CN111494233B - 一种胶原短肽脂质体的制备方法及应用 - Google Patents

一种胶原短肽脂质体的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种胶原短肽脂质体的制备方法及应用，通过特定的水解工艺将明胶水解获得具有7‑17氨基酸的胶原短肽，利用脂质体将胶原短肽包覆获得短肽脂质体，从而使这些胶原短肽更容易被细胞吸收，配合精华液中的其他营养组分，本发明的具有抗衰老效果的精华液能够有效促进细胞合成I型胶原蛋白，延缓细胞衰老，具有良好的应用前景。

Description

一种胶原短肽脂质体的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及日化产品技术领域，尤其涉及一种胶原短肽脂质体的制备方法及应用。
背景技术
胶原蛋白是一类蛋白质家族，已至少发现了30余种胶原蛋白链的编码基因，可以形成16种以上的胶原蛋白。根据它们在体内的分布和功能特点，可以将胶原分成间质胶原、基底膜胶原和细胞外周胶原。间质型胶原蛋白分子占整个机体胶原的绝大部分，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白分子，Ⅰ型胶原蛋白主要分布于皮肤、肌腱等组织。
I型胶原蛋白分子长度约300nm，直径约1.5nm，呈棒状，由三条肽链彼此螺旋缠绕而成，其中二条是α1链，一条是α2链。I型胶原蛋白和弹性蛋白是人真皮组织中维持细胞丰满的重要骨架蛋白质，随着年龄的增长，人体自身I型胶原蛋白的合成速度小于分解速度，I型胶原蛋白的含量就会越来越少，这也就导致了皮肤的塌陷和皱纹产生。然而I型胶原蛋白由1366个氨基酸组成，其分子量高达近300000道尔顿，人体皮肤细胞难以吸收，但是胶原蛋白的组成物质胶原短肽具有相对较小的分子量，相比胶原蛋白而言更容易被人体吸收，其作为胶原蛋白合成过程中所需要的小分子物质，被人体吸收后能够促进人体合成胶原蛋白，从而间接地达到补充胶原蛋白的目的。
现有手段大多采用胶原多肽用于常规护肤品中，例如直接用于面膜液中，或者直接用于精华液中，通过涂覆在皮肤表面，胶原多肽自行渗透进入皮肤，该方式虽然可以为皮肤细胞提供胶原蛋白的组成物质，但是由于胶原多肽的肽链长度不一，较长的肽链仍然不能被皮肤很好地吸收，这就导致了这些护肤品的抗衰老和修复效果仍然较差。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种能够更容易被皮肤吸收利用，同时效果更好的胶原短肽脂质体。
本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种胶原短肽脂质体的制备方法，包括：
步骤一、配置10%质量浓度的明胶溶液，升温至60-70℃，保温搅拌20-30min，调节溶液pH值为9.0-10.0，加入胰酶，保温搅拌反应4-6h，得到碱性水解液；
步骤二、将步骤一所得碱性水解液煮沸处理5-10min，降温至50-60℃，调节溶液pH值为6.5-7.5，加入无花果蛋白酶，保温搅拌反应3-4h，得到中性水解液；
步骤三、将步骤二所得中性水解液煮沸处理5-10min，降温至50-60℃，调节溶液pH值为3.0-4.0，加入酸性蛋白酶，保温搅拌4-6h，得到酸性水解液；
步骤四、将步骤三所得酸性水解液煮沸处理5-10min，降温至常温，调节pH值为6.5-7.5，得到胶原短肽溶液；
步骤五、将大豆磷脂与环己烷混合搅拌均匀得到油相溶液，将油相溶液与步骤四所得胶原短肽溶液混合搅拌，3000r/min搅拌2-3h，得到乳浊液，升温至75-80℃，保温搅拌，直至无液体蒸出，得到胶原短肽脂质体。
采用上述制备方法能够获得长度分布比较集中的胶原短肽，胶原短肽含有氨基酸的数量为7-17个，相比更长的胶原多肽而言，该长度范围的胶原短肽更容易被细胞所吸收和利用；相比更短的胶原短肽，该长度范围的胶原短肽则能够使I型胶原蛋白的合成更快，生化反应底物的利用率也更高。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述胰酶、无花果蛋白酶以及酸性蛋白酶与明胶的质量比均为（0.2-2.0）:100。
在以上技术方案的基础上，优选的，步骤五中，所述大豆磷脂与环己烷的质量比为1：（1-5）。
更进一步优选的，步骤五中，所述油相溶液与胶原短肽溶液的体积比为1:（1-2）。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述步骤四还包括，调节pH值为6.5-7.5，加入维生素C和α-酮戊二酸，所述明胶：维生素C：α-酮戊二酸的质量比为1：（0.1-0.2）：（0.04-0.1）。
维生素C和α-酮戊二酸作为I型胶原蛋白合成中需要的辅助成分，可以与短肽相互配合，促进细胞合成I型胶原蛋白。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述步骤四还包括，调节pH值为6.5-7.5，加入葡萄糖和半乳糖，所述明胶：葡萄糖：半乳糖的质量比为1：（0.02-0.05）：（0.02-0.05）。
葡萄糖和半乳糖也是I型胶原蛋白合成过程中需要的修饰用辅助成分，经过糖基化修饰的I型胶原蛋白才具有生物活性。
本发明的胶原短肽脂质体相对于现有技术具有以下有益效果：
本发明的短肽混合物通过明胶采用特殊的水解工艺获得，该工艺能够制备得到长度更短，肽链长度分布更集中的短肽，主要为7-17个氨基酸长度的短肽链，这些短肽链更容易被细胞吸收；其次，为了保持胶原短肽的稳定性，并使其能够更容易被人体吸收，在精华液中加入了脂质体，脂质体将这些胶原短肽混合物包覆起来，能够更容易进入人体皮肤真皮层内，从而加快合成I型胶原蛋白；另外，精华液中还添加了糖类、维生素C等其他有效成分，它们与胶原短肽相互配合，促进I型胶原蛋白的合成和翻译后糖基化加工，从而保证合成后的I型胶原蛋白具有生物活性，最终达到皮肤修复，延缓皮肤衰老的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为人成纤维细胞采用不含有本发明胶原短肽脂质体的细胞培养液培养后的状态图；
图2为人成纤维细胞采用含1%本发明胶原短肽脂质体的细胞培养液培养后的状态图；
图3为人成纤维细胞在含有5%本发明胶原短肽溶液的培养液中分别培养10天和30天后，与在不含有本发明胶原短肽溶液的细胞培养液中培养10天和30天后的人成纤维细胞，采用实时荧光定量RT-PCR方法分析细胞内胶原蛋白mRNA的相对转录率的对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
实施例1
取100g鱼鳞明胶，倒入900g去离子水中，升温至60℃，保温搅拌20min，用1M氢氧化钠溶液调节溶液pH至9.0，加入0.2g胰酶，保温搅拌4h，得到碱性水解液，将碱性水解液煮沸处理5min，降温至60℃，滴加1M盐酸调节溶液pH至7.5，加入0.2g无花果蛋白酶，保温搅拌4h，得到中性水解液，将中性水解液煮沸处理5min，降温至60℃，滴加1M盐酸调节溶液pH至4.0，加入0.2g酸性蛋白酶，保温搅拌6h，得到酸性水解液，将酸性水解液煮沸处理10min，降温至室温，添加1M氢氧化钠溶液调节pH至7.5，得到胶原短肽溶液。
称取1kg大豆磷脂和1kg环己烷，混合机搅拌均匀得到油相溶液2kg，取1kg胶原短肽溶液和1kg油相溶液，在均质搅拌机中搅拌，保持3000r/min，搅拌2h，得到乳浊液，将体系升温至80℃，保温搅拌，直至无液体蒸出，得到胶原短肽脂质体。
实施例2
取100g鱼鳞明胶，倒入900g去离子水中，升温至65℃，保温搅拌30min，用1M氢氧化钠溶液调节溶液pH至10.0，加入2g胰酶，保温搅拌6h，得到碱性水解液，将碱性水解液煮沸处理10min，降温至50℃，滴加1M盐酸调节溶液pH至6.5，加入2g无花果蛋白酶，保温搅拌3h，得到中性水解液，将中性水解液煮沸处理10min，降温至50℃，滴加1M盐酸调节溶液pH至3.0，加入2g酸性蛋白酶，保温搅拌4h，得到酸性水解液，将酸性水解液煮沸处理5min，降温至室温，添加1M氢氧化钠溶液调节pH至6.5，加入10g维生素C和4gα-酮戊二酸，搅拌均匀得到胶原短肽溶液。
称取1kg大豆磷脂和5kg环己烷，混合机搅拌均匀得到油相溶液6kg，取1kg胶原短肽溶液和0.5kg油相溶液，在均质搅拌机中搅拌，保持3000r/min，搅拌3h，得到乳浊液，将体系升温至75℃，保温搅拌，直至无液体蒸出，得到胶原短肽脂质体。
实施例3
取100g鱼鳞明胶，倒入900g去离子水中，升温至70℃，保温搅拌25min，用1M氢氧化钠溶液调节溶液pH至9.5，加入0.8g胰酶，保温搅拌5h，得到碱性水解液，将碱性水解液煮沸处理6min，降温至55℃，滴加1M盐酸调节溶液pH至7.0，加入0.8g无花果蛋白酶，保温搅拌3.5h，得到中性水解液，将中性水解液煮沸处理6min，降温至55℃，滴加1M盐酸调节溶液pH至3.5，加入0.8g酸性蛋白酶，保温搅拌5h，得到酸性水解液，将酸性水解液煮沸处理6min，降温至室温，添加1M氢氧化钠溶液调节pH至7.0，加入20g维生素C、10gα-酮戊二酸、2g葡萄糖和2g半乳糖，搅拌均匀得到胶原短肽溶液。
称取1kg大豆磷脂和2kg环己烷，混合机搅拌均匀得到油相溶液3kg，取1kg胶原短肽溶液和0.8kg油相溶液，在均质搅拌机中搅拌，保持3000r/min，搅拌2.5h，得到乳浊液，将体系升温至76℃，保温搅拌，直至无液体蒸出，得到胶原短肽脂质体。
实施例4
取100g鱼鳞明胶，倒入900g去离子水中，升温至64℃，保温搅拌28min，用1M氢氧化钠溶液调节溶液pH至9.8，加入1.6g胰酶，保温搅拌4.5h，得到碱性水解液，将碱性水解液煮沸处理8min，降温至58℃，滴加1M盐酸调节溶液pH至7.2，加入1.6g无花果蛋白酶，保温搅拌3.5h，得到中性水解液，将中性水解液煮沸处理8min，降温至54℃，滴加1M盐酸调节溶液pH至3.5，加入1.6g酸性蛋白酶，保温搅拌4.5h，得到酸性水解液，将酸性水解液煮沸处理8min，降温至室温，添加1M氢氧化钠溶液调节pH至7.1，加入15g维生素C、8gα-酮戊二酸、5g葡萄糖和5g半乳糖，搅拌均匀得到胶原短肽溶液。
称取1kg大豆磷脂和3kg环己烷，混合机搅拌均匀得到油相溶液4kg，取1kg胶原短肽溶液和1kg油相溶液，在均质搅拌机中搅拌，保持3000r/min，搅拌2h，得到乳浊液，将体系升温至78℃，保温搅拌，直至无液体蒸出，得到胶原短肽脂质体。
将实施例1-4中所制备的胶原短肽溶液进行测序分析，所得检测结果显示，从左至右为N端至C端，其中主要包含以下几种短肽链：
Figure SMS_1
组成人类I型胶原蛋白前体的全部氨基酸序列具体如下，其中下划线部分为本发明所含胶原短肽的序列
（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/48762934）
CDS coded_by="NM_000089.4:138.4238"
/db_xref="CCDS:CCDS34682.1", /db_xref="GeneID:1278"
/db_xref="HGNC:HGNC:2198", /db_xref="MIM:120160"
ORIGIN
1 mlsfvdtrtl lllavtlcla tcqslqeetv rkgpagdrgp rgergppgpp grdgedgptg
61 ppgppgppgppglggnfaaqydgkgvglgp gpmglmgprg ppgaagapgp qgfqgpagep
121 gepgqtgpag argpagppgk agedghpgkp grpgergvvg pqgargfpgt pglpgfkgir
181 ghngldglkg qpgapgvkge pgapgengtp gqtgarglpgergrvgapgpagargsdgsv
241 gpvgpagpig sagppgfpga pgpkgeigav gnagpagpag prgevglpgl sgpvgppgnp
301 gangltgakg aaglpgvagapglpgprgipgpvgaagatg arglvgepgp agskgesgnk
361 gepgsagpqg ppgpsgeegk rgpngeagsa gppgppglrg spgsrglpga dgragvmgpp
421 gsrgasgpag vrgpngdagr pgepglmgpr glpgspgnig pagkegpvgl pgidgrpgpi
481 gpagargepg nigfpgpkgp tgdpgkngdk ghaglagarg apgpdgnnga qgppgpqgvq
541 ggkgeqgppg ppgfqglpgp sgpagevgkp gerglhgefglpgpagprgergppgesgaa
601 gptgpigsrgpsgppgpdgnkgepgvvgav gtagpsgpsg lpgergaagi pggkgekgep
661 glrgeignpg rdgargapga vgapgpagat gdrgeagaag pagpagprgs pgergevgpa
721 gpngfagpag aagqpgakge rgakgpkgen gvvgptgpvg aagpagpngp pgpagsrgdg
781 gppgmtgfpg aagrtgppgpsgisgppgppgpagkeglrg prgdqgpvgr tgevgavgpp
841 gfagekgpsg eagtagppgt pgpqgllgap gilglpgsrg erglpgvaga vgepgplgia
901 gppgargppg avgspgvnga pgeagrdgnpgndgppgrdgqpghkgergy pgnigpvgaa
961 gapgphgpvg pagkhgnrge tgpsgpvgpa gavgprgpsg pqgirgdkge pgekgprglp
1021 glkghnglqg lpgiaghhgd qgapgsvgpa gprgpagpsgpagkdgrtghpgtvgpagir
1081 gpqghqgpag ppgppgppgp pgvsgggydf gydgdfyrad qprsapslrpkdyevdatlk
1141 slnnqietlltpegsrknpartcrdlrlshpewssgyywi dpnqgctmda ikvycdfstg
1201 etciraqpen ipaknwyrss kdkkhvwlge tinagsqfey nvegvtskematqlafmrll
1261 anyasqnity hcknsiaymd eetgnlkkavilqgsndvelvaegnsrfty tvlvdgcskk
1321 tnewgktiie yktnkpsrlp fldiapldig gadqeffvdi gpvcfk
以上短肽链中，a为丙氨酸、c为半胱氨酸、r为精氨酸、d为天冬氨酸、q为谷氨酰胺、e为谷氨酸、h为组氨酸、i为异亮氨酸、g为甘氨酸、n为天冬酰胺、l为亮氨酸、k为赖氨酸、p为脯氨酸、v为缬氨酸、s为丝氨酸。
以上短肽由7-17个氨基酸组成，上述具有特定长度的短肽能够在细胞中促进胶原蛋白的分泌，且具有一定的活化细胞的能力，本申请将其包覆在脂质体内与精华液相互配合，起到了良好的抗衰老的作用。
试验一、精华液抗衰老效果的人体测试
社会征集总计200名女性志愿者，预先填写知情同意书，年龄分布在42-50岁，志愿者根据面部皮肤的情况分为5组，每组40名，其中一组志愿者使用普通精华液作为对照组，另外四组志愿者使用实施例制备的精华液，每日早晚各一次，一次约2ml，仅对志愿者的半边脸进行涂抹，另外半边脸用水代替，连续使用一个月，对志愿者的面部皮肤进行对比观察，根据对比结果进行三种分级：
明显：表示使用精华液的半边脸相比使用水的半边脸更加光滑柔嫩、有弹性，肤色更加白皙；
有效：表示使用精华液的半边脸皱纹得到改善但仍然存在可见皱纹，皮肤色泽相比有所增白；
无效：表示使用精华液的半边脸皮肤状况以及肤色状况与使用水的半边脸无明显区别，具体观察结果如下表。
Figure SMS_2
不难看出，相比常规的精华液而言，采用本发明的精华液对皮肤的修复以及延缓衰老具有良好的效果，申请人认为这是因为其中的胶原短肽脂质体以及精华液中的其他营养成分相互配合作用，一方面提高了细胞的生理活性，另一方面为细胞合成和翻译后加工I型胶原蛋白提供了必要的原料，从而促进了有活性的I型胶原蛋白的产生。
试验二、测试细胞白蛋白分泌水平评估细胞代谢活力
配置细胞培养液方法如下：
1. 在室温下（20℃-30℃）用700mL蒸馏水溶解改良Eagle培养基A（Dulbecco'smodification of Eagle's medium Dulbecco，DMEM（A））培养基干粉10g，轻轻搅拌，不要加热。
2.蒸馏水冲洗包装袋内部，转移全部的痕量干粉到容器内。
3.加碳酸氢钠3.7g，4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.4g，青霉素100000U，链霉素100000U到细胞培养液中。
4.通过缓慢搅拌加入1M NaOH或1M HCl调节pH值至7.0-7.2。
5.用蒸馏水定容至1000mL后，充分搅拌溶解。
6.静置完全溶解后，在生物安全柜使用0.22μm的聚丙烯腈微孔膜过滤除菌抽滤分装，在4℃冰箱可保藏2周。
7.使用前加入10%胎牛血清（v/v）。
其中改良Eagle培养基A是一种含各种氨基酸和葡萄糖的细胞培养基干粉，市售每袋10克该培养基干粉配置成的1L培养基包括如下组分：
Figure SMS_3
Figure SMS_4
采用美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)购买的人成纤维细胞，分为2组，在细胞培养液中培养，其中一组是不加任何添加剂的空白对照组，另一组是试验组，添加本发明实施例4中制备的胶原短肽脂质体，胶原短肽脂质体的用量为细胞培养液用量的1%（v/v）。培养24h后，使用Solarbio出售的人白蛋白-FITC标记抗体进行荧光标记，标记完成后采用显微镜观察并拍照记录，放大倍数为40倍。图1所示为对照组的细胞状态，图2为试验组的细胞状态，其中细胞内部灰色部分为白蛋白。不难看出，添加了本发明实施例4的胶原短肽脂质体后的试验组，细胞白蛋白的分泌明显增多。另外，对照组细胞视野中，多见颜色较深黑的衰老细胞。与此对照，加入胶原短肽脂质体的试验组细胞内，几乎未见到深黑色衰老细胞，细胞分裂旺盛，活性明显增强。白蛋白分泌量可以作为细胞活性的一个重要指标，该结果提示，本发明中的胶原短肽脂质体具有提高细胞活性，从而延缓细胞衰老的作用。
试验三、细胞内胶原蛋白mRNA转录水平检测
以成纤维细胞作为模型，分为两组，采用试验二中制备的细胞培养液进行培养，试验组加入实施例4所制备的胶原短肽溶液，加入量为细胞培养液的5%（v/v）；另一组不加胶原短肽溶液作为对照组。二组细胞分别连续培养10天和30天后，破碎细胞，分离和纯化细胞内总RNA，并用实时荧光定量RT-PCR分析I型胶原蛋白mRNA的转录水平，具体步骤如下：
人类I型胶原蛋白的mRNA及蛋白质序列见网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_000089.4根据供应商（Invitrogen，美国）提供的方法，使用Trizol试剂从成纤维细胞中提取总RNA。使用Primescript RT试剂盒（Takara，日本）制备cDNA。使用表1中的引物进行PCR扩增。根据LightCycler®96实时PCR系统（Roche，瑞士）的标准协议，使用SYBRpremix ex TAQ II（Takara，日本）进行实时定量分析。以β-肌动蛋白（β-actin）作为内部参比，将2-∆∆CT值归一化为β-肌动蛋白水平。每种样品分三份分析，数据取平均值。
实时荧光定量RT-PCR所运用的引物序列如下表所示
Figure SMS_5
所有引物均由武汉Quintarabio公司合成，使用时稀释到10μM。
在Roche公司的LightCycler 96Real-Time PCR system上进行实时荧光定量RT-PCR反应，20μl总反应体系配制如下：
Figure SMS_6
样品充分混匀后，低速离心5s将反应液甩至底部，开始扩增。反应程序如下：
反应结束后根据Cq值进行相对定量计算。
结果如图3，在成纤维细胞细胞培养液中，分别添加5%实施例4的胶原短肽溶液作为试验组或无添加的对照组，连续培养10天和30天后，用实时荧光定量RT-PCR定量检测细胞内I型胶原蛋白mRNA的转录水平，以β-actin作为内部参比进行校正，结果是三次独立试验的平均值，所有组之间的比较采用未配对学生t检验或单因素方差分析， *P<0.05差异具有统计学意义，**P<0.01差异显著。不难看出，在添加了本发明的胶原短肽溶液后，成纤维细胞内胶原蛋白的mRNA转录水平明显提高。该结果表明，本发明所提供的方法制备的胶原短肽溶液对成纤维细胞具有一定的刺激作用，成纤维细胞在这种刺激下能够分泌更多的胶原蛋白，从而改善人体皮肤的状态，抚平皱纹，提高皮肤的弹性，达到抗衰老的效果。
将这些具有特定长度的胶原短肽包覆在脂质体中，提高胶原短肽被细胞的吸收能力，且脂质体中还添加有I型胶原蛋白合成过程中所需要的一些辅助成分，配合胶原短肽，进一步提高了I型胶原蛋白的合成和翻译后修饰；精华液中其他的成分起到了相应的保湿补水、抗氧化以及补充养分的作用，从而使本发明的精华液相比常规精华液而言具有更好的抗衰老效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种胶原短肽脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、配置10%质量浓度的明胶溶液，升温至60-70℃，保温搅拌20-30min，调节溶液pH值为9.0-10.0，加入胰酶，保温搅拌反应4-6h，得到碱性水解液；
步骤二、将步骤一所得碱性水解液煮沸处理5-10min，降温至50-60℃，调节溶液pH值为6.5-7.5，加入无花果蛋白酶，保温搅拌反应3-4h，得到中性水解液；
步骤三、将步骤二所得中性水解液煮沸处理5-10min，降温至50-60℃，调节溶液pH值为3.0-4.0，加入酸性蛋白酶，保温搅拌4-6h，得到酸性水解液；
步骤四、将步骤三所得酸性水解液煮沸处理5-10min，降温至常温，调节pH值为6.5-7.5，加入维生素C、α-酮戊二酸、葡萄糖和半乳糖，搅拌均匀得到胶原短肽溶液；所述明胶：维生素C：α-酮戊二酸：葡萄糖：半乳糖的质量比为1：（0.1-0.2）：（0.04-0.1）：（0.02-0.05）：（0.02-0.05）；
步骤五、将大豆磷脂与环己烷混合搅拌均匀得到油相溶液，将油相溶液与步骤四所得胶原短肽溶液混合搅拌，3000r/min搅拌2-3h，得到乳浊液，升温至75-80℃，保温搅拌，直至无液体蒸出，得到胶原短肽脂质体。
2.如权利要求1所述的一种胶原短肽脂质体的制备方法，其特征在于，所述胰酶、无花果蛋白酶以及酸性蛋白酶与明胶的质量比均为（0.2-2.0）:100。
3.如权利要求1所述的一种胶原短肽脂质体的制备方法，其特征在于，步骤五中，所述大豆磷脂与环己烷的质量比为1：（1-5）。
4.如权利要求1所述的一种胶原短肽脂质体的制备方法，其特征在于，步骤五中，所述油相溶液与胶原短肽溶液的体积比为1:（1-2）。
5.如权利要求1-4任一项所述的制备方法所制备的胶原短肽脂质体在制备精华液中的应用。
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