CN111471111A - 基于自噬机制介导线粒体靶向降解的嵌合分子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于自噬机制介导线粒体靶向降解的嵌合分子，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2或3或4所示。还公开了编码前述基于自噬机制介导线粒体靶向降解的嵌合分子的核酸分子，一种包含所述核酸分子的表达载体，以及所述嵌合分子、核酸分子、表达载体在靶向降解线粒体中的应用。本发明的介导线粒体靶向降解的嵌合分子，通过对胞内线粒体的靶向降解，证明在细胞水平实现对胞内细胞器的调控是可行的，这也为其它细胞器的靶向降解提供了参考；本发明嵌合分子在细胞水平实现对胞内线粒体的降解，为疾病的治疗提供药物研发思路；尤其是对于由PINK1‑Parkin通路突变而导致的神经退行性疾病也能提供一定的治疗思路。

Description

基于自噬机制介导线粒体靶向降解的嵌合分子及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于自噬机制介导线粒体靶向降解的嵌合分子及其应用。
背景技术
线粒体是真核细胞当中普遍存在的参与呼吸作用与能量代谢的细胞器，是细胞内各项生理活动最主要的能量来源。人体大部分细胞都通过线粒体的氧化磷酸化作用来获取维持自身代谢所需要的能量。
线粒体是一个处于不断动态变化的细胞器。线粒体通过融合和分裂，以及线粒体自噬过程，实现线粒体的自我更新，保证线粒体各项生理功能的正常进行。线粒体自噬是选择性细胞自噬的一种，主要负责真核细胞中功能不完整或受损伤线粒体的清除。线粒体自噬可以减少胞内受损伤线粒体的积累，对于维持细胞正常的生命活动具有重要作用，这对于能量需求较大的神经细胞来说尤为重要。因此，线粒体自噬介导的受损伤线粒体的清除与一些神经退行性疾病密切相关。例如在帕金森综合征患者(PD)中，通常伴随着PINK1或Parkin基因的突变，导致线粒体自噬不能正常进行，受损伤线粒体积累，氧化应激和能量供应障碍，最终造成神经元的死亡和PD的发生。在阿尔兹海默症患者(AD)中，增强Parkin的表达可以促进受损伤线粒体以选择性自噬的方式被清除，同时也可以降低胞内Aβ的水平和胞外老年斑的沉积。而在亨廷顿舞蹈症患者(HD)中则存在明显的线粒体功能性缺陷，如线粒体膜电位降低，膜流动性降低，呼吸功能减弱以及线粒体结构改变等。因此，降低胞内线粒体的受损程度以及胞内受损伤线粒体的水平，将有可能缓解这些由功能异常的线粒体积累而导致的神经退行性疾病的症状。
应对胞内线粒体损伤，目前主要是通过将抗氧化药物靶向至线粒体，来降低线粒体中活性氧的水平，或者通过细胞自噬的诱导，来促进细胞自噬过程对线粒体的降解。然而这些方法并不能实现对胞内线粒体水平的直接调控，传统药物的使用也会造成严重的副作用。加强对线粒体自噬分子机制的基础研究，并开发更为直接有效的靶向降解受损伤线粒体的方法，将有助于进一步明确线粒体自噬在神经退行性疾病中的作用，为由线粒体损伤而导致的神经退行性疾病的治疗提供新的药物开发的思路。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种基于自噬机制介导线粒体靶向降解的嵌合分子及其应用。
本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：
一种基于自噬机制介导线粒体靶向降解的嵌合分子，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2或3或4所示。
一种核酸分子，编码上述基于自噬机制介导线粒体靶向降解的嵌合分子。
进一步地，所述核酸分子的核苷酸序列为SEQ ID NO:5或6或7或8所示。
一种表达载体，包含上述的核酸分子。
一种前述的基于自噬机制介导线粒体靶向降解的嵌合分子在靶向降解线粒体中的应用。
在上述技术方案中，所述线粒体为受损伤的线粒体。
一种前述的核酸分子在靶向降解线粒体中的应用。
在上述技术方案中，所述线粒体为受损伤的线粒体。
一种前述的表达载体在靶向降解线粒体中的应用。
在上述技术方案中，所述线粒体为受损伤的线粒体。
目前的研究显示，线粒体自噬的发生主要受到PINK1-Parkin通路的调控。当线粒体受损而导致膜电位异常时，激酶PINK1(PTEN-induced kinase 1)能够稳定锚定在线粒体外膜表面，并通过对泛素E3连接酶Parkin的磷酸化，将其招募到线粒体表面。被招募至线粒体的Parkin则能够进一步促进线粒体外膜蛋白被泛素化修饰，被泛素化修饰的线粒体最终能够被p62(也称为SQSTM1蛋白)、NDP52、NBR1、OPTN或TAX1BP1等细胞自噬受体所识别，从而进入细胞自噬途径被降解。这些细胞自噬受体通常包含泛素相关结构域(ubiquitin-associated domain，UBA)和LC3相互作用序列(LC3-interacting region，LIR)，UBA负责自噬受体与泛素化修饰的线粒体结合，LIR负责自噬受体与自噬体膜蛋白Atg8/LC3结合。在线粒体自噬发生过程中，p62、NDP52等自噬受体在识别被泛素化的线粒体后，通过其C端的LIR结构与自噬体膜蛋白LC3相互作用，招募线粒体进入细胞自噬小体，最终自噬小体与溶酶体融合，内容物线粒体被溶酶体内的酸性水解酶降解。
本发明以线粒体为靶标，将线粒体靶向配体MTL(Mitochondria TargetingLigand)与自噬体膜蛋白LC3相互作用序列LIR以融合表达的方式进行连接，形成一种MTL-LIR结构的嵌合分子；MTL-LIR嵌合分子在细胞中表达后，能够通过MTL配体结合到线粒体上，同时该嵌合分子与自噬体膜蛋白LC3相互作用，将线粒体招募进入细胞自噬小体；最终，包裹线粒体的细胞自噬小体与溶酶体融合，被包裹的线粒体被溶酶体降解(作用原理如图1所示)。该嵌合分子的应用将提供一种新的策略，用于调控胞内线粒体的水平。
本发明实施例的主要研究过程是：
(1)MTL-LIR(线粒体靶向降解嵌合分子)表达载体的构建：
通过基因克隆技术将线粒体靶向配体MTL的核苷酸序列，以及自噬体膜蛋白LC3相互作用序列LIR的核苷酸序列连接到pHA-C1载体，构建线粒体靶向降解嵌合分子(MTL-LIR)的表达载体。
(2)MTL-LIR表达载体转染HEK293细胞或PINK1敲除的HEK293细胞：
将MTL-LIR的表达载体通过转染试剂转染细胞，并通过FCCP诱导线粒体损伤。
(3)Western blot检测MTL-LIR嵌合分子介导的线粒体降解水平：
选择Tim23作为评价线粒体降解水平的marker蛋白，通过Western blot检测Tim23的蛋白水平变化，来评价MTL-LIR嵌合分子介导线粒体降解的效率。
本发明的有益效果是：
(1)本发明成功设计出几种介导线粒体靶向降解的嵌合分子，通过对胞内线粒体的靶向降解，证明在细胞水平实现对胞内细胞器的调控是可行的，这也为其它细胞器的靶向降解提供了参考。
(2)本发明的介导线粒体靶向降解的嵌合分子，在细胞水平实现对胞内线粒体的降解，可以作为一种工具用于线粒体相关疾病研究，并为疾病的治疗提供药物研发思路。
(3)本发明的介导线粒体靶向降解的嵌合分子可以在不依赖于PINK1-Parkin通路的条件下发挥作用，这不仅对于非经典线粒体自噬的研究及利用具有重要意义，尤其是对于由PINK1-Parkin通路突变而导致的神经退行性疾病也能提供一定的治疗思路。
附图说明
图1是本发明的嵌合分子介导线粒体靶向降解的原理图。
图2是本发明的嵌合分子介导HEK293细胞中线粒体靶向降解的实验结果，其中，A：Western blot检测正常条件下线粒体降解水平；B：FCCP未诱导条件下线粒体降解水平的定量分析及显著性比较；C：Western blot检测FCCP诱导条件下线粒体降解水平；D：FCCP诱导条件下线粒体降解水平的定量分析及显著性比较；与对照组相比较，***代表P值小于0.001，**代表P值小于0.01，*代表P值小于0.05。
图3是本发明的嵌合分子介导PINK1敲除的HEK293细胞中线粒体靶向降解的实验结果，其中，A：Western blot检测FCCP诱导条件下线粒体降解水平；B：FCCP诱导条件下线粒体降解水平的定量分析及显著性比较；与对照组相比较，***代表P值小于0.001，**代表P值小于0.01。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
本发明所用主要材料和试剂来源如下：
HEK293及PINK1敲除的HEK293细胞系：本实验室保存；HEK293细胞系由重庆大学生命科学学院林正红老师赠送；PINK1敲除的HEK293细胞系由中南大学生命科学学院谭洁琼老师赠送。
pHA-C1质粒：美国Addgene质粒保藏中心。
pUC57-LIR-ActA、pUC57-NLRX1-LIR、pUC57-Tom20-LIR、pUC57-LIR-Mff质粒：LIR-ActA、NLRX1-LIR、Tom20-LIR及LIR-Mff嵌合分子的核酸序列，由武汉金开瑞生物工程有限公司合成，并由金开瑞公司克隆到pUC57载体质粒，pUC57载体质粒由金开瑞公司提供。
DMEM高糖培养基：Gibco公司，货号：C11995500BT。
青霉素/链霉素双抗溶液：Gibco公司，货号：15140-122。
细胞培养用血清：NTC特级胎牛血清，货号：SFBE。
转染试剂：Roche公司，X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent。
PCR扩增预混液：爱必梦(加拿大abm有限公司)，包含2×PCRBestaqTM MasterMixwith dye,货号：G464-dye。
限制性核酸内切酶、T4连接酶：Takara生物公司。
质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒：北京康为世纪生物科技有限公司。
ECL显影液：上海碧云天生物技术有限公司，货号：P0018FS。
BCA法蛋白浓度测定试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司，货号：P0010。
Cocktail蛋白酶抑制剂：美国MedChemExpress(MCE)生物科技公司，货号：HY-K0010。
FCCP(碳酰氰-4-三氟甲氧基苯腙，是一种线粒体氧化磷酸化解偶联剂，可破坏线粒体内膜，导致细胞线粒体形态异常、功能损伤)：美国MedChemExpress(MCE)生物科技公司，货号：HY-100410。
Tim23 antibody(Mouse)，货号：sc-514463，购于Santa Cruze Biotechnology；Actin antibody(Mouse)，货号：AF0003，购于上海碧云天生物技术有限公司；LC3A/Bantibody(Rabbit)，货号：12741，购于Cell Signaling Technology。
HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，货号：A0216；HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)，货号：A0208；均购于上海碧云天生物技术有限公司。
0.45μm的PVDF膜:GE公司。
PCR扩增用模板(嵌合分子的核酸序列)由武汉金开瑞生物工程有限公司合成，核酸引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
实施例1
一、MTL-LIR(线粒体靶向降解嵌合分子)表达载体的构建
本发明中共设计了4种MTL-LIR嵌合分子：LIR-ActA、NLRX1-LIR、Tom20-LIR及LIR-Mff。其中LIR-ActA由LIR与李斯特氏菌效应蛋白ActA313-338氨基酸序列融合表达而成，NLRX1-LIR由人源NLR家族蛋白NLRX11-86氨基酸序列与LIR融合表达而成，Tom20-LIR由人源线粒体外膜蛋白Tom201-34氨基酸序列与LIR融合表达而成，LIR-Mff由LIR与人源线粒体分裂蛋白Mff297-316氨基酸序列融合表达而成。
各嵌合分子的氨基酸序列分别为：
LIR-ActA嵌合分子的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：
Figure BDA0002442808060000051
NLRX1-LIR嵌合分子的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：
Figure BDA0002442808060000052
Tom20-LIR嵌合分子的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：
Figure BDA0002442808060000053
LIR-Mff嵌合分子的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)：
Figure BDA0002442808060000054
在以上氨基酸序列中，双下划线为线粒体靶向配体，波浪线为LIR序列，单下划线为间隔序列(linker)，由于嵌合分子的构建策略不同，导致linker序列有所差异。
以pHA-C1为载体框架，通过基因克隆技术在其C末端连接线粒体靶向配体(ActA313-338、NLRX11-86、Tom201-34、Mff297-316)的核苷酸序列，以及自噬体膜蛋白LC3相互作用序列LIR的核苷酸序列，构建线粒体靶向降解嵌合分子的表达载体(分别为pHA-LIR-ActA,pHA-NLRX1-LIR,pHA-Tom20-LIR以及pHA-LIR-Mff)，具体实验步骤如下：
(1)嵌合分子的核酸序列的获得
LIR-ActA、NLRX1-LIR、Tom20-LIR及LIR-Mff嵌合分子的核酸序列，由武汉金开瑞生物工程有限公司合成，并由金开瑞公司克隆到pUC57载体质粒，得到质粒pUC57-LIR-ActA、pUC57-NLRX1-LIR、pUC57-Tom20-LIR、pUC57-LIR-Mff，用作后续PCR反应的模板；嵌合分子的核酸序列如下：
核酸序列：
LIR-ActA(SEQ ID NO:5):
GAATTCTTCAGGAGGAGATGATGACTGGACCCATCTGTCTTCAAAAGAAGTGGGTACCGGCTCGGGCTCGCTGATCCTGGCCATGCTGGCCATCGGCGTGTTCAGCCTGGGCGCCTTCATCAAGATCATCCAGCTGCGCAAGAACAACTGAGGATCC
NLRX1-LIR(SEQ ID NO:6)：
CTCGAGCTATGAGGTGGGGCCACCATTTGCCCAGGGCCTCTTGGGGCTCTGGTTTTAGAAGAGCACTCCAGCGACCAGATGATCGTATCCCCTTCCTGATCCACTGGAGTTGGCCCCTTCAAGGGGAGCGTCCCTTTGGGCCCCCTAGGGCCTTTATACGCCACCACGGAAGCTCGGTAGATAGCGCTCCCCCACCCGGGAGGCATGGACGGCTGTTCCCCAGCGCCTCTGCAACTGAAGCTATACAGCGGCACCGCCGGAACCTGGGCTCGGGCTCGAATTCTTCAGGAGGAGATGATGACTGGACCCATCTGTCTTCAAAAGAAGTGTGAGGATCC
Tom20-LIR(SEQ ID NO:7)：
CTCGAGCTATGGTGGGTCGGAACAGCGCCATCGCCGCGGGCGTGTGCGGTGCCCTCTTCATAGGGTACTGCATCTACTTTGACCGCAAAAGACGAAGTGACCCCAACTTCGGATCGGGAGCAAGTGGAAGTCAAGCTTCGAATTCTTCAGGAGGAGATGATGACTGGACCCATCTGTCTTCAAAAGAAGTGTGAGGATCC
LIR-Mff(SEQ ID NO:8)：
GAATTCTTCAGGAGGAGATGATGACTGGACCCATCTGTCTTCAAAAGAAGTGGGTACCGGCGTCATGTATTCAATTACTGTAGCTTTCTGGCTGCTTAATAGCTGGCTCTGGTTTCGCCGCTGAGGATCC
(2)嵌合分子表达载体的构建
以质粒pUC57-LIR-ActA、pUC57-NLRX1-LIR、pUC57-Tom20-LIR、pUC57-LIR-Mff的质粒DNA(采用质粒DNA提取试剂盒提取)为模板，利用表1中的PCR扩增引物，扩增目标序列；双酶切目标序列，将其克隆进入pHA-C1质粒中；测序检测构建的表达载体是否正确。具体步骤如下：
①PCR反应体系：2×PCR扩增预混液12.5μl，上游引物F1μl，下游引物R1μl，模板1μl，加9.5μl ddH2O至终体积为25μl。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，反应32个循环；72℃延伸10min，PCR产物保存于4℃。
PCR扩增用的引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列设计如表1所示：
表1.MTL-LIR嵌合分子核酸序列的PCR扩增引物
Figure BDA0002442808060000071
采用质粒pUC57-LIR-ActA、pUC57-NLRX1-LIR、pUC57-Tom20-LIR、pUC57-LIR-Mff的质粒DNA和其对应的上、下游引物按照此PCR反应体系和反应程序分别进行PCR扩增。pUC57-LIR-ActA、pUC57-NLRX1-LIR、pUC57-Tom20-LIR、pUC57-LIR-Mff作为PCR扩增模板时采用的引物对分别为：LIR-ActA-F/LIR-ActA-R、NLRX1-LIR-F/NLRX1-LIR-R、Tom20-LIR-F/Tom20-LIR-R、LIR-Mff-F/LIR-Mff-R。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳检测片段大小后，用DNA纯化试剂盒进行纯化(按照产品说明书操作)，获得纯净的目的DNA片段。
②DNA片段与载体质粒的酶切、连接：将pHA-C1载体质粒与步骤①中PCR扩增获得目的DNA片段同时用相同的限制性核酸内切酶进行双酶切(酶切步骤参照产品说明书进行)。其中pHA-LIR-ActA和pHA-LIR-Mff质粒的构建采用EcoR I和BamH I进行双酶切，pHA-NLRX1-LIR和pHA-Tom20-LIR质粒的构建采用Xho I和BamH I进行双酶切。酶切后的DNA片段与载体片段经过DNA纯化后，用T4连接酶于16℃下过夜连接；连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，涂布于终浓度为50μg/ml的卡那霉素(Kan)抗性的LB固体平板上，37℃过夜培养；挑取单克隆进行菌落PCR验证；阳性克隆扩大培养后提取质粒，送往上海生工生物工程股份有限公司进行测序，测序正确的即是要构建的MTL-LIR表达载体：pHA-LIR-ActA,pHA-NLRX1-LIR,pHA-Tom20-LIR以及pHA-LIR-Mff。
二、MTL-LIR表达载体转染HEK293细胞或PINK1敲除的HEK293细胞
细胞培养：
本发明采用的细胞为HEK293及PINK1敲除的HEK29细胞系；所用培养基为DMEM高糖培养基(Gibco,货号：C11995500BT)，含有10％胎牛血清(NTC特级，货号：SFBE)、5％青链霉素双抗(Gibco，货号：15140-122)。培养条件为5％CO2，37℃恒温细胞培养箱。
细胞转染：
分别将各个MTL-LIR表达载体转染HEK293细胞或者PINK1敲除的HEK293细胞：提前将细胞按照每孔1×105的密度接种在6孔板中培养12h使其贴壁完全；取1μg的质粒DNA用100μl Opti-MEM培养基稀释，以pHA-C1空载体为对照；加入2μl的转染试剂到DNA稀释液中，室温静置20min以形成转染复合物；将转染复合物逐滴加入到含完全培养基的贴壁细胞培养皿中，并于24h后更换新鲜培养基。
FCCP诱导线粒体损伤：
在转染后36h，通过终浓度为20μM的FCCP(碳酰氰-4-三氟甲氧基苯腙)处理细胞12h，诱导线粒体损伤。FCCP是线粒体氧化磷酸化解偶联剂，事先用DMSO配制成终浓度为1mM的试剂，-20℃保存。
三、Western blot检测MTL-LIR嵌合分子介导的线粒体降解水平
(1)弃去六孔板中的细胞培养基，用预冷的PBS溶液洗两次。配制Cocktail蛋白酶抑制剂终浓度为1mM的RIPA裂解液，按照每孔100μl的体积加入RIPA裂解液，冰上裂解30min。对于FCCP诱导实验，FCCP诱导线粒体损伤步骤结束后，步骤同上。
(2)用细胞刮刮取细胞，转移细胞悬液至1.5ml离心管。冰上继续裂解30min后，15000rpm于4℃条件下离心20min。转移上清(蛋白样品)至1.5ml离心管，通过BCA法测定蛋白浓度(方法参照碧云天BCA法蛋白浓度测定试剂盒使用说明书)，并将各组蛋白样品稀释至相同浓度。
(3)Western blot检测目标蛋白的水平变化
SDS-PAGE：蛋白样品与5×SDS loading buffer(成分：250mM Tris-HCl pH6.8，10％SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-巯基乙醇)按照4:1的体积混匀，于98℃变性5min。按照每孔50μg蛋白样品进行分离胶浓度为13.5％的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。5％的浓缩胶采用80V恒压进行电泳，待蛋白样品跑至浓缩胶和分离胶界面时，将电压调至120V，待loading buffer刚好跑出凝胶时，终止电泳。
转膜、一抗孵育：0.45μm的PVDF膜提前用甲醇浸泡使其活化，按照Bio-Rad湿转转膜装置组装“三明治”结构，设置转膜条件为250mA,90min。转膜结束后，将PVDF膜用TBST(组分：10mM Tris，150mM NaCl，0.1％Tween-20，HCl调节pH至pH7.6)洗一次，然后用5％的脱脂牛奶室温封闭1h，脱脂牛奶用TBST配制。弃去封闭液，PVDF膜用TBST洗两次，并将PVDF膜置于一抗稀释液中4℃过夜孵育。一抗与一抗稀释液按照1:1000的比例稀释。一抗：Tim23antibody(Mouse)、Actin antibody(Mouse)、LC3A/B antibody(Rabbit)，以蛋白Actin、LC3A/B作为参照。
二抗孵育及显影：PVDF膜用TBST洗三次，每次10min。HRP标记的二抗与TBST按照1：3000的比例稀释，将PVDF膜置于二抗稀释液中室温孵育1h。其中一抗Tim23 antibody(Mouse)，Actin antibody(Mouse)对应二抗HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，一抗LC3A/Bantibody(Rabbit)对应二抗HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)。二抗孵育结束后，PVDF膜用TBST洗三次，每次10min。配制ECL显影液，通过Bio-RAD化学发光成像系统显影检测。
四、实验结果分析
实验结果显示，pHA-LIR-ActA，pHA-NLRX1-LIR，pHA-Tom20-LIR以及pHA-LIR-Mff在转染HEK293细胞后，Western blot并未检测到线粒体marker蛋白Tim23存在明显的降解趋势(如图2A和图2B所示)。然而在通过20μM的线粒体氧化磷酸化解偶联剂FCCP处理细胞12h之后，Western blot可以检测到线粒体marker蛋白Tim23的蛋白水平有了明显的降解趋势，其中以NLRX1-LIR和Tom20-LIR嵌合分子介导的线粒体降解趋势最为明显(如图2C和图2D所示)。同对照组(转染pHA-C1+FCCP处理)相比，ActA-LIR嵌合分子介导Tim23的蛋白水平(Tim23/Actin比值)下降17.88％，NLRX1-LIR嵌合分子介导Tim23的蛋白水平(Tim23/Actin比值)下降35.50％，Tom20-LIR嵌合分子介导Tim23的蛋白水平(Tim23/Actin比值)下降48.66％，LIR-Mff嵌合分子介导Tim23的蛋白水平(Tim23/Actin比值)下降25.96％。
相关研究显示，线粒体自噬的发生与线粒体自身体积的大小有关。线粒体在受到损伤之后，可以通过线粒体分裂产生体积更小的线粒体碎片，从而使其更容易进入线粒体自噬途径。本发明实施过程中发现，线粒体靶向嵌合分子在正常条件下并不能够介导线粒体的显著降解，而在FCCP诱导的线粒体损伤条件下，线粒体的水平则有了明显的下降。这表明，通过线粒体靶向嵌合体将自噬体膜蛋白LC3招募至线粒体表面，能够介导线粒体损伤情况下线粒体碎片的降解，降低胞内受损伤线粒体的水平。
由于经典的线粒体自噬受到PINK1-Parkin通路的调控，为了验证本发明中提出的介导线粒体靶向降解的嵌合分子是否依赖于PINK1-Parkin通路而发挥作用，本发明选择了PINK1敲除的HEK293细胞系作进一步验证。将pHA-LIR-ActA，pHA-NLRX1-LIR，pHA-Tom20-LIR以及pHA-LIR-Mff表达载体通过转染试剂转染PINK1敲除的HEK293细胞，以20μM的FCCP诱导线粒体损伤，并通过Western blot检测线粒体marker蛋白Tim23的蛋白水平。实验结果显示，即使在PINK1敲除的HEK293细胞中，NLRX1-LIR和Tom20-LIR嵌合分子仍然可以介导比较明显的线粒体降解(结果如图3A和3B所示)。同对照组(转染pHA-C1+FCCP处理)相比，ActA-LIR嵌合分子介导Tim23的蛋白水平(Tim23/Actin比值)下降16.54％，NLRX1-LIR嵌合分子介导Tim23的蛋白水平(Tim23/Actin比值)下降40.49％，Tom20-LIR嵌合分子介导Tim23的蛋白水平(Tim23/Actin比值)下降36.88％。
因此，本发明所提出的基于细胞自噬机制介导线粒体降解的嵌合分子NLRX1-LIR和Tom20-LIR可以在不依赖于PINK1-Parkin通路的条件下而发挥作用。这对于由PINK1突变而导致线粒体自噬缺陷的突变体中的线粒体水平的调控具有重要意义。
以上结果表明，本发明开发的嵌合分子，能够显著性的靶向降解细胞内受损伤线粒体的水平，在细胞水平实现对胞内线粒体水平的调控，这将为由线粒体损伤引起的神经退行性疾病的治疗提供新的药物研发方法。同时，也为胞内其它细胞器的靶向降解提供了新的思路。
序列表
<110> 重庆大学
<120> 基于自噬机制介导线粒体靶向降解的嵌合分子及其应用
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ser Gly Gly Asp Asp Asp Trp Thr His Leu Ser Ser Lys Glu Val Gly
1 5 10 15
Thr Gly Ser Gly Ser Leu Ile Leu Ala Met Leu Ala Ile Gly Val Phe
20 25 30
Ser Leu Gly Ala Phe Ile Lys Ile Ile Gln Leu Arg Lys Asn Asn
35 40 45
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Arg Trp Gly His His Leu Pro Arg Ala Ser Trp Gly Ser Gly Phe
1 5 10 15
Arg Arg Ala Leu Gln Arg Pro Asp Asp Arg Ile Pro Phe Leu Ile His
20 25 30
Trp Ser Trp Pro Leu Gln Gly Glu Arg Pro Phe Gly Pro Pro Arg Ala
35 40 45
Phe Ile Arg His His Gly Ser Ser Val Asp Ser Ala Pro Pro Pro Gly
50 55 60
Arg His Gly Arg Leu Phe Pro Ser Ala Ser Ala Thr Glu Ala Ile Gln
65 70 75 80
Arg His Arg Arg Asn Leu Gly Ser Gly Ser Asn Ser Ser Gly Gly Asp
85 90 95
Asp Asp Trp Thr His Leu Ser Ser Lys Glu Val
100 105
<210> 3
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Val Gly Arg Asn Ser Ala Ile Ala Ala Gly Val Cys Gly Ala Leu
1 5 10 15
Phe Ile Gly Tyr Cys Ile Tyr Phe Asp Arg Lys Arg Arg Ser Asp Pro
20 25 30
Asn Phe Gly Ser Gly Ala Ser Gly Ser Gln Ala Ser Asn Ser Ser Gly
35 40 45
Gly Asp Asp Asp Trp Thr His Leu Ser Ser Lys Glu Val
50 55 60
<210> 4
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Ser Gly Gly Asp Asp Asp Trp Thr His Leu Ser Ser Lys Glu Val Gly
1 5 10 15
Thr Gly Val Met Tyr Ser Ile Thr Val Ala Phe Trp Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Trp Leu Trp Phe Arg Arg
35
<210> 5
<211> 157
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gaattcttca ggaggagatg atgactggac ccatctgtct tcaaaagaag tgggtaccgg 60
ctcgggctcg ctgatcctgg ccatgctggc catcggcgtg ttcagcctgg gcgccttcat 120
caagatcatc cagctgcgca agaacaactg aggatcc 157
<210> 6
<211> 338
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctcgagctat gaggtggggc caccatttgc ccagggcctc ttggggctct ggttttagaa 60
gagcactcca gcgaccagat gatcgtatcc ccttcctgat ccactggagt tggccccttc 120
aaggggagcg tccctttggg ccccctaggg cctttatacg ccaccacgga agctcggtag 180
atagcgctcc cccacccggg aggcatggac ggctgttccc cagcgcctct gcaactgaag 240
ctatacagcg gcaccgccgg aacctgggct cgggctcgaa ttcttcagga ggagatgatg 300
actggaccca tctgtcttca aaagaagtgt gaggatcc 338
<210> 7
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctcgagctat ggtgggtcgg aacagcgcca tcgccgcggg cgtgtgcggt gccctcttca 60
tagggtactg catctacttt gaccgcaaaa gacgaagtga ccccaacttc ggatcgggag 120
caagtggaag tcaagcttcg aattcttcag gaggagatga tgactggacc catctgtctt 180
caaaagaagt gtgaggatcc 200
<210> 8
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gaattcttca ggaggagatg atgactggac ccatctgtct tcaaaagaag tgggtaccgg 60
cgtcatgtat tcaattactg tagctttctg gctgcttaat agctggctct ggtttcgccg 120
ctgaggatcc 130
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ccggaattct tcaggaggag atgatga 27
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cgcggatcct cagttgttct tgcgcag 27
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ccgctcgagc tatgaggtgg ggccacc 27
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cgcggatcct cacacttctt ttgaaga 27
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ccgctcgagc tatggtgggt cggaaca 27
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cgcggatcct cacacttctt ttgaaga 27
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ccggaattct tcaggaggag atgatga 27
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cgcggatcct cagcggcgaa accagag 27

Claims (10)

1.一种基于自噬机制介导线粒体靶向降解的嵌合分子，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2或3或4所示。
2.一种核酸分子，其特征在于：编码权利要求1所述基于自噬机制介导线粒体靶向降解的嵌合分子。
3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO:5或6或7或8所示。
4.一种表达载体，其特征在于：包含权利要求2或3所述的核酸分子。
5.一种权利要求1所述的基于自噬机制介导线粒体靶向降解的嵌合分子在靶向降解线粒体中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述线粒体为受损伤的线粒体。
7.一种权利要求2所述的核酸分子在靶向降解线粒体中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述线粒体为受损伤的线粒体。
9.一种权利要求3所述的表达载体在靶向降解线粒体中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述线粒体为受损伤的线粒体。
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