CN111484646B - 一种智能响应性聚合物修饰的多孔膜材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及材料分析化学、生物化学和有机化学领域，提供一种智能响应性聚合物修饰的多孔膜材料及其制备方法，该多孔膜材料包括多孔膜和接枝到所述多孔膜的孔道内表面的智能响应性聚合物。制备方法主要利用原子转移自由基聚合反应机制，将智能响应性聚合物接枝到多孔膜的孔道内表面得到多孔膜材料。通过皮安计测量孔道电流的变化最终实现了对环磷酸腺苷及其类似物超灵敏性检测，对生物、化学和材料学，尤其是生物传感领域及生物分离领域都有着十分重要的理论和实际意义。

Description

一种智能响应性聚合物修饰的多孔膜材料及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及智能响应性聚合物在无机多孔膜材料表面的修饰。同时还进一步涉及该聚合物修饰的多孔膜材料在检测环磷酸腺苷中的应用。和常规的同位素标记、色谱分离和质谱检测的方法相比，聚合物修饰的多孔膜材料在检测磷酸腺苷时，具有检测灵敏度高，检测速度快，操作简便，成本低廉的优点。非常适用于复杂生物体系中快速动态地监测环磷酸腺苷含量变化，并对其类似物磷酸腺苷做出一定区分。
背景技术
环磷酸腺苷(cAMP)是细胞内参与调节物质代谢和生物学功能的重要物质，是生命信息传递的"第二信使"。在体内可以促进心肌细胞的存活，增强心肌细胞抗损伤、抗缺血和缺氧能力；促进钙离子向心肌细胞内流动，增强磷酸化作用，促进兴奋-收缩偶联，提高心肌细胞收缩力，增加心输出量；同时还扩张外周血管，降低心脏射血阻抗，减轻心脏前后负荷，增加心排出量，改善心功能。从而对心脏起到营养心肌、正性肌力、舒张血管、抗血小板凝聚和抗心律失常的作用。
环磷酸腺苷(cAMP)在临床上主要用于治疗心功能不全、心绞痛和心肌梗死。尤其是对洋黄类强心药中毒或不敏感的患者。进入细胞的环磷腺苷在发挥生物学效应后被磷酸二酯酶降解成5-腺苷-5′-磷酸(5-AMP)失去活性，进而被分解成腺苷和磷酸。它是在人体内广泛存在的一种具有生理活性的重要物质，由三磷酸腺苷在腺苷环化酶催化下生成，能调节细胞的多种功能活动。作为激素的第二信使，在细胞内发挥激素调节生理机能和物质代谢作用，能改变细胞膜的功能，促使网织肌浆质内的钙离子进入肌纤维，从而增强心肌收缩，并可促进呼吸链氧化酶的活性，改善心肌缺氧，缓解冠心病症状及改善心电图。此外，对糖、脂肪代谢、核酸、蛋白质的合成调节等起着重要的作用。因此，对于生物体内cAMP的动态监控和定量研究成为了生命科学中的热点问题。目前对于磷酸腺苷的检测，主要采用的方法是利用放射元素如32P或3H在生物代谢过程中进行标记，先进行色谱分离，然后通过放射图谱或质谱技术进行定性或者定量的检测。然而，上述方法存在费时费力的缺点，且由于生物体系复杂检测灵敏度不高，另外具有放射性危险。因此，当我们在研究过程中重点关注其动态变化的浓度而不是具体结构时，该方法的就难以满足快速检测的要求。综上所述，开发对生物体内痕量的环磷酸腺苷具有高选择性和高灵敏度的传感器，对于进一步研究细胞内信号通路的组成及机理有着重要的意义。本发明受生物体内细胞膜离子通道的启发，通过表面引发—原子转移自由基聚合的方法，将对环磷酸腺苷具有响应性的智能聚合物修饰到多孔膜的孔道内，以构建仿生人工离子通道，并制备出具有选择性、响应性和可控性的传感器件。环磷酸腺苷通过纳米通道时，与孔道内表面修饰的智能聚合物的结合造成后者构象发生剧烈变化，从而导致孔道有效直径变小，通过皮安计测量孔道电流的变化最终实现了对环磷酸腺苷及其类似物的超灵敏性检测，对生物、化学和材料学，尤其是生物传感领域及生物分离领域都有着十分重要的理论和实际意义本发明受生物体内细胞膜离子通道的启发，通过表面引发—原子转移自由基聚合的方法，将对环磷酸腺苷具有响应性的智能聚合物修饰到多孔膜的孔道内，以构建仿生人工离子通道，并制备出具有选择性、响应性和可控性的传感器件。环磷酸腺苷通过纳米通道时，与孔道内表面修饰的智能聚合物的结合造成后者构象发生剧烈变化，从而导致孔道有效直径变小，通过皮安计测量孔道电流的变化最终实现了对环磷酸腺苷及其类似物超灵敏性检测，对生物、化学和材料学，尤其是生物传感领域及生物分离领域都有着十分重要的理论和实际意义。
发明内容
本发明旨在提供一种对环磷酸腺苷具有识别能力的智能响应性聚合物(简称智能聚合物)，并通过表面引发—原子转移自由基聚合的方法，在无机多孔膜材料，如阳极氧化铝膜(PAA)、氮化硅(Si3N4)等；或有机多孔膜材料，如聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等孔道内表面接枝该响应性聚合物，从而构建仿生的纳米离子通道，该人工离子通道可被用于环磷酸腺苷的快速检测和分离。
为解决上述问题，本发明采用下述方案来实现：
一种智能响应性聚合物修饰的多孔膜材料，该多孔膜材料包括多孔膜和接枝到所述多孔膜的孔道内表面的智能响应性聚合物，所述智能响应性聚合物的分子结构如下：
Figure BDA0001957528150000031
其中，x为0.01-0.5；
所述多孔膜为无机多孔膜或有机多孔膜。
所述多孔膜材料直径为5-50mm，平均孔径为20-200nm。
所述无机多孔膜为阳极氧化铝膜(PAA)、氮化硅(Si3N4)中的一种。
所述有机多孔膜为聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)中的一种。
一种智能响应性聚合物修饰的多孔膜材料的制备方法，该制备方法利用原子转移自由基聚合反应机制，经过一步反应，将智能响应性聚合物(双组分功能共聚物)接枝到溴化处理过的无机多孔膜材料，如阳极氧化铝膜(PAA)、氮化硅(Si3N4)等；或有机多孔膜材料，如聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)膜等的孔道内。具体步骤如下：
(1)向三口烧瓶中依次加入异丙基丙烯酰胺和丙烯酰胺-三唑-精氨酸，二者的摩尔比为1-99：1，再次加入30-300mL N,N’-二甲基甲酰胺，超声溶解；
(2)向步骤(1)产物中通氮气10-30分钟，然后加入0.14-1.4mmol溴化亚铜粉末，混合均匀；
(3)将溴化处理的末端含有溴的多孔膜加入烧瓶中，随后反应体系抽真空—充氮气，除去反应体系中残余的氧气；
(4)向步骤(3)中通过注射加入0.2-2mL N，N，N'，N'，N'-五甲基二亚乙基三胺或联吡啶配体，再进行一次脱氧处理；
(5)将步骤(4)产物保持氮气气氛，恒温60-100℃条件下反应4-25h，用20-200mLDMF和去离子水先后浸泡清洗，用氮气吹干后得到智能响应性聚合物修饰的多孔膜材料备用。
一种智能响应性聚合物修饰的多孔膜材料的应用，该多孔膜材料在环磷酸腺苷的超高灵敏度检测、区分不同类型的磷酸腺苷中的应用；将其应用在磷酸腺苷的超高灵敏度检测和不同种类磷酸腺苷的区分等领域。将聚合物修饰后的多孔膜放入电化学池夹具之间，在池中注入不同浓度的氯化钠或者氯化钾溶液充当电解液，并添加不同浓度、不同种类的磷酸腺苷溶液，然后使用皮安计检测通过修饰有智能聚合物的多孔膜材料的微电流变化。
所述多孔膜材料在环磷酸腺苷的超高灵敏度检测、区分不同类型的磷酸腺苷中应用，具体操作是将聚合物修饰后的多孔膜放入电化学池夹具之间，在池中注入不同浓度的氯化钠或者氯化钾溶液充当电解液，并添加不同浓度、不同种类的磷酸腺苷溶液，然后使用皮安计检测通过修饰有智能聚合物的多孔膜材料的微电流变化，通过电流变化快速对磷酸腺苷的浓度水平进行初步的定量分析，并且该方法可以识别并区分不同种类的磷酸腺苷，具体步骤如下：
步骤1、先采用活化液平衡活化聚合物修饰的多孔膜材料；所述活化液为氯化钠或者氯化钾溶液，所述活化液的Ph为2-5，浓度为0.05-2.0mol/L，所述活化液的溶剂为去离子水。
步骤2、将聚合物修饰后的多孔膜放入电化学池夹具之间，然后向池中注入电解液，振荡排除膜表面气泡后静置5-15分钟，电化学池两端插入电极后用皮安计测量其跨膜电流；电解液为含0.05-2.0mol/L的氯化钠或者氯化钾溶液，电解液的pH为2-10，溶剂为去离子水溶液或乙腈。电极为银-氯化银电极、汞-氯化汞或者石墨电极。
步骤3、用注射器移去电化学池中步骤2添加的电解液，重新注入10-11-10-5mol/L磷酸腺苷的电解液，所述磷酸腺苷电解液的pH为2-10，振荡排除膜表面气泡后静置5-15分钟，电化学池两端插入电极后用皮安计测量其跨膜微电流。采用皮安计采集跨膜微电流变化时，电源在电极两端施加-0.2-0.2V的脉冲电压，每个脉冲电压持续时间1-10秒，并由皮安计自动在相连的计算机上记录相对应的跨膜微电流。
本发明的有益效果为：
1、本发明制备的聚合物修饰的多孔膜材料在检测环磷酸腺苷时，具有检测灵敏度高，检测速度快，操作简便，成本低廉的优点。非常适合于复杂样品体系中磷酸腺苷含量水平的动态监测；
2、本发明制备的聚合物修饰的多孔膜材料在检测环磷酸腺苷时，对不同的磷酸腺苷响应性不同，因此可以实现不同磷酸腺苷的区分；
3、本发明制备的聚合物修饰的多孔膜材料在检测环磷酸腺苷时，检测信号是微电流，容易控制、监测和转化成其它信号，该系统兼容性好，易与其它器件或仪器联用，具有很好的可扩展性。
附图说明
图1.智能聚合物分子结构示意图；
图2.聚合物修饰的多孔膜材料结构示意图；
图3.聚合物修饰前PAA膜表面形貌SEM图；
图4.聚合物修饰后PAA膜表面形貌SEM图；
图5.智能聚合物表面对三磷酸腺苷，二磷酸腺苷，单磷酸腺苷和环磷酸腺苷的石英微天平(QCM)吸附曲线；
图6.金电极的交流阻抗图谱；
图7.电子转移电阻的下降比例图；
图8.聚合物修饰的多孔膜材料在检测磷酸腺苷时具体装置示意图；
图9.智能聚合物接枝前后PAA膜伏安特性曲线；
图10.不同浓度环磷酸腺苷刺激下跨膜微电流变化曲线；
图11.不同浓度三磷酸腺苷刺激下跨膜微电流变化曲线；
图12.不同浓度二磷酸腺苷刺激下跨膜微电流变化曲线；
图13.不同浓度单磷酸腺苷刺激下跨膜微电流变化曲线。
具体实施方式
为使本发明的内容、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例和附图进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明，而本发明不仅限于以下实施例。
实施例中所用原料及设备
各种多孔膜材料由深圳拓扑精膜科技有限公司购得。溴化亚铜(CuBr，99.999％)，联吡啶类配体，有机碱，异丙基丙烯酰胺，丙烯酰氯，精氨酸以及测试用各种磷酸腺苷由Sigma-Aldrich公司购得。丙酮，甲醇，N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)由阿尔法公司购得。异丙基丙烯酰胺在使用前用正己烷重结晶三次，放置在真空干燥器中备用。其他试剂均使用市售分析纯。石英微天平(QCM)吸附数据由Q-Sense E4 system检测获得。原子力显微镜形貌数据由Bruker Multimode 8型AFM获得。扫描隧道显微镜形貌数据由Hitachi S-4800型SEM采集获得。跨膜微电流数据由Keithley 6487型皮安计自动采集并记录。
实施例1
接枝智能聚合物薄膜的多孔材料的制备
智能响应性聚合物结构如图1所示，其中X＝0.01-0.5。当X＝0.1时，在100mL三口烧瓶中加入4.8mmol异丙基丙烯酰胺(NIPAM)和1.2mmol丙烯酰胺-三唑-精氨酸(ATGPA)，并加入60mL N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)超声溶解10分钟。通氮气20分钟后，加入32mg溴化亚铜(CuBr)粉末，混合均匀。将溴化处理过的PAA、PET、PC、PMMA或者Si3N4膜等加入烧瓶中，随后反应体系抽真空—充氮气，除去反应体系中残余的氧气。然后通过注射加入0.16mL N，N，N'，N'，N'-五甲基二亚乙基三胺(PMDETA)或联吡啶配体，接着再进行一次脱氧处理。在氮气保护、恒温70℃条件下，反应15h后取出，分别以100mLDMF和去离子水按顺序浸泡冲洗，用氮气吹干后备用，得到如图2所示的多孔膜材料。以PAA膜为例，图3和图4为接枝前后多孔材料的表面SEM图。
实施例2
通过QCM-D吸附量测定的方法，以评价该智能聚合物表面对环磷酸腺苷，单磷酸腺苷，二磷酸腺苷，三磷酸腺苷不同的吸附行为。按实施例1所述类似方法将该聚合物接枝到QCM-D芯片表面，在控温20℃条件下，以去离子水为载液分别对浓度为1μg/mL的环磷酸腺苷，单磷酸腺苷，二磷酸腺苷，三磷酸腺苷进行吸附实验。图5显示了该智能聚合物表面对(环磷酸腺苷，单磷酸腺苷，二磷酸腺苷，三磷酸腺苷均有较强的吸附并且具有一定的区分能力，即四种磷酸腺苷在该聚合物表面的吸附量各不相同。
实施例3
按实施例1所述制备方法，将聚合物接枝在金电极表面，采用交流阻抗测试浸入不同浓度的环磷酸腺苷的铁氰化钾和亚铁氰化钾溶液，浓度分别为10-9、10-8、10-7、10-6或10- 5mol/L。20分钟之后通过电化学工作站，采用交流阻抗测试方法测试，图6和图7可以看到该智能聚合物薄膜材料在浸泡在不同浓度下的曲线和电子转移电阻的变化值。说明该智能聚合物对环磷酸腺苷具有响应性。
检测应用实例
聚合物修饰的多孔材料以PAA膜为例，其活化平衡过程为：将空白或者聚合物接枝的PAA膜装入表面皿中，加入200μL pH＝2.5含0.1mol/L氯化钠的活化液，静置10分钟后，将PAA膜取出，用200μL去离子水冲洗后氮气吹干后进行下述实验操作。
实施例4
1)将上述活化后的空白或者聚合物修饰的PAA膜放入电化学池夹具之间，然后向池中注入pH＝7含0.1mol/L氯化钠的电解液，振荡排除膜表面气泡后静置5分钟，电化学池两端插入银-氯化银电极后用皮安计测量其跨膜电流(具体装置如图8所示)。
2)用注射器移去电化学池中的电解液，重新注入添加有浓度分别为10-11、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6或10-5mol/L环磷酸腺苷的电解液(pH＝7，含0.1mol/L氯化钠)，振荡排除膜表面气泡后静置5分钟，电化学池两端插入银-氯化银电极后用皮安计测量其跨膜电流。
其中采用皮安计采集跨膜微电流变化时，电源在电极两端施加-0.2～+0.2V的脉冲电压，每个脉冲电压持续时间4秒，并由皮安计自动在相连的计算机上记录相对应的跨膜微电流。
由图9可见，在接枝聚合物前后，通过PAA膜的离子移动速率发生了改变，其伏安特性曲线发生了明显变化。另外当我们以+2V时的跨膜微电流为例，在往电解液中添加不同浓度的环磷酸腺苷后(如图10)，对于空白PAA膜的影响并不大，而对于接枝有聚合物的PAA膜，则发生了不同程度明显的电流下降的现象。当环磷酸腺苷浓度为10-6mol/L时，测得+2V时电流值为21μA，此时电流下降比例达到25％。为由此可见，该聚合物接枝的PAA材料对于环磷酸腺苷表现出了依赖于其浓度的不同响应性，有望被用于环磷酸腺苷的快速定量检测。
实施例5
按照实施例4所述方法，所述步骤2)中将电解液中环磷酸腺苷分别换成相同浓度的三磷酸腺苷，进行跨膜电流测试。
同样以+2V时的跨膜微电流为例，在往电解液中添加不同浓度的三磷酸腺苷(如图11)，对于空白PAA膜的影响并不大，而对于接枝有聚合物的PAA膜，则发生了不同程度明显的电流下降的现象。当三磷酸腺苷浓度为10-6mol/L时，测得+2V时电流值为23μA，电流下降比例达到18％。由此可见，该聚合物接枝的PAA材料对于三磷酸腺苷表现出了依赖于其浓度的不同响应性。
实施例6
按照实施例4所述方法，所述步骤2)中将电解液中环磷酸腺苷分别换成相同浓度的二磷酸腺苷，进行跨膜电流测试。
同样以+2V时的跨膜微电流为例，在往电解液中添加不同浓度的二磷酸腺苷(如图12)，对于空白PAA膜的影响并不大，而对于接枝有聚合物的PAA膜，则发生了不同程度明显的电流下降的现象。当二磷酸腺苷浓度为10-6mol/L时，测得+2V时电流值为24μA，电流下降比例达到14％。由此可见，该聚合物接枝的PAA材料对于二磷酸腺苷表现出了依赖于其浓度的不同响应性。
实施例7
按照实施例5所述方法，所述步骤2)中将电解液中环磷酸腺苷分别换成相同浓度的单磷酸腺苷，进行跨膜电流测试。
同样以+2V时的跨膜微电流为例，在往电解液中添加不同浓度的单磷酸腺苷(如图13)，对于空白PAA膜的影响并不大，而对于接枝有聚合物的PAA膜，则发生了不同程度明显的电流下降的现象。当单磷酸腺苷浓度为10-6mol/L时，测得+2V时电流值为25.5μA，电流下降比例达到9％。由此可见，该聚合物接枝的PAA材料对于单磷酸腺苷表现出了依赖于其浓度的不同响应性。
综上所述，本发明聚合物修饰的多孔膜材料对于环磷酸腺苷有很好的响应能力，通过跨膜电流的监测能够实现对环磷酸腺苷初步定量检测，并且对不同的磷酸腺苷展现出了一定的区分能力。同时与传统的检测方法相比具有检测速度快、灵敏度高和成本低廉的优点。因此可将其应用于复杂生物体系中大规模、高通量、高精度的磷酸腺苷浓度检测，另外由于该方法检测信号为常用电信号，兼容性好，因此有望结合其他检测手段，在环磷酸腺苷的检测分析乃至生物体内信号通路的研究领域发挥独特的作用。

Claims (9)

1.一种智能响应性聚合物修饰的多孔膜材料，其特征在于：所述多孔膜材料包括多孔膜和接枝到所述多孔膜的孔道内表面的智能响应性聚合物，所述智能响应性聚合物的分子结构如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
其中，x为0.01-0.5;
所述多孔膜为无机多孔膜或有机多孔膜;
所述的多孔膜材料制备方法是利用原子转移自由基聚合反应机制，将智能响应性聚合物接枝到多孔膜的孔道内表面，具体步骤如下：
（1）向三口烧瓶中依次加入异丙基丙烯酰胺和丙烯酰胺-三唑-精氨酸，二者的摩尔比为1-99：1，再次加入30-300 mL N,N’-二甲基甲酰胺，超声溶解；
（2）向步骤（1）产物中通氮气10-30分钟，然后加入0.14-1.4 mmol 溴化亚铜粉末，混合均匀；
（3）将溴化处理的末端含有溴的多孔膜加入烧瓶中，随后反应体系抽真空—充氮气，除去反应体系中残余的氧气；
（4）向步骤（3）中通过注射加入0.2-2 mL N，N，N'，N'，N'-五甲基二亚乙基三胺或联吡啶配体，再进行一次脱氧处理；
（5）将步骤（4）产物保持氮气气氛，恒温60-100 °C条件下反应 4-25 h，用20-200 mLDMF和去离子水先后浸泡清洗，用氮气吹干后得到智能响应性聚合物修饰的多孔膜材料备用。
2.根据权利要求1所述的智能响应性聚合物修饰的多孔膜材料，其特征在于：所述无机多孔膜为阳极氧化铝膜、氮化硅中的一种。
3.根据权利要求1所述的智能响应性聚合物修饰的多孔膜材料，其特征在于：所述有机多孔膜为聚对苯二甲酸乙二酯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯中的一种。
4.根据权利要求1所述的智能响应性聚合物修饰的多孔膜材料的应用，其特征在于：该多孔膜材料在环磷酸腺苷的超高灵敏度检测、区分不同类型的磷酸腺苷中的应用；将聚合物修饰后的多孔膜放入电化学池夹具之间，在池中注入不同浓度的氯化钠或者氯化钾溶液充当电解液，并添加不同浓度、不同种类的磷酸腺苷溶液，然后使用皮安计检测通过修饰有智能聚合物的多孔膜材料的微电流变化。
5.根据权利要求4所述的智能响应性聚合物修饰的多孔膜材料的应用，其特征在于：所述多孔膜材料在环磷酸腺苷的超高灵敏度检测、区分不同类型的磷酸腺苷中应用的具体步骤如下：
步骤1、先采用活化液平衡活化聚合物修饰的多孔膜材料；
步骤2、将聚合物修饰后的多孔膜放入电化学池夹具之间，然后向池中注入电解液，振荡排除膜表面气泡后静置5-15分钟，电化学池两端插入电极后用皮安计测量其跨膜电流；
步骤3、用注射器移去电化学池中步骤2添加的电解液，重新注入浓度为10-11-10-5 mol/L磷酸腺苷的电解液，所述磷酸腺苷电解液的pH为2-10，振荡排除膜表面气泡后静置5-15分钟，电化学池两端插入电极后用皮安计测量其跨膜微电流。
6.根据权利要求5所述的智能响应性聚合物修饰的多孔膜材料的应用，其特征在于：所述步骤1中活化液为氯化钠或者氯化钾溶液，所述活化液的pH为 2-5，浓度为0.05-2.0mol/L，所述活化液的溶剂为去离子水。
7.根据权利要求5所述的智能响应性聚合物修饰的多孔膜材料的应用，其特征在于：所述步骤2中电解液为含0.05-2.0 mol/L的氯化钠或者氯化钾溶液，电解液的pH为2-10，溶剂为去离子水溶液。
8.根据权利要求5所述的智能响应性聚合物修饰的多孔膜材料的应用，其特征在于：所述步骤2中电极为银-氯化银电极、汞-氯化汞电极或者石墨电极。
9.根据权利要求5所述的智能响应性聚合物修饰的多孔膜材料的应用，其特征在于：所述步骤3中采用皮安计采集跨膜微电流变化时，电源在电极两端施加-0.2-0.2 V的脉冲电压，每个脉冲电压持续时间1-10 秒，并由皮安计自动在相连的计算机上记录相对应的跨膜微电流。
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