抑制炎症药剂包括厚朴酚和/或雷公藤红素。
此外，特丁基对苯二酚也可与利用现代生物医学技术生产的生物材料或局部缓释制剂形成其他类型的复合制剂，并不限于此。
本发明实施例提供的一种治疗椎间盘退变的药物包括药物载体和特丁基对苯二酚。其中，特丁基对苯二酚是一种安全高效食用油脂抗氧化剂，具有良好的抗氧化作用。相比其他药物，特丁基对苯二酚作为一种食品添加成分可以更加温和地缓解椎间盘退变。本发明通过应用叔丁基过氧化氢诱导氧化应激构建椎间盘退变模型，通过观察氧化应激，细胞凋亡和椎间盘退变的各项指标来评估特丁基对苯二酚对于椎间盘退变的治疗作用，可以为椎间盘退变疾病的综合治疗提供一种替代治疗药物。
附图说明
图1～2为不同浓度特丁基对苯二酚对髓核细胞的细胞活性的影响实验结果图。
图3～11为特丁基对苯二酚对由TBHP诱导的髓核细胞氧化应激状态和凋亡的抑制实验结果图。
图12～19为特丁基对苯二酚激活髓核细胞转录因子NRF2进入细胞核的实验结果图。
图20～28为特丁基对苯二酚通过激活髓核细胞自噬的实验结果图。
图29～33为特丁基对苯二酚改善大鼠体内的椎间盘退变的实验结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
该实施例提供了一种治疗椎间盘退变的药物，该药物可用于治疗或延缓椎间盘退行性病变。具体的，该药物包括药物载体和特丁基对苯二酚；其中，药物载体为市售的油酸乙酯微乳，每g药物中含有0.2g的特丁基对苯二酚。需要说明的是，该药物的制备方法不属于本发明的改进点，其可以现有常见的制药工艺进行制备，在此就不作赘述。
实施例2
该实施例提供了一种治疗椎间盘退变的药物，该药物可用于治疗或延缓椎间盘退行性病变。具体的，该药物包括药物载体和特丁基对苯二酚；其中，药物载体为市售的油酸乙酯微乳，每g药物中含有0.3g的特丁基对苯二酚。需要说明的是，该药物的制备方法不属于本发明的改进点，其可以现有常见的制药工艺进行制备，在此就不作赘述。
实施例3
该实施例提供了一种治疗椎间盘退变的药物，该药物可用于治疗或延缓椎间盘退行性病变。具体的，该药物包括药物载体和特丁基对苯二酚；其中，药物载体为市售的油酸乙酯微乳，每g药物中含有0.251g的特丁基对苯二酚。需要说明的是，该药物的制备方法不属于本发明的改进点，其可以现有常见的制药工艺进行制备，在此就不作赘述。
实施例4
该实施例提供了一种治疗椎间盘退变的药物，该药物可用于治疗或延缓椎间盘退行性病变。具体的，该药物包括药物载体和特丁基对苯二酚；其中，药物载体为市售常见的纳米脂质体，每kg药物中含有4mg的特丁基对苯二酚。需要说明的是，该药物的制备方法不属于本发明的改进点，其可以现有常见的制药工艺进行制备，在此就不作赘述。
实施例5
该实施例提供了一种治疗椎间盘退变的药物，该药物可用于治疗或延缓椎间盘退行性病变。具体的，该药物包括药物载体和特丁基对苯二酚；其中，药物载体为市售常见的纳米脂质体，每kg药物中含有6mg的特丁基对苯二酚。需要说明的是，该药物的制备方法不属于本发明的改进点，其可以现有常见的制药工艺进行制备，在此就不作赘述。
实施例6
该实施例提供了一种治疗椎间盘退变的药物，该药物可用于治疗或延缓椎间盘退行性病变。具体的，该药物包括药物载体和特丁基对苯二酚；其中，药物载体为市售常见的纳米脂质体，每kg药物中含有5mg的特丁基对苯二酚。需要说明的是，该药物的制备方法不属于本发明的改进点，其可以现有常见的制药工艺进行制备，在此就不作赘述。
实施例7
该实施例提供了一种治疗椎间盘退变的药物，该药物可用于治疗或延缓椎间盘退行性病变。具体的，该药物的剂型为片剂，其包括药物载体、特丁基对苯二酚和促进细胞自噬药剂；其中，促进细胞自噬药剂为雷帕霉素；药物载体为市售常见的片剂的载体；特丁基对苯二酚和促进细胞自噬药剂的占比可以根据实际需求进行设计。需要说明的是，该药物的制备方法不属于本发明的改进点，其可以现有常见的制药工艺进行制备，在此就不作赘述。
实施例8
该实施例提供了一种治疗椎间盘退变的药物，该药物可用于治疗或延缓椎间盘退行性病变。具体的，该药物的剂型为乳剂，其包括药物载体、特丁基对苯二酚、促进细胞自噬药剂和抑制炎症药剂；其中，促进细胞自噬药剂为二甲双胍和褪黑素的混合物；抑制炎症药剂为厚朴酚和雷公藤红素的混合物；药物载体为市售常见的乳剂的载体；特丁基对苯二酚、促进细胞自噬药剂和抑制炎症药剂的占比可以根据实际需求进行设计。需要说明的是，该药物的制备方法不属于本发明的改进点，其可以现有常见的制药工艺进行制备，在此就不作赘述。
实施例9
该实施例提供了一种治疗椎间盘退变的药物，该药物可用于治疗或延缓椎间盘退行性病变。具体的，该药物的剂型为胶囊，其包括药物载体、特丁基对苯二酚和抑制炎症药剂；其中，抑制炎症药剂为厚朴酚；药物载体为市售常见的胶囊的载体；特丁基对苯二酚和抑制炎症药剂的占比可以根据实际需求进行设计。需要说明的是，该药物的制备方法不属于本发明的改进点，其可以现有常见的制药工艺进行制备，在此就不作赘述。
实施例10
该实施例提供了一种治疗椎间盘退变的药物，该药物可用于治疗或延缓椎间盘退行性病变。具体的，该药物的剂型为乳剂，其包括药物载体、特丁基对苯二酚、促进细胞自噬药剂和抑制炎症药剂；其中，促进细胞自噬药剂为雷帕霉素、二甲双胍和褪黑素的混合物；抑制炎症药剂为雷公藤红素；药物载体为市售常见的乳剂的载体；特丁基对苯二酚、促进细胞自噬药剂和抑制炎症药剂的占比可以根据实际需求进行设计。需要说明的是，该药物的制备方法不属于本发明的改进点，其可以现有常见的制药工艺进行制备，在此就不作赘述。
实验例：
一.实验方法
1、髓核细胞提取及培养
从20只雄性Sprague-Dawley大鼠(4周龄)中分离出髓核组织。将NP组织全部切成小块，用0.1％胶原酶II在37℃培养箱中孵育4h。等待消化结束，将消化的组织转移至含有10％胎牛血清的培养基中培养。等到细胞汇合率达到百分之80后，用0.25％胰蛋白酶收集细胞，以合适的细胞密度传入培养皿中，将二代细胞用以后续实验。
2、药物处理
将TBHP(50μM)处理6小时用以诱导髓核细胞凋亡及氧化应激细胞模型。为研究特丁基对苯二酚，在TBHP处理之前，用20μM特丁基对苯二酚预处理髓核细胞24小时后再建立细胞模型。
3、细胞活力测定
采用细胞计数kit-8(CCK-8)法测定t-BHQ对NPCs的细胞毒性(Dojindo Co.，Kumamoto,Japan)。根据操作手册，将髓核细胞接种到96孔板上(每孔5个*105细胞)，并根据实验设计使用不同浓度的t-BHQ进行处理。随后，细胞用PBS洗净，向每个空加入CCK-8测试液，在37℃培养箱中培养1.5小时。使用微平板阅读器(美国Thermo Scientific公司)在450nm处测量每个孔的吸光度。
4、蛋白印迹分析
用含1mm PMSF(苯甲磺酰氟，Beyotime)RIPA裂解髓核细胞分离蛋白。然后，使用BCA蛋白检测试剂盒(Beyotime)检测样品的蛋白浓度。在8％～12％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分离出等量的蛋白质，转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore，美国)上，然后用5％脱脂牛奶在TBST(含0.1％吐温-20的tris缓冲盐水)中室温封闭90分钟。之后，在4℃条件下与一抗孵育过夜。第二天，用TBST冲洗条带并与相应的二抗孵育。最后，使用Image Lab 3.0软件(Bio-Rad)对结果进行量化。
5、免疫荧光
按照实验设计处理后，用PBS洗涤髓核细胞，使用4％多聚甲醛固定15分钟，0.1％Triton X-100渗透3分钟。接下来，用5％牛血清白蛋白在37℃的条件下封闭细胞1h，并与一抗在4℃条件下于湿盒中过夜。次日，洗涤髓核细胞,在37℃的温度下与Alexa Fluor 488或Alexa Fluo 594偶联二抗孵育1h，DAPI标记5min。用尼康ECLIPSE Ti显微镜(日本尼康，东京)观察载玻片。
6、TUNEL法检测细胞凋亡
采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)dUTP刻痕末端标记(TUNEL)法(Roche,CA)检测细胞凋亡情况。4％多聚甲醛固定0.5h后，3％H2O2孵育10分钟，0.1％Triton X-100孵育15分钟。PBS洗涤细胞3次，根据产品说明书，用TUNEL检测液和4’，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)共染色。最后，在尼康共聚焦Ti显微镜(日本东京尼康)下，随机选取每张切片的6个微观视野进行拍摄。
7、试剂盒检测氧化应激水平
将髓核细胞处理并用PBS洗涤3次后，按照活性氧(ROS)检测试剂盒的说明书，用活性氧(ROS)检测混合液孵育细胞。最后，用尼康ECLIPSE Ti显微镜(日本东京尼康)观察并获得图像。丙二醛含量测定使用市售的丙二醛检测试剂盒，使用Mn-SOD检测试剂盒，根据制造商的说明测定SOD2酶活性。
8、动物手术过程
给大鼠腹腔注射2％戊巴比妥，通过触摸及X线机确定大鼠尾部的实验节段。使用穿刺针穿过尾部皮肤的整个纤维环层，穿刺深度为5mm。穿刺后顺时针旋转360°后逆时针旋转360°，保持1分钟。在手术过后，给予大鼠腹腔注射特丁基对苯二酚，对大鼠生命状态作日常的检测，保证充足的食物和水。
9、X线成像
穿刺损伤8周后，所有动物均拍X线片。所有大鼠均采用10％戊巴比妥(40mg/kg)腹腔注射麻醉。采用x射线照射系统(Kubtec)将大鼠固定于俯卧位进行x射线成像。穿刺IVDs的DHI变化以％DHI表示(％DHI＝穿刺后DHI/穿刺前DHI×100％)。
10、组织病理学分析
大鼠于穿刺损伤8周后给予过量戊巴比妥处死。收集椎间盘损伤节段的实验部位进行进一步研究。组织用4％多聚甲醛固定，用10％乙二胺四乙酸溶液脱钙，包埋石蜡进行连续切片。各组椎间盘载片经苏木素、伊红(H&E)和萨夫拉宁O-fast green(S-O)染色，观察显微镜下NP和AF细胞结构及形态的变化。切片结果由经验丰富的组织学研究人员以盲法检验。根据NP和AF特征的组织学改变来评估组织学评分。
11、免疫组织化学分析
脱蜡后，每个组织用3％H2O2孵育10min。用0.1％胰蛋白酶37℃孵育20min，PBS洗涤。用1％山羊血清白蛋白在37℃封闭切片1小时，不加PBS冲洗。然后在4℃下孵育一抗(1:2000)。次日PBS洗涤2次，hrp标记的二抗室温孵育1h。在显微镜下观察每个标本的染色情况。用Image J软件2.1(Bethesda,MD，USA)定量分析各切片阳性细胞率。
12、统计分析
结果以均数±标准差表示。原始统计分析采用GraphPad Prism 6(美国)进行处理。数据分析采用单因素方差分析(ANOVA)，然后采用Tukey’s检验进行组间比较。
二、实验过程及结论
1、按照上述实验方法测定24小时不同浓度特丁基对苯二酚(t-BHQ)处理后的髓核细胞的细胞活性，其结果如附图1所示，发现细胞活性没有明显的下降。随后，测定在6小时50μM浓度的TBHP处理下的髓核细胞的细胞活性，其结果如附图2所示，随着特丁基对苯二酚浓度的上升，细胞活性也随之升高。综上，特丁基对苯二酚促进髓核细胞活性并且抑制由TBHP诱导的髓核细胞氧化应激状态和凋亡；另外，高浓度特丁基对苯二酚对髓核细胞并无细胞毒性并且能治疗由叔丁基过氧化氢导致的细胞活力的下降。
2、如附图2～11所示，在使用TBHP处理后，凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase3的上升和Bcl-2的下降反应凋亡现象的发生。氧自由基染色、丙二醛和超氧化物歧化酶-2的测定也提示氧化应激现象的发生。而特丁基对苯二酚的使用，降低了Bax和Cleaved-caspase3和上升了Bcl-2，降低氧自由基染色荧光强度和MDA含量，提高了超氧化物歧化酶-2的含量，这间接提示特丁基对苯二酚的抗凋亡和抗氧化应激的效应。综上所述，特丁基对苯二酚促进髓核细胞活性并且抑制由TBHP诱导的髓核细胞氧化应激状态和凋亡。
3、特丁基对苯二酚是一种传统的Nrf2激动剂。在髓核细胞中，发现了特丁基对苯二酚能促进Nrf2进入细胞核。为了探究特丁基对苯二酚抗细胞凋亡及氧化应激的机制，建立了小干扰RNA来降低细胞中NRF2的含量。如附图12～19所示，由实验结果显示，发现小干扰RNA的使用一定程度上抑制了特丁基对苯二酚的治疗效果，这提示在髓核细胞中，特丁基对苯二酚也是通过激活Nrf2来起到抗凋亡抗氧化应激的作用。综上所述，特丁基对苯二酚通过激活髓核细胞转录因子NRF2进入细胞核，可以发挥抗凋亡及氧化应激的作用。
4、在TBHP和特丁基对苯二酚的处理下，发现自噬相关的经典指标，LC3-II上升和P62的下降。如附图20～28所示，通过蛋白免疫印迹及TUNEL染色的结果，发现在特丁基对苯二酚的保护效果中，自噬占据着重要作用。氯喹的使用一定程度上抑制了特丁基对苯二酚的抗凋亡作用。另外，通过经典自噬抑制剂巴弗洛霉素的使用，发现特丁基对苯二酚能恢复被TBHP阻断的自噬流。综上所述，特丁基对苯二酚通过激活髓核细胞自噬可以起到抑制髓核细胞凋亡的作用。
5、通过X线来评价大鼠椎间盘退变的情况。如附图29～33所示，从穿刺后8周的X线图像中，发现特丁基对苯二酚处理组的椎间盘高度比椎间盘退变组中的更高，同样特丁基对苯二酚处理组有着更高的组织学评分。在高倍镜的组织学观察下，苏木精-伊红(HE)染色显示髓核组织在8周时完全消失；而在特丁基对苯二酚治疗组中，仍可见髓核组织结果清晰。番红(safrannin O)染色显示特丁基对苯二酚处理组不仅纤维环结构保持良好且髓核组织细胞外基质含量也保持在较高水平。同样，也在动物体内验证特丁基对苯二酚的抗凋亡能力，通过免疫组织化学染色的结果，发现椎间盘退变组的cleaved-caspase3的染色阳性点百分比远大于假手术组，而特丁基对苯二酚处理后大大降低了髓核组织中cleaved-caspase3的含量。综上所述，特丁基对苯二酚可以改善大鼠体内的椎间盘退变并且抑制髓核细胞凋亡。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种特丁基对苯二酚在制备用于治疗椎间盘退变的药物中的应用。
2.一种治疗椎间盘退变的药物，包括药物载体，其特征在于，还包括特丁基对苯二酚。
3.根据权利要求2所述的一种治疗椎间盘退变的药物，其特征在于，所述药物载体为微乳或纳米脂质体。
4.根据权利要求3所述的一种治疗椎间盘退变的药物，其特征在于，所述药物载体为微乳；所述药物中特丁基对苯二酚的含量为0.2~0.3g/g。
5.根据权利要求4所述的一种治疗椎间盘退变的药物，其特征在于，所述微乳为油酸乙酯微乳。
6.根据权利要求3所述的一种治疗椎间盘退变的药物，其特征在于，所述药物载体为纳米脂质体；所述药物中特丁基对苯二酚的含量为4~6mg/kg。
7.根据权利要求2所述的一种治疗椎间盘退变的药物，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、乳剂和胶囊中的一种。
8.根据权利要求2~7中任一项所述的一种治疗椎间盘退变的药物，其特征在于，所述药物还包括促进细胞自噬药剂和/或抑制炎症药剂。
9.根据权利要求8所述的一种治疗椎间盘退变的药物，其特征在于，所述促进细胞自噬药剂包括雷帕霉素、二甲双胍和褪黑素中的至少一种。
10.根据权利要求8所述的一种治疗椎间盘退变的药物，其特征在于，所述抑制炎症药剂包括厚朴酚和/或雷公藤红素。
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