CN111471712A - CRISPR/Cas9双靶点靶向敲除目的基因载体构建方法 - Google Patents
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Abstract
CRISPR/Cas9双靶点靶向敲除目的基因载体构建方法，包括以下步骤：通过以pLenti CRISPR‑E载体为基础，通过在线设计工具选择得分较高的靶位点设计引物，通过退火产生双链DNA，再经过连接转化将其构建到pLenti CRISPR‑E载体上，将载体转入受体细胞后，提取细胞DNA测序验证挑选出敲除效率较高的两个靶位点。本发明以pLenti CRISPR‑E载体为骨架，利用同源重组酶的原理，快速构建针对目标基因的双靶点CRISPR表达载体模型，本发明设计的双靶点CRISPR载体系统，可以应用于改造CRISPR单靶点的载体，从而提高打靶效率，实现多基因敲除，有很好的实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体涉及一种CRISPR/Cas9双靶点靶向敲除目的基因载体构建方法。
背景技术
CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，CRISPR全称Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats-成簇的规律间隔的短回文重复序列。其中，CRISPR序列由众多短而保守的重复序列区和间隔区组成。重复序列区含有回文序列，可以形成发卡结构。而间隔区比较特殊，它们是被细菌俘获的外源DNA序列。
CRISPR/Cas9技术是近年来迅速兴起的一种简单、高效、精确的DNA修饰方法，它不受宿主因素的影响，已广泛应用于动物界的基因组功能分析。它是一个由Cas9核酸酶组成的双组分系统，与单个引导RNA(sg RNA)形成复合物，产生双链断裂。特异性切割位于sgRNA5’端的20nt靶向序列和毗邻DNA结合位点的3ntProtspacer相邻基序(PAM)序列。自2012年以来，CRISPR/Cas9基因编辑技术得到广泛应用，其原理简单、编辑高效、成本低廉，已成为动植物基础研究及应用上的主流生物技术。
CRISPR/Cas9核算酶的RNA介导Cas9蛋白切割DNA产生DNA双链切口(DSB)。DSB能激活细胞一系列机制修复DNA缺口，减少DNA损伤对细胞的影响。修复方式主要有两种：非同源末端结合(Non-homologous End Joining-NHEJ)，这种方式在没有修复模板的情况下发生；同源直接修复(Homology directed repair-HDR)，这个方式是在有修复模板的情况下发生。
目前为止，采用CRISPR/Cas9技术已广泛用于动物植物微生物，虽然CRISPR/Cas9基因编辑技术具有设计简单、成本低等特点，但是还是面临着很高的脱靶效率，为了提高CRISPR/Cas9对基因的定向敲除效率，本发明通过对pLenti CRISPR-E载体进行改造，在载体靶位点后面加上了一段启动子及g RNA序列将其改造成一个双靶点的载体，显著提高pLenti CRISPR-E载体的打靶效率，同时能够实现目的片段的大片段敲除。另外通过同源重组的方法在pLenti CRISPR-E载体上加入一段荧光序列，便于观察载体的转染效率。
现有技术缺点：
(1)尽管单个靶位点的敲除在很多mRNA中得到广泛的应用，但是对于一些非编码RNA，如长链非编码RNA，由于其片段较长，单靶点敲除脱靶效率高，单个位点很难敲除彻底，如果是大片段删除，需转染两个g RNA，后期操作繁琐，成本高。
(2)CRISPR系统中多靶点间隔序列的形式被重复序列隔开，每个靶点针对一个基因打靶，但是靶序列较短，不同靶点间被重复序列间隔，体外直接合成多靶点DNA片段成本高，重复序列处易产生突变，需设计一种高效低成本的构建方法解决这种问题。
(3)原有的pLenti CRISPR-E载体，由于没有荧光，在进行转染时无法判断其转染效率。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供一种CRISPR/Cas9双靶点靶向敲除目的基因载体构建方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
CRISPR/Cas9双靶点靶向敲除目的基因载体构建方法，包括以下步骤：通过以pLenti CRISPR-E载体为基础，通过在线设计工具选择得分较高的靶位点设计引物，通过退火产生双链DNA，再经过连接转化将其构建到pLenti CRISPR-E载体上，将载体转入受体细胞后，提取细胞DNA测序验证挑选出敲除效率较高的两个靶位点。
本发明和现有技术相比，其优点在于：
(1)本发明以pLenti CRISPR-E载体为骨架，利用同源重组酶的原理，快速构建针对目标基因的双靶点CRISPR表达载体模型，本发明设计的双靶点CRISPR载体系统，可以应用于改造CRISPR单靶点的载体，从而提高打靶效率，实现多基因敲除，有很好的实用价值。
(2)本发明提高pLenti CRISPR-E载体的打靶效率，在载体上加入一段启动子和gRNA序列，使其构成双靶点载体，能够同时启动两个靶位点的表达，解决了现有技术中，单靶点敲除效率低问题，可以提高敲除效率，降低载体构建的成本，并提高多靶点CRISPR载体敲除的准确性，同时可以实现多基因打靶，通过构建一个载体即可实现大片段删除的效果。
(3)此外，由于pLenti CRISPR-E载体上没有荧光标签，转染时无法准确判断质粒转染效率，通过同源重组的方法在pLenti CRISPR-E载体上加入一段荧光序列，使其转染效率可视化。
(4)本发明在pLenti CRISPR-E载体上加了一段启动子和g RNA序列，能够显著提高目的基因的敲除效率，另外在载体上还添加了一段荧光序列，使转染效率可视化。
(5)本发明在pLenti CRISPR-E载体上加入第二个启动子和g RNA序列，构成了双靶点载体，能够同时启动两个靶位点的表达，解决了现有技术中，单靶点敲除效率低问题，可以显著提高目的基因的敲除效率。
(6)本发明在pLenti CRISPR-E载体上通过同源重组的方法加上一段荧光序列，使pLenti CRISPR-E载体便于观察转染效率。
(7)本发明在pLenti CRISPR-E载体上加上一段启动子和g RNA序列，构成双靶点载体。同时为了进一步观察其转染效率，在该载体上还加入了一段荧光序列。
(8)本发明采用CRISPR-Cas9系统，CRISPR系统中的靶序列以间隔序列的形式被相同的重复序列隔开，每一段间隔序列表达的RNA能识别并结合特异目标基因，多个间隔序列能分别作用于目标基因，同时实现多基因编辑。
(9)本发明在pLenti CRISPR-E载体上通过同源重组的方法添加了第二个g RNA启动子，不仅能够提高了单个基因的打靶效率，还可以实现目的片段的大片段删除，另外还可以实现多基因打靶。
(10)本发明可降低基因敲除的多个载体验证的成本，还大大缩短了研发周期。
(11)本发明不仅仅只适用于编码基因的敲除，对于很多非编码RNA如长链非编码RNA，可以实现长链非编码RNA的大片段删除。
本发明通过在pLenti CRISPR-E增加了EGFP序列，可以通过观察荧光判断转染效率。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实例中用到的pLenti CRISPR-E载体示意图；
图2为本发明实例中pLenti CRISPR-E载体改造结构示意图；
图3为本发明实例中所用到的中间载体PLKO，另启动子来自于该载体；
图4为本发明实例中g RNA构建菌落PCR检测示意图；
图5为本发明实例中通过PCR扩增U6启动子及g RNA3结果示意图；
图6为本发明实例中双靶点菌落PCR检测示意图；
图7为本发明实例中双靶点测序结果比对；
图8为本发明实例中所用到的pLV-CMV-EGFP-Neo载体图；
图9为本发明实例中扩增出来的EGFP片段；
图10为本发明实例中EGFP测序结果比对；
图11为本发明实例中双靶点转染293T细胞荧光图。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本发明公开的示例性实施例，这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。虽然附图中显示了本发明公开的示例性实施例，然而应当理解，本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。
CRISPR/Cas9双靶点靶向敲除目的基因载体构建方法，其中，CRISPR-Cas9是指成簇的规律间隔的短回文重复序列-CRISPR相关蛋白。
本发明通过以pLenti CRISPR-E载体为基础，通过在线设计工具(ht中s：//zlab.bio/guide-design-resources)选择得分较高的靶位点设计引物，通过退火产生双链DNA，再经过连接转化将其构建到pLenti CRISPR-E载体上，将载体转入受体细胞后，提取细胞DNA测序验证挑选出敲除效率较高的两个靶位点。
首先，通过酶切连接的方法，将其中的一个靶位点连接到一个中间载体上，再设计一对带有pLenti CRISPR-E载体序列的引物，扩增出中间载体的启动子和靶位点，采用同源重组的方法将靶位点和启动子整合到pLenti CRISPR-E载体上，再将重组产物转入感受态细胞，挑取单克隆进行电泳验证和测序鉴定。
其次，为了能够方便观察载体转染效率，通过酶切连接或者同源重组的方法在双靶点载体上加入一段荧光序列，实现pLenti CRISPR-E载体转染效率的可视化。
最后，将上述双靶点带有荧光的载体与对照载体分别转入293T细胞验证其转染效率以及其双靶点敲除效率。
实施例1
靶位点的筛选与验证。
本发明以EGFP为例，根据CRISPR/Cas9技术原理，在EGFP靠近起始密码ATG区域选择两段19bp的序列作为靶位点，另外在EGFP靠近终止密码子TAA区域选择四段19bp的序列作为靶位点。
靶向EGFP的g RNA的选择和设计，是通过在线设计工具(https：//zlab.bio/guide-design-resources)选择得分较高的靶位点设计引物。其中sgGFP1和sgGFP2是在EGFP的N端合成两对g RNA，sgGFP3-4是在EGFP的C端合成了四对g RNA。将6对引物经过PCR程序退火，退火产物分别与BsmBI酶切后的pLenti CRISPR-E(图1)载体进行连接，转化大肠杆菌，挑菌扩摇，菌落PCR检测，挑选正确条带的载体，扩摇后提质粒酶切验证。
将上述6个载体与对照pLenti CRISPR-E分别通过顺转293T细胞，提DNA通过PCR扩增EGFP片段，将扩增产物送测序，判断每个靶位点敲除效率。从中挑选出敲除效率较高的两个靶位点sgGFP1和sgGFP3。
根据载体要求设计如下引物：
sgGFP1-F：CACCGGAGCTGGACGGCGACGTAAA；
sgGFP1-R：AAACTTTACGTCGCCGTCCAGCTCC；
sgGFP2-F：CACCGCAGAACACCCCCATCGGCGA；
sgGFP2-R：AAACTCGCCGATGGGGGTGTTCTGC；
sgGFP3-F：CACCGCATGTGATCGCGCTTCTCGT；
sgGFP3-R：AAACACGAGAAGCGCGATCACATGC；
sgGFP4-F：CACCGCAGAACACCCCCATCGGCGA；
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sgGFP5-F：CACCGCATGCCGAGAGTGATCCCGG；
sgGFP5-R：AAACCCGGGATCACTCTCGGCATGC；
sgGFP6-F：CACCGTGGAGTTCGTGACCGCCGCC；
sgGFP6-R：AAACGGCGGCGGTCACGAACTCCAC。
DNAoligo的退火，50μL体系：
| F | 10μL |
| R | 10μL |
| 10XPCRbuffer | 5μL |
| 5mMMgcl2 | 2μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 23μL |
退火程序采用PCR进行退火，具体程序为：
| 温度 | 时间 |
| 90℃ | 4min |
| 70℃ | 10min |
| 55℃ | 10min |
| 40℃ | 10min |
| 25℃ | 10min |
| 16℃ | ∞ |
pLenti CRISPR-E-GFP载体酶切体系：
连接体系为：
| DNA | 2μL |
| Vector | 1μL |
| 10XT4ligasebuffer | 2μL |
| T4ligasebuffer | 1μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 14μL |
实施例2
pLenti CRISPR-E双靶点载体的获得。
本发明基于pLenti CRISPR-E载体进行双靶点载体改造技术，按照如图2所示pLenti CRISPR-E载体改造结构示意图进行改造。
首先将sgGFP3通过酶切连接的方法克隆至中间载体PLKO上(图3)，根据PLKO载体序列酶切位点，在sgGFP3序列上游引物5’端加上AgeI酶切位点，在下游引物的5’端加上EcoRI酶切位点重新合成sgGFP3的引物，将新合成的sgGFP3引物采用上述PCR程序进行退火，PLKO载体采用AgeI和EcoRI酶切后胶回收，与退火后新的sgGFP3进行连接，连接产物转化大肠杆菌，挑菌检测(图4)，酶切验证，即为新的PLKO-sgGFP3。
再设计一对带有pLenti CRISPR-E载体序列的引物，将sgGFP3和PLKO上的U6启动子同时扩增出来(图5)，与pLenti CRISPR-E-sgGFP1进行同源重组，转入感受态细胞中，挑取单克隆进行电泳验证(图6)和测序鉴定(图7)。
sgGFP-PLKO-F3：CCGGCACCGCATGTGATCGCGCTTCTCGTGTTT；
sgGFP-PLKO-R3：AATTAAACACGAGAAGCGCGATCACATGCGGTG。
PLKO载体检测引物：
PLKO-F：TTCTTGGGTAGTTTGCAGTTT；
sgGFP-PLKO-R3：AATTAAACACGAGAAGCGCGATCACATGCGGTG。
重组引物为：
sg-GFP3CZ-F：TGTACAAGGAATTCGGAGGGCCTATTTCCC；
sg-GFP3CZ-R：TCAAGACCTAGCTAGAAACACGAGAAGCGC。
双靶点检测引物：
EGFP-F：GAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGG；
CRISPR-R：5′TTCACGGCGACTACTGCACT3′。
重组反应为：
| 反应组件 | 体积 |
| Vector | 4μL |
| DNA | 1μL |
| 5XCEIIBuffer | 4μL |
| ExnaseII | 2μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 9μL |
| Total | 20μL |
实施例3
双靶点载体pLenti CRISPR-E荧光系统设计和构建。
本发明是通过同源重组的方法，在双靶点载体pLenti CRISPR-E上加入一段荧光序列，使其更易观察转染效率。荧光序列来自于pLV-CMV-EGFP-Neo载体(图8)上的荧光序列，具体步骤如下：
根据pLenti CRISPR-E载体设计同源重组引物：
CZEcoRI-GFP-F：5′AGTCGGTGCTTTTTTGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG3′；
CZEcoRI-GFP-R：5′CAAGACCTAGCTAGCGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC3′。
其中5’端15nt为载体序列，3’端15nt为EGFP的前后序列，通过PCR将EGFP从pLV-CMV-EGFP-Neo载体上扩增出来(图9)，本实验扩增的EGFP是来自于pLV-CMV-EGFP-Neo载体，同时将pLenti CRISPR-E采用EcoRI内切酶进行线性化后，将扩增EGFP条带和pLentiCRISPR-E载体酶切产物胶回收后进行同源重组反应(重组反应体系参考实施例2)。将重组产物转化至大肠杆菌感受态细胞中，挑取白色菌落进行菌落PCR以鉴定阳性克隆，将阳性克隆送去测序鉴定(图10)，测序正确的载体即为带EGFP荧光标签的pLenti CRISPR-E-EGFP载体。
PCR反应体系：
| 反应组件 | 体积 |
| pLV-CMV-EGFP-NeoDNA | 2μL |
| Forward primer(10μM) | 1μL |
| Reverse primer(10μM) | 1μL |
| Taq DNA Polymerase | 25μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 21μL |
| Total | 50μL |
PCR反应条件：
检测引物序列：
EcoRI-JC-F2：5′AGGCTAGTCCGTTATCAACTT3′；
CZEcoRI-GFP-R：5′CAAGACCTAGCTAGCGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC3′。
实施例4
双靶点载体靶向EGFP敲除效率验证。
步骤1、以6孔板操作为例，转染前一天将6×105个/孔293T细胞接种于培养板中，每孔加入约2mL含有10％FBS和1％PS的高糖DMEM培养基，在5％CO2，37℃恒温培养箱中培养，使第二天转染时细胞密度能够达到80％。
步骤2、取1.5mL灭菌的EP管，里面加入500μL的Opti-DMEM，每管加入4μg质粒，混匀，再加入10μLPEI震荡混匀后，室温静置20min。
步骤3、取出培养箱中的293T细胞，弃掉500μL培养基，然后缓慢加入上述混好的混合液，轻晃混匀，置于5％CO2，37℃恒温培养箱中培养4-6h后将培养基换为含血清的完全培养基。
步骤4、转染48h后，在荧光显微镜下观察拍照，结果如(图11)所示，sgGFP1，sgGFP3，单靶点和sgGFP1+sgGFP3共转293T细胞打靶效率，显著低于双靶点sgGFP1/3的打靶效率，结果表明双靶点的打靶效率显著高于单靶点打靶效率。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，上面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行了清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以上对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (10)
1.CRISPR/Cas9双靶点靶向敲除目的基因载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤：通过以pLentiCRISPR-E载体为基础，通过在线设计工具选择得分较高的靶位点设计引物，通过退火产生双链DNA，再经过连接转化将其构建到pLentiCRISPR-E载体上，将载体转入受体细胞后，提取细胞DNA测序验证挑选出敲除效率较高的两个靶位点。
2.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9双靶点靶向敲除目的基因载体构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤(1)，首先，通过酶切连接的方法，将其中的一个靶位点连接到一个中间载体上，再设计一对带有pLentiCRISPR-E载体序列的引物，扩增出中间载体的启动子和靶位点，采用同源重组的方法将靶位点和启动子整合到pLentiCRISPR-E载体上，再将重组产物转入感受态细胞，挑取单克隆进行电泳验证和测序鉴定；
步骤(2)，其次，为了能够方便观察载体转染效率，通过酶切连接或者同源重组的方法在双靶点载体上加入一段荧光序列，实现pLenti CRISPR-E载体转染效率的可视化；
步骤(3)，最后，将上述双靶点带有荧光的载体与对照载体分别转入293T细胞验证其转染效率以及其双靶点敲除效率。
3.根据权利要求1或2所述的CRISPR/Cas9双靶点靶向敲除目的基因载体构建方法，其特征在于：在EGFP靠近起始密码ATG区域选择两段19bp的序列作为靶位点，另外在EGFP靠近终止密码子TAA区域选择四段19bp的序列作为靶位点；靶向EGFP的g RNA的选择和设计，是通过在线设计工具选择得分较高的靶位点设计引物；其中sgGFP1和sgGFP2是在EGFP的N端合成两对g RNA，sgGFP3-4是在EGFP的C端合成了四对g RNA；将6对引物经过PCR程序退火，退火产物分别与BsmBI酶切后的pLentiCRISPR-E载体进行连接，转化大肠杆菌，挑菌扩摇，菌落PCR检测，挑选正确条带的载体，扩摇后提质粒酶切验证；将上述6个载体与对照pLentiCRISPR-E分别通过顺转293T细胞，提DNA通过PCR扩增EGFP片段，将扩增产物送测序，判断每个靶位点敲除效率；从中挑选出敲除效率较高的两个靶位点sgGFP1和sgGFP3。
4.根据权利要求3所述的CRISPR/Cas9双靶点靶向敲除目的基因载体构建方法，其特征在于：根据pLentiCRISPR-E载体设计如下引物：
sgGFP1-F:CACCGGAGCTGGACGGCGACGTAAA；
sgGFP1-R:AAACTTTACGTCGCCGTCCAGCTCC；
sgGFP2-F:CACCGCAGAACACCCCCATCGGCGA；
sgGFP2-R:AAACTCGCCGATGGGGGTGTTCTGC；
sgGFP3-F:CACCGCATGTGATCGCGCTTCTCGT；
sgGFP3-R:AAACACGAGAAGCGCGATCACATGC；
sgGFP4-F:CACCGCAGAACACCCCCATCGGCGA；
sgGFP4-R:AAACTCGCCGATGGGGGTGTTCTGC；
sgGFP5-F:CACCGCATGCCGAGAGTGATCCCGG；
sgGFP5-R:AAACCCGGGATCACTCTCGGCATGC；
sgGFP6-F:CACCGTGGAGTTCGTGACCGCCGCC；
sgGFP6-R:AAACGGCGGCGGTCACGAACTCCAC。
5.根据权利要求3所述的CRISPR/Cas9双靶点靶向敲除目的基因载体构建方法，其特征在于：退火采用50μLDNAoligo的退火体系；其中，F为10μL；R为10μL；10XPCRbuffer为5μL；5mMMgcl2为2μL；ddH2O为23μL；
其中，温度90℃持续时间4min；温度70℃持续时间10min；温度55℃持续时间10min；温度40℃持续时间10min；温度25℃持续时间10min；温度16℃持续时间∞；
pLenti CRISPR-E-GFP载体酶切体系：Vector为4μL；BsmBI为1μL；10XNEBBuffer为5μL；ddH2O为40μL；
连接体系：DNA为2μL；Vector为1μL；10XT4ligasebuffer为2μL；T4ligasebuffer为1μL；ddH2O为14μL。
6.根据权利要求3所述的CRISPR/Cas9双靶点靶向敲除目的基因载体构建方法，其特征在于：将sgGFP3通过酶切连接的方法克隆至中间载体PLKO上，根据PLKO载体序列酶切位点，在sgGFP3序列上游引物5’端加上AgeI酶切位点，在下游引物的5’端加上EcoRI酶切位点重新合成sgGFP3的引物，将新合成的sgGFP3引物采用上述PCR程序进行退火，PLKO载体采用AgeI和EcoRI酶切后胶回收，与退火后新的sgGFP3进行连接，连接产物转化大肠杆菌，挑菌检测，酶切验证，即为新的PLKO-sgGFP3；再设计一对带有pLenti CRISPR-E载体序列的引物，将sgGFP3和PLKO上的U6启动子同时扩增出来，与pLenti CRISPR-E-sgGFP1进行同源重组，转入感受态细胞中，挑取单克隆进行电泳验证和测序鉴定。
7.根据权利要求6所述的CRISPR/Cas9双靶点靶向敲除目的基因载体构建方法，其特征在于：
sgGFP-PLKO-F3:CCGGCACCGCATGTGATCGCGCTTCTCGTGTTT；
sgGFP-PLKO-R3:AATTAAACACGAGAAGCGCGATCACATGCGGTG；
PLKO载体检测引物：
PLKO-F：TTCTTGGGTAGTTTGCAGTTT；
sgGFP-PLKO-R3：AATTAAACACGAGAAGCGCGATCACATGCGGTG；
重组引物为：
sg-GFP3CZ-F:TGTACAAGGAATTCGGAGGGCCTATTTCCC；
sg-GFP3CZ-R:TCAAGACCTAGCTAGAAACACGAGAAGCGC；
双靶点检测引物：
EGFP-F:GAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGG；
CRISPR-R:5'TTCACGGCGACTACTGCACT3'。
8.根据权利要求6所述的CRISPR/Cas9双靶点靶向敲除目的基因载体构建方法，其特征在于：重组反应为：Vector体积为4μL；DNA体积为1μL；5XCEIIBuffer体积为4μL；ExnaseII体积为2μL；ddH2O体积为9μL；Total体积为20μL。
9.根据权利要求6所述的CRISPR/Cas9双靶点靶向敲除目的基因载体构建方法，其特征在于：根据pLentiCRISPR-E载体设计同源重组引物，其中5’端15nt为载体序列，3’端15nt为EGFP的前后序列，通过PCR将EGFP从pLV-CMV-EGFP-Neo载体上扩增出来，本实验扩增的EGFP是来自于pLV-CMV-EGFP-Neo载体，同时将pLenti CRISPR-E采用EcoRI内切酶进行线性化后，将扩增EGFP条带和pLenti CRISPR-E载体酶切产物胶回收后进行同源重组反应；将重组产物转化至大肠杆菌感受态细胞中，挑取白色菌落进行菌落PCR以鉴定阳性克隆，将阳性克隆送去测序鉴定，测序正确的载体即为带EGFP荧光标签的pLenti CRISPR-E-EGFP载体。
10.根据权利要求6所述的CRISPR/Cas9双靶点靶向敲除目的基因载体构建方法，其特征在于：
同源重组引物：
CZEcoRI-GFP-F:5'AGTCGGTGCTTTTTTGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG3'；
CZEcoRI-GFP-R:5'CAAGACCTAGCTAGCGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC3'；
检测引物序列：
EcoRI-JC-F2:5'AGGCTAGTCCGTTATCAACTT3'；
CZEcoRI-GFP-R:5'CAAGACCTAGCTAGCGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC3'；
PCR反应体系：pLV-CMV-EGFP-NeoDNA体积为2μL；Forward primer(10μM)体积为1μL；Reverse primer(10μM)体积为1μL；Taq DNA Polymerase体积为25μL；ddH2O体积为21μL；Total体积为50μL；
PCR反应条件：
温度95℃，时间2时间min，循环数1；
温度95℃，时间30s，循环数35X；
温度58℃，时间30s，循环数35X；
温度72℃，时间30s，循环数35X；
温度65℃，时间5min，循环数1。
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