CN111471099A - MICA胞外区突变体及其筛选的方法、scFv-MICA融合抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

MICA胞外区突变体及其筛选的方法、scFv-MICA融合抗体及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111471099A
CN111471099A CN202010242409.XA CN202010242409A CN111471099A CN 111471099 A CN111471099 A CN 111471099A CN 202010242409 A CN202010242409 A CN 202010242409A CN 111471099 A CN111471099 A CN 111471099A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mica
mutant
scfv
nkg2d
recombinant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010242409.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN111471099B (zh
Inventor
陈治国
曾志红
袁依俊
范紫凌
徐文倩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Changsha University
Original Assignee
Changsha University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Changsha University filed Critical Changsha University
Priority to CN202010242409.XA priority Critical patent/CN111471099B/zh
Publication of CN111471099A publication Critical patent/CN111471099A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111471099B publication Critical patent/CN111471099B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种MICA胞外区突变体及其筛选方法、scFv‑MICA融合抗体及其制备方法和应用。MICA胞外区突变体在第24、33、69、112、126位点突变。筛选方法：构建突变MICA噬菌体文库、表达重组蛋白NKG2D‑Fc、噬菌体筛选等。scFv‑MICA融合抗体由scFv与MICA突变体以柔性肽链接。制备方法：构建融合抗体的重组基因；构建重组载体；转染感受态细胞，表达与纯化等。本发明的MICA胞外区突变体能高效诱导NKG2D介导的NK细胞的细胞毒作用，其与scFv构建的融合抗体，可利用肿瘤特异性抗体部分高效靶向肿瘤细胞的同时高亲和力突变MICA部分可介导NK细胞等有效杀伤靶细胞。

Description

MICA胞外区突变体及其筛选的方法、scFv-MICA融合抗体及其 制备方法和应用
技术领域
本发明涉及蛋白工程技术领域，尤其涉及一种MICA胞外区突变体及其筛选的方法、scFv-MICA融合抗体及其制备方法和应用。
背景技术
MICA-NKG2D介导的免疫监视：自然杀伤细胞(NK cell)是先天性免疫系统的重要组成部分，具有非特异性的免疫杀伤功能，是机体抗感染、抗肿瘤以及清除靶细胞的第一道防线。在NK细胞表面，NKG2D(natural killer cell receptor G2D)是一种重要的活化性受体，在其配体MHC-I(major histocompatibility complex-I)相关抗原分子MICA/MICB的刺激下可有效激活NK细胞，发挥非特异性的免疫杀伤作用。
MICA-NKG2D介导免疫监视的不足与解决方案：MICA在正常情况下集中表达于胃肠上皮细胞，应激、感染或癌变等条件下表达上调，引起免疫监视反应。最近研究发现，多种上皮肿瘤细胞均表达MICA分子，但肿瘤细胞可通过内化和脱落MICA等方式逃避免疫监视从而实现免疫逃逸。如果将MICA胞外区与肿瘤靶向抗体融合，利用肿瘤靶向抗体靶向肿瘤细胞，并借助MICA激活NK细胞，可有效提高NK细胞对肿瘤的杀伤作用，重建了NKG2D途径的免疫监视作用。然而，MICA与受体NKG2D的亲和力有限，限制了该途径免疫监视作用强度和抗肿瘤的效力。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种MICA胞外区突变体及其筛选的方法、scFv-MICA融合抗体及其制备方法和应用。MICA胞外区突变体是通过调取MICA胞外区基因序列，通过错配PCR扩增MICA基因，获得突变MICA基因文库后，利用噬菌体展示技术构建突变MICA噬菌体展示文库，以MICA配体NKG2D筛选获得了高亲和力突变MICA。scFv-MICA融合抗体是利用筛选获得的高亲和力MICA与肿瘤特异性抗体构建融合抗体，该融合抗体可利用肿瘤特异性抗体部分高效靶向肿瘤细胞的同时高亲和力突变MICA部分可介导NK细胞等有效杀伤靶细胞。
为了实现上述目的，本发明提供了一种MICA胞外区突变体，所述MICA胞外区突变体在MICA胞外区序列的第P24、A33、W69、K112、N126位点突变，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述MICA胞外区突变体的筛选方法，包括以下步骤：
S1、将MICA胞外区序列通过错配PCR扩增引入随机突变获得突变MICA基因文库；构建包含所述突变MICA基因文库的突变MICA噬菌体；
S2、构建NKG2D-Fc重组蛋白；
S3、将所述突变MICA噬菌体和所述NKG2D-Fc重组蛋白孵育，筛选与所述NKG2D-Fc重组蛋白具有高亲和力的MICA胞外区突变体。
上述的筛选方法，进一步的，所述S1步骤具体包括以下步骤：
S1-1、根据MICA胞外区序列设计引物对MICA-F和MICA-R，进行错配PCR扩增，获得突变MICA基因文库；
S1-2、将所述突变MICA基因文库插入载体中构建重组质粒；
S1-3、将所述重组质粒转化至感受态细胞获得转化子；
S1-4、通过氨苄青霉素筛选包含所述突变MICA基因文库的突变MICA噬菌体。
上述的筛选方法，进一步的，所述MICA-F的序列如SEQ ID NO.2所示，所述MICA-R序列如SEQ ID NO.3所示；所述错配PCR扩增的反应体系中含有5mmol/L的MgCl2。
上述的筛选方法，进一步的，所述S2步骤具有包括以下步骤：
S2-1、将NKG2D的DNA序列和Fc的DNA序列之间以柔性肽连接获得NKG2D-Fc重组基因；
S2-2、将所述NKG2D-Fc重组基因连接到载体上获得重组载体；
S2-3、将所述重组载体转化至感受态细胞，筛选可分泌表达NKF2D-Fc重组蛋白的菌株；
S2-4、提取所述菌株的发酵上清液中的NKG2D-Fc重组蛋白。
上述的筛选方法，进一步的，所述柔性肽为G4S柔性肽。
上述的筛选方法，进一步的，所述S2-3中所述筛选可分泌表达NKF2D-Fc重组蛋白的菌株具体步骤为：
S2-3-1、将所述重组载体转化至毕赤酵母X-33感受态细胞，用博来霉素筛选阳性克隆；
S2-3-2、将所述阳性克隆活化后，接种于BMGY培养基中培养，将培养的菌液离心获得菌体；
S2-3-3、将S2-3-2得到的所述菌体重悬于BMMY培养基中，添加甲醇诱导表达获得发酵液；
S2-3-4、将S2-3-3得到的所述发酵液进行Western Blot鉴定，获得目的蛋白阳性表达菌株；
S2-3-5、将S2-3-4得到的所述目的蛋白阳性表达菌株扩大发酵。
上述的筛选方法，进一步的，所述S3步骤具体为：
S3-1、第一轮筛选：配制梯度浓度的NKG2D-Fc重组蛋白；将浓度最高的NKG2D-Fc重组蛋白包被在免疫管中，用封闭液封闭后，将突变MICA噬菌体孵育获得菌体；
S3-2、第二轮至第五轮筛选：将上一轮获得的菌体经菌体裂解释放噬菌体，将所述噬菌体依次与浓度由高到低的NKG2D-Fc重组蛋白孵育获得菌体；
S3-3、将S3-2中获得的菌体与处于对数期的TG1细菌培养物混合培养，采用TYE平板筛选阳性克隆，获得与所述NKG2D-Fc重组蛋白具有高亲和力的MICA胞外区突变体。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种scFv-MICA融合抗体，包括scFv抗体与所述的MICA胞外区突变体，所述scFv抗体与所述的MICA胞外区突变体以柔性肽链接。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述scFv-MICA融合抗体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将scFv序列与MICA胞外区突变体序列融合，以柔性肽链接，构建scFv-mMICA融合抗体的重组基因；
(2)将所述重组基因插入载体构建重组载体；
(3)将所述重组载体转染至感受态细胞，表达、纯化获得scFv-MICA融合抗体。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的scFv-MICA融合抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种MICA胞外区突变体，MICA胞外区突变体与NKG2D亲和力相比野生型MICA胞外区提高一个数量级；能高效诱导NKG2D介导的NK细胞的细胞毒作用。
(2)本发明提供了一种MICA胞外区突变体的筛选方法，该方法技术成熟，操作难度和条件要求较低。
(3)本发明提供了一种scFv-MICA融合抗体，高亲和力MICA与肿瘤特异性抗体scFv构建融合抗体，该融合抗体可利用肿瘤特异性抗体部分高效靶向肿瘤细胞的同时高亲和力突变MICA部分可介导NK细胞等有效杀伤靶细胞。
(4)本发明提供了一种scFv-MICA融合抗体的制备方法，该方法技术成熟，操作难度和条件要求较低。
(5)本发明提供了一种scFv-MICA融合抗体在抗肿瘤方面的应用。本发明涉及的融合抗体scFv-mMICA，在体内外实验中可以特异性结合EGFR及NKG2D，可在体内外显著抑制肿瘤生长。研究表明，融合抗体scFv-mMICA相比scFv-wMICA(由野生型MICA胞外区与上述单链抗体融合而成)在体内外具有更显著的抑制肿瘤生长的作用。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例1中随机MICA胞外区突变体基因及噬菌体载体pCantab 5E的核酸电泳分析图。
图2为本发明实施例1中噬菌体文库构建及其有效库容计算的单克隆平板。
图3为本发明实施例1中NKG2D-Fc的构建的核酸电泳图，泳道M为marker，泳道1为NKG2D-Fc的融合基因，泳道2为载体pPICZα。
图4为本发明实施例1中重组载体载体pPICZα-NKG2D-Fc电导转化毕赤酵母X-33的结果图。
图5为本发明实施例1中毕赤酵母X-33工程菌诱导表达上清液的western blot结果，泳道M为marker，泳道1-3为不同单克隆工程菌诱导表达上清液。
图6为本发明实施例1中融合蛋白NKG2D-Fc的诱导表达与分离纯化图。图6A为不同单克隆毕赤酵母工程菌的诱导表达上清液SDS-PAGE电泳结果；图6B为融合蛋白NK2D-Fc纯化后SDS-PAGE电泳结果，泳道M为marker，泳道1为非还原电泳，泳道2为还原电泳。
图7是本发明实施例1中非竞争性ELISA实验对筛选获得的突变型和野生型MICA与NKG2D亲和力测定结果。
图8为本发明实施例2的融合抗体scFv-mMICA鉴定与纯化检测图。图8A描述scFv-mMICA诱导表达后western blot鉴定结果；图8B描述scFv-mMICA分离纯化后电泳结果。
图9为采用SPR技术测定本发明实施例2的融合抗体scFv-mMICA分别与EGFR和NKG2D亲和力的结果。
图10是本发明实施例3中scFv-mMICA体内外抗肿瘤作用图。图10A-B分别描述scFv-mMICA诱导下NK92细胞对A431和HT29的细胞毒作用(与PBS、scFv、scFv-wMICA对比)。
图11是本发明实施例4中scFv-mMICA动物模型中抗肿瘤作用图。图11A-B分别描述在A431和HT29肿瘤动物模型中，scFv-mMICA的抗肿瘤作用(与PBS、wMICA、mMICA、scFv、scFv-wMICA对比)。
具体实施方式
以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1：
一种本发明的MICA胞外区突变体，采用以下方法构建得到：
(1)突变MICA噬菌体展示库的构建：
1.1、从genbank上下载MICA胞外区序列，GeneID：100507436，Protein：CAA77031.1。
1.2、以步骤1.1的序列为模板通过错配PCR扩增MICA胞外区基因片段并引入随机突变获得突变，构建突变MICA基因文库；具体步骤为：
设计引物：
MICA-F(SEQ ID NO.2)：GAACCTCATTCTCTGC；
MICA-R(SEQ ID NO.3)：ACCAGATTTCAGATAGC。
PCR反应体系：
Figure BDA0002433002390000051
反应体系中Mg2+终浓度为5mmol/L。
PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，52℃复性30s，72℃延伸60s，30个循环，最后72℃延伸10min。
1.3、将步骤1.2中获得的PCR扩增产物经Not I和Sfi I双酶切后插入载体pCantab5E构建重组质粒。
图1是随机MICA胞外区突变体基因及噬菌体载体pCantab 5E的核酸电泳分析图，其中图A为MICA胞外区基因的核酸电泳图，MICA胞外区基因大小约为500bp。图B为噬菌体载体pCantab 5E基因的核酸电泳分析图，从图中可知，噬菌体载体pCantab 5E大小约为4500bp。
1.4、将步骤1.3构建的重组质粒以1.2kV/mm电压电导转化大肠杆菌ER2738得到转化子。
1.5、将转化子涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的抗性平板筛选阳性克隆。
1.6、将平板上生长的所有菌落都刮下来用生理盐水混匀形成含有随机突变MICA噬菌体文库的菌液，加入20％(体积百分含量)终浓度的甘油，分装后冻存于-80℃。
1.7、检测：将步骤1.6的菌液分别稀释至：0，10-2，10-4，10-6，10-8，10-10；通过个数计算库容量，DNA测序检测突变库的多样性，计算最终有效库容量。
图2是噬菌体文库构建及其有效库容计算的单克隆平板。从图2中最终计算出有效库容量达到4×1013。
(2)重组NKG2D双分子融合蛋白的构建表达：
2.1、从genbank网站上下载NKG2D与人源IgG1抗体Fc段序列，其中NKG2D的序号：CAA04925.1，人源IgG1抗体Fc段序列的序号：AAF03881.1。
2.2、将NKG2D和Fc之间以柔性肽GGGGS连接获得NKG2D-Fc重组蛋白。由于在正常生理状态下NKG2D以二聚体的结构与MICA特异性结合，本发明设计利用Fc实现NKG2D的二聚化。
2.3、构建重组载体；将步骤2.2获得的NKG2D-Fc重组蛋白和载体pPICZα，均经过ECOR1和NOT1双酶切，采用T4连接酶连接获得重组载体pPICZα-NKG2D-Fc。
图3描述NKG2D-Fc的构建的核酸电泳图，泳道M为marker，泳道1为NKG2D-Fc的融合基因，泳道2为载体pPICZα。从图3可知：成功获得目的基因NKG2D-Fc和载体pPICZα。
2.4、将步骤2.3的重组载体pPICZα-NKG2D-Fc经线性化后电导转化毕赤酵母X-33感受态细胞，用博来霉素(25μg/ml)筛选。
图4描述重组载体pPICZα-NKG2D-Fc电导转化毕赤酵母X-33的结果。从图中可知：重组载体pPICZα-NKG2D-Fc成功转化至毕赤酵母X-33。
2.5、从筛选培养基上挑取单菌落，接种于YPD(含25μg/ml Zeocin)液体培养基，30℃过夜活化。次日以1％接种量接于BMGY培养基中，培养至OD600约为1.5后，4℃，3000rpm离心10min去上清，获得菌体。
2.6、将步骤2.5中获得的菌体重悬于等体积的BMMY培养基中，每24小时添加0.5％的甲醇，诱导表达5天获得发酵液。通过4℃，8000rpm离心30min收集诱导表达的发酵液上清。
2.7、将步骤2.6中收集的发酵液上清进行Western Blot鉴定。具体鉴定方法为：4℃，250mA恒流转印1.5h，将蛋白转印到PVDF膜(购自Millipore)；转印结束，将膜在5％脱脂牛奶中室温封闭2h；PBS洗3遍，按1:8000比例加入HRP偶联的羊抗人IgG多克隆抗体，37℃孵育1h，TBS洗3遍，滴加ECL发光显色液，凝胶成像仪曝光拍照。
图5描述毕赤酵母X-33工程菌诱导表达上清液的western blot结果，泳道M为marker，泳道1-3为不同单克隆工程菌株诱导表达上清液。从图5中可以看出：成功获得可分泌表达目的蛋白的NKF2D-Fc的重组毕赤酵母菌株。
2.8、第五轮淘选：挑选Western Blot阳性菌株(表达量较高者)按上述方法扩大发酵，提取发酵上清液，缓慢加入硫酸铵饱和溶液至饱和度为50％，4℃静置过夜。4℃，8000rpm离心30min收集沉淀，沉淀溶于10％初始发酵液体积的Protein A上样缓冲液，0.22μm滤膜过滤样品用Protein A亲和柱层析纯化，得到NKG2D-Fc重组蛋白。
图6是融合蛋白NKG2D-Fc的诱导表达与分离纯化图。图6A中泳道1、2、3、4、5、6、7分别是不同重组毕赤酵母单克隆菌株的诱导发酵液上清SDS-PAGE电泳结果；图6B为融合蛋白NK2D-Fc纯化后SDS-PAGE电泳结果，泳道M为marker，泳道1为非还原电泳，泳道2为还原电泳。从图中可知：实验成功获得电泳纯重组蛋白NKG2D-Fc，其在非还原条件下呈同源二聚体。
(3)高亲和力MICA胞外区突变体的筛选及亲和力测定
3.1、第一轮筛选：
3.1.1、取4ml以PBS系列稀释的浓度为200g/ml NKG2D-Fc重组蛋白，加入到免疫试管中，4℃包被12小时。弃上清，以PBS迅速洗管3次。
3.1.2、免疫管中注满2％MPBS(含有2％脱脂牛奶的PBS)，37℃封闭2h。
3.1.3、弃封闭液，用PBS迅速冲洗免疫管3次。将步骤(1)中获得的随机突变MICA噬菌体文库菌液(1012～1013p.f.u)悬浮于4ml 2％MPBS并加入到免疫管中。室温反复倒转30min后，于室温静置2小时，弃上清。
3.1.4、将剩下的菌体以含有0.1％Tween-20的PBS洗管10次，再以PBS洗管10次去除去污剂。
3.2、第二轮筛选至第五轮筛选：依次将NKG2D-Fc重组蛋白，以PBS溶液分别稀释至浓度为100g/ml、50g/ml、25g/ml、12.5g/ml。按照第一轮筛选方法继续筛选，获得的菌体用含有0.1％Tween-20的PBS洗管20次；再以PBS洗管10次去除去污剂。(第二轮开始，是NKG2D-Fc重组蛋白与前一轮筛选的菌体裂解释放的噬菌体进行孵育)。
3.3、将免疫管中PBS吸干，加入1ml 100mM三乙胺，室温反复倒转孵育10min后，将噬菌体洗脱下来。
3.4、将0.5ml 1M Tris-HCl(pH7.4)迅速中和上述洗脱下来的噬菌体。
3.5、取9.25ml处于对数期的TG1细菌培养物与0.75ml洗脱下来的噬菌体混合，做为管一。另外一个免疫管，加入4ml处于对数期的TG1细菌培养物，做为管二。将管一和管二同时37℃水浴静置30min。
3.6、从管一和管二中分别取100μl，并分别做4～5次100倍系列稀释，然后将梯度稀释物涂布TYE平板(含有100μg/ml氨苄青霉素和1％葡萄糖)，37℃培养过夜。
3.7、将管一和管二中剩余的两种已感染噬菌体的TG1细菌培养物3300g，4℃离心10min，菌体沉淀重悬于1ml 2×TY培养基中，使用Nunc Bio-Assay Dish铺大型TYE平板(含有100μg/ml氨苄青霉素和1％葡萄糖)。30℃培养过夜或直至出现可见克隆。
3.8、非竞争性ELISA实验：
3.8.1、用pH为9.6的0.1M碳酸氢钠溶液分别包被纯化的梯度浓度(5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml)的MICA胞外区突变体和野生体(将最终筛选获得的MICA胞外区突变体和野生型MICA基因分别经大肠杆菌HB2151分泌表达纯化所得)，每孔100μl，4℃包被12h。
3.8.2、用PBST洗液洗板3次，充分去除液体后，加入5％脱脂牛奶100μl，37℃温育1h。
3.8.3、用PBST洗液洗板3次，充分去除液体后，加入100μl用％脱脂牛奶从40mg/L进行2倍稀释的纯化的NKG2D-Fc，37℃温育1h。
3.8.4、用PBST洗液洗板5次，充分去除液体，加入100μl酶标羊抗人Fc抗体(购自Sigma公司，1:2000稀释)，37℃温育1小时。
3.8.5、用PBST洗液洗板5次，充分去除液体，室温下加入显色液(购自碧云天，P0209)显色10min，2M硫酸终止反应，测定OD450。
结果判定：代入公式K＝(n-1)/2(nA’b-Ab)计算亲和常数，
式中Ab和A’b分别表示当MICA浓度为A和A’时，产生半数吸光值的抗体浓度(mol/L)，n＝A’/A。
两两比较，n＝2时，可得3个K值；
n＝4时，可得2个K值；
n＝8时，可得1个K值；
计算6个K值的平均值作为最终结果。
图7是非竞争性ELISA实验对筛选获得的突变型和野生型MICA与NKG2D亲和力测定结果。经计算，MICA胞外区突变体和野生体分别与NKG2D-Fc亲和力为4.3×10-7M和5.2×10-6M。
本实施例筛选，选择的是其中亲和力最高的突变株即图7中突变MICA-E3，具体突变位点为：P24、A33、W69、K112、N126。其氨基酸如SEQ ID NO.1所示，具体为：
EPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLPEVHLDGQPALRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGWGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYKDGELFLSQNLETENWTMPQSSRAQTLAMNIRNFLKEDA MKTKTHYHAM HADCLQELRRYLKSG(带下划线的即为突变位点)。
实施例2：
一种本发明的scFv-MICA融合抗体，采用以下方法构建得到：
(1)从NCBI上下载西妥昔单抗序列，调取其轻、重链可变区序列，重链为5T1M_D、轻链为5T1M_C。将轻、重可变区序列用柔性肽GGGGS链接构建单链抗体scFv。
(2)将scFv与实施例1的MICA胞外区突变体序列融合，以G4S柔性肽链接，构建scFv-mMICA融合抗体分子的重组基因。
(3)在重组基因中引入His标签，插入pPICZα构建重组载体。
(5)将重组载体转染毕赤酵母X-33，经博来霉素筛选、Western blot鉴定，扩大发酵后(上述方法同实施例1)得到融合抗体scFv-mMICA。
(6)采用镍柱亲和纯化融合抗体scFv-mMICA。
对比例1：
采用以上方法对野生型MICA(wMICA)进行同步操作，获得融合抗体scFv-wMICA。
实验1：对实施例2的融合抗体scFv-mMICA进行western blot鉴定和电泳检测。
图8是融合抗体scFv-mMICA鉴定与纯化检测结果图。图8A为步骤(5)中获得的scFv-mMICA诱导表达后western blot鉴定结果。图8A表明成功表达目的蛋白scFv-MICA。
图8B为步骤(6)中纯化后的scFv-mMICA电泳结果。表明成功纯化获得电泳纯目的蛋白scFv-MICA。
实验2：检测scFv-mMICA分别与EGFR或NKG2D-Fc之间的相互作用。
使用Biacore X100作为SPR依赖的生物传感器来检测scFv-mMICA分别与EGFR或NKG2D-Fc之间的相互作用，具体过程为：
A、将EGFR通过氨基偶联法固定在CM5芯片上，分别流过浓度为0、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40nmol/L的scFv-mMICA，获得结合-解离曲线，用BIA评估软件分析计算获得平衡解离常数KD约为8.1×10-9M。
B、将NKG2D-Fc通过氨基偶联法固定在CM5芯片上，分别流过浓度为0、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40nmol/L的scFv-mMICA，获得结合-解离曲线，用BIA评估软件分析计算获得平衡解离常数KD约为7.4×10-7M。
图9描述SPR技术测定scFv-mMICA分别与EGFR和NKG2D亲和力的结果。从图中可知：在体外条件下，融合蛋白scFv-mMICA能分别与EGFR和NKG2D结合。
实施例3：
一种实施例2的scFv-MICA融合抗体在体外抗肿瘤中的应用，采用的是基于比色法的CytoTox 96非放射性细胞毒性检测。CytoTox 96能定量测量乳酸脱氢酶(LDH)的含量。乳酸脱氢酶是一种水平稳定的胞质酶，当细胞裂解时被释放到培养基上清中，LDH可将四唑盐(INT)转化为红色的甲臜(formazan)。甲臜的生成量与裂解细胞数成正比，通过检测甲臜的浓度推导裂解细胞数。实验中使用的效应细胞是PBMC细胞或体外培养的FcγRIIIa修饰的NK92细胞，靶细胞是HT-29和A431。收集处于对数生长期的FcγRIIIa修饰的NK92细胞、HT-29和A431细胞。其具体应用方法为：
(1)检测板的设置：
1.1、NK92细胞自发LDH的释放：将用于实验的各密度的效应细胞加入培养基中，使终体积与实验组保持一致(用培养基补足)，并设置3个复孔，检测效应细胞自发的LDH的释放量。
1.2、实验组：96孔板的实验组(孔)加入一定数量的靶细胞，加入数量不同的效应细胞得到不同的效靶比(E/T)，保证各组终体积保持一致(100μl)，每组设置3个复孔，检测各效靶比下LDH的释放量。
另设：空白对照组：PBS；
对照一组：scFv；
对照二组：scFv-wMICA。按照实验组的方法进行相同实验。
1.3、靶细胞自发的LDH释放：将数量与实验组相同的靶细胞加入到含有培养基中，使终体积保持与实验组相同，每组设置3个复孔，检测LDH的释放量。
1.4、靶细胞的最大LDH释放：将数量与实验组相同的靶细胞加入到含有培养基中，每组设置3个复孔，每孔加入10μl的Lysis Solution(10×)，使得终体积保持与实验组相同，加入Lysis Solution后，培养基中将含有浓度约为0.9％的Triton X-100，37℃孵育45min，使细胞完全裂解，检测LDH的释放量。
1.5、裂解液校正对照：在90μl的培养基中加入10μl的Lysis Solution(10×)，设置3个复孔，检测相应波长下的吸光值。该对照组用于校正10μl的Lysis Solution(10×)引起的相应波长下的吸光值变化。
1.6、培养基背景：取100μl培养基加入板孔，设置3个复孔。该组对照用于校正培养基引起的背景吸光值。
1.7、将上述96孔板用平板离心机250g离心4min，保证效应细胞和靶细胞的接触充分。
(2)细胞培养及其上清液的获取：
2.1、将上述96孔板置于37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育4h(最低保证4h的孵育时间，以保证效应细胞与靶细胞的充分接触)。
2.2、靶细胞最大释放孔中Lysis Solution的加入应该收集上清液前45min加入，30min后显微镜下观察靶细胞是否裂解完全，如果靶细胞裂解不完全，可再加入适量的(5μl)LysisSolution，以确保靶细胞完全裂解。
2.3、孵育4h后，用平板离心机对孔板进行离心，离心转速为3000rpm，离心时间为5min。
(3)LDH的测量：
2.1、用排枪吸取50μl每孔上述孔板离心上清液，转移至新的96孔板的对应孔中。
2.2、37℃水浴锅融化Assay Buffer，取出12ml后，立即将剩下的Assay Buffer置于-20℃储存，融化后Assay Buffer尽量保持较低温度。
2.3、按50μl每孔的量将配好的底物加入上述含有离心上清的96孔板中，避光环境中，室温孵育30min。
2.4、每孔加入50μl Stop Solution终止反应。⑤室温静置1h后，于492nm处检测吸光值。
将检测到的各组实验492nm处吸光值取平均值，用所有靶细胞LDH释放孔、实验孔和效应细胞自发LDH释放孔的吸光值减去培养基背景吸光值。
用靶细胞最大LDH释放对照组的A492减去校正组的A492。
将上述结果(校正后)按照下述公式进行计算，所得值即为各效靶比下的细胞毒性：细胞毒性(％)＝(实验组-效应细胞自发释放-靶细胞自发释放)/(靶细胞最大释放量-靶细胞自发释放量)×100。
图10是scFv-mMICA体内外抗肿瘤作用图。图10A-B分别描述scFv-mMICA诱导下NK92细胞对A431和HT29的细胞毒作用(与PBS、scFv、scFv-wMICA对比)。从图中可知：scFv-mMICA诱导NK92细胞杀伤肿瘤细胞的作用显著强于PBS、scFv、scFv-wMICA。
实施例4：
一种实施例2的scFv-MICA融合抗体在抗肿瘤中的应用，其应用方法为：
(1)HT-29/A431裸鼠肿瘤模型的建立：选用6周龄雌性裸鼠建立裸鼠肿瘤模型。将5×106个对数生长期HT-29/A431细胞重悬于100ul PBS中，用注射器植入裸鼠左侧腋下，每日观察裸鼠成瘤情况。待裸鼠移植瘤生长至约100mm3后，将荷瘤小鼠随机分组，每组六只。
(2)实验：每组小鼠中，每两天1次尾静脉给药0.1mg PBS、wMICA、mMICA、scFv、scFv-wMICA和scFv-mMICA。每4天测量一次瘤体长(a)、宽径(b)，按公式：体积V(mm3)＝a×b2π/6计算出肿瘤体积V0。
图11是本发明实施例4中scFv-mMICA动物模型中抗肿瘤作用图。图11A-B分别描述在A431和HT29肿瘤动物模型中，scFv-mMICA的抗肿瘤作用与PBS、wMICA、mMICA、scFv、scFv-wMICA对比。从图中可知：scFv-mMICA在体内抗肿瘤作用显著强于PBS、wMICA、mMICA、scFv、scFv-wMICA。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
序列表
<110> 长沙学院
<120> MICA胞外区突变体及其筛选的方法、scFv-MICA融合抗体及其制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 175
<212> PRT
<213> 人类(human)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (24)..(126)
<223> 根据实验筛选的MICA胞外区突变体的突变位点
<400> 1
Glu Pro His Ser Leu Arg Tyr Asn Leu Thr Val Leu Ser Trp Asp Gly
1 5 10 15
Ser Val Gln Ser Gly Phe Leu Pro Glu Val His Leu Asp Gly Gln Pro
20 25 30
Ala Leu Arg Cys Asp Arg Gln Lys Cys Arg Ala Lys Pro Gln Gly Gln
35 40 45
Trp Ala Glu Asp Val Leu Gly Asn Lys Thr Trp Asp Arg Glu Thr Arg
50 55 60
Asp Leu Thr Gly Trp Gly Lys Asp Leu Arg Met Thr Leu Ala His Ile
65 70 75 80
Lys Asp Gln Lys Glu Gly Leu His Ser Leu Gln Glu Ile Arg Val Cys
85 90 95
Glu Ile His Glu Asp Asn Ser Thr Arg Ser Ser Gln His Phe Tyr Lys
100 105 110
Asp Gly Glu Leu Phe Leu Ser Gln Asn Leu Glu Thr Glu Asn Trp Thr
115 120 125
Met Pro Gln Ser Ser Arg Ala Gln Thr Leu Ala Met Asn Ile Arg Asn
130 135 140
Phe Leu Lys Glu Asp Ala Met Lys Thr Lys Thr His Tyr His Ala Met
145 150 155 160
His Ala Asp Cys Leu Gln Glu Leu Arg Arg Tyr Leu Lys Ser Gly
165 170 175
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> 根据实验要求而设计，做为扩增MICA胞外区基因片段的上游引物。
<400> 2
gaacctcatt ctctgc 16
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> 根据实验要求而设计，做为扩增MICA胞外区基因片段的下游引物。
<400> 3
accagatttc agatagc 17

Claims (10)

1.一种MICA胞外区突变体，其特征在于，所述MICA胞外区突变体在MICA胞外区序列的第P24、A33、W69、K112、N126位点突变，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种权利要求1所述MICA胞外区突变体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将MICA胞外区序列通过错配PCR扩增引入随机突变获得突变MICA基因文库；构建包含所述突变MICA基因文库的突变MICA噬菌体；
S2、表达NKG2D-Fc重组蛋白；
S3、将所述突变MICA噬菌体和所述NKG2D-Fc重组蛋白孵育，筛选与所述NKG2D-Fc重组蛋白具有高亲和力的MICA胞外区突变体。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述S1步骤具体包括以下步骤：
S1-1、根据MICA胞外区序列设计引物对MICA-F和MICA-R，进行错配PCR扩增，获得突变MICA基因文库；所述MICA-F的序列如SEQ ID NO.2所示，所述MICA-R序列如SEQ ID NO.3所示；
S1-2、将所述突变MICA基因文库插入载体中构建重组质粒；
S1-3、将所述重组质粒转化至感受态细胞获得转化子；
S1-4、通过氨苄青霉素筛选包含所述突变MICA基因文库的突变MICA噬菌体。
4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述错配PCR扩增的反应体系中含有5mmol/L的MgCl2。
5.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述S2步骤具有包括以下步骤：
S2-1、将NKG2D的DNA序列和Fc的DNA序列之间以柔性肽连接获得NKG2D-Fc重组基因；
S2-2、将所述NKG2D-Fc重组基因连接到载体上获得重组载体；
S2-3、将所述重组载体转化至感受态细胞，筛选可分泌表达NKF2D-Fc重组蛋白的菌株；
S2-4、提取所述菌株的发酵上清液中的NKG2D-Fc重组蛋白。
6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，所述S2-3中所述筛选可分泌表达NKF2D-Fc重组蛋白的菌株具体步骤为：
S2-3-1、将所述重组载体转化至毕赤酵母X-33感受态细胞，用博来霉素筛选阳性克隆；
S2-3-2、将所述阳性克隆活化后，接种于BMGY培养基中培养，将培养的菌液离心获得菌体；
S2-3-3、将S2-3-2得到的所述菌体重悬于BMMY培养基中，添加甲醇诱导表达获得发酵液；
S2-3-4、将S2-3-3得到的所述发酵液进行Western Blot鉴定，获得目的蛋白阳性表达菌株；
S2-3-5、将S2-3-4得到的所述目的蛋白阳性表达菌株扩大发酵。
7.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述S3步骤具体为：
S3-1、第一轮筛选：配制梯度浓度的NKG2D-Fc重组蛋白；将浓度最高的NKG2D-Fc重组蛋白包被在免疫管中，用封闭液封闭后，将突变MICA噬菌体孵育获得菌体；
S3-2、第二轮至第五轮筛选：将上一轮获得的菌体经菌体裂解释放噬菌体，将所述噬菌体依次与浓度由高到低的NKG2D-Fc重组蛋白孵育获得菌体；
S3-3、将S3-2中获得的菌体经菌体裂解释放噬菌体，将所述噬菌体与处于对数期的TG1细菌培养物混合培养，采用TYE平板筛选阳性克隆，获得与所述NKG2D-Fc重组蛋白具有高亲和力的MICA胞外区突变体。
8.一种scFv-MICA融合抗体，其特征在于，包括scFv抗体与权利要求1所述的MICA胞外区突变体，所述scFv抗体与权利要求1所述的MICA胞外区突变体以柔性肽链接。
9.一种权利要求8所述scFv-MICA融合抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将scFv序列与MICA胞外区突变体序列融合，以柔性肽链接，构建scFv-mMICA融合抗体的重组基因；
(2)将所述重组基因插入载体构建重组载体；
(3)将所述重组载体转染至感受态细胞，表达、纯化获得scFv-MICA融合抗体。
10.一种权利要求8所述的scFv-MICA融合抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。
CN202010242409.XA 2020-03-31 2020-03-31 MICA胞外区突变体及其筛选的方法、scFv-MICA融合抗体及其制备方法和应用 Active CN111471099B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010242409.XA CN111471099B (zh) 2020-03-31 2020-03-31 MICA胞外区突变体及其筛选的方法、scFv-MICA融合抗体及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010242409.XA CN111471099B (zh) 2020-03-31 2020-03-31 MICA胞外区突变体及其筛选的方法、scFv-MICA融合抗体及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111471099A true CN111471099A (zh) 2020-07-31
CN111471099B CN111471099B (zh) 2022-04-12

Family

ID=71749407

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010242409.XA Active CN111471099B (zh) 2020-03-31 2020-03-31 MICA胞外区突变体及其筛选的方法、scFv-MICA融合抗体及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111471099B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013117647A1 (en) * 2012-02-07 2013-08-15 Innate Pharma Mica binding agents
CN107964041A (zh) * 2016-10-20 2018-04-27 中国科学院广州生物医药与健康研究院 高稳定性和高亲和力的dmic及其制法
WO2019191243A1 (en) * 2018-03-27 2019-10-03 Xyphos Biosciences Inc. Modified a1-a2 domains of non-natural nkg2d ligands that bind non-natural nkg2d receptors

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013117647A1 (en) * 2012-02-07 2013-08-15 Innate Pharma Mica binding agents
CN107964041A (zh) * 2016-10-20 2018-04-27 中国科学院广州生物医药与健康研究院 高稳定性和高亲和力的dmic及其制法
WO2019191243A1 (en) * 2018-03-27 2019-10-03 Xyphos Biosciences Inc. Modified a1-a2 domains of non-natural nkg2d ligands that bind non-natural nkg2d receptors

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CANDICE S.E.LENGYEL等: "Mutations Designed to Destabilize the Receptor-Bound Conformation Increase MICA-NKG2D Association Rate and Affinity.", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
PIERRE TONNERRE等: "MICA Mutant A5.1 Influences BK Polyomavirus Reactivation and Associated Nephropathy After Kidney Transplantation", 《THE JOURNAL OF INFECTIOUS DISEASES》 *
SAMUEL H. HENAGER等: "Combining different design strategies for rational affinity maturation of the MICA-NKG2D interface", 《PROTEIN SCIENCE》 *
XUANJUN WANG等: "An six-amino acid motif in the a3 domain of MICA is the cancer therapeutic target to inhibit shedding.", 《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》 *
杜晓典等: "双特异性抗体mAb04-MICA对人白血病细胞K562的体内外抗肿瘤活性", 《中国药科大学学报》 *
王健等: "NKG2D配体表达及其介导NK细胞抗肝细胞癌作用的研究进展", 《细胞与分子免疫学杂志》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111471099B (zh) 2022-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112094342A (zh) 与SARS-CoV-2 RBD结合的羊驼源纳米抗体
KR101732552B1 (ko) 안정화된 면역글로불린가변도메인 선별방법 및 선별된 도메인의 응용
CN109970858B (zh) Cd22单域抗体、核苷酸序列及试剂盒
CN110003336B (zh) Pd-1单域抗体、核苷酸序列及试剂盒
CN108251431A (zh) 双载体系统及其用途
CN112028997B (zh) 抗ceacam5纳米抗体
CN111269318B (zh) 一种gapdh纳米抗体及其应用
CN114106187B (zh) 一种靶向ogt的特异性鲨鱼单域抗体及其制备方法和应用
CN111471099B (zh) MICA胞外区突变体及其筛选的方法、scFv-MICA融合抗体及其制备方法和应用
WO2022061706A1 (zh) 与SARS-CoV-2 RBD结合的羊驼源纳米抗体
CN110964113B (zh) 介导结合免疫球蛋白的单域抗体、由其构建的双功能抗体及其应用
CN111499744B (zh) 一种乳铁蛋白纳米抗体及制备方法、应用
CN112812180A (zh) 一种bax纳米抗体库及其制备方法与应用
CN110407939A (zh) 一种人源化抗psma单链抗体及其应用
CN112409485B (zh) 抗CEACAM6单域抗体、人源化单域抗体及其Fc融合蛋白和应用
CN114773459A (zh) 抗新型冠状病毒及其变异株的纳米抗体及其制备方法与应用
CN115975015A (zh) 一种小反刍兽疫病毒（pprv）f蛋白纳米抗体和纳米抗体的制备、纯化及中和试验方法
CN109762065B (zh) 针对河流弧菌的单域重链抗体Nb72
CN110982824A (zh) 拮抗pd-1的抗体类似物bp基因及蛋白和应用
CN114380905B (zh) 靶向SARS-CoV-2RBD蛋白的鲨源纳米抗体、制备方法和应用
CN114409792B (zh) 抗EphB4纳米抗体
CN114249820B (zh) 与SARS-CoV-2 RBD结合的羊驼源纳米抗体
WO2022061720A1 (zh) 与SARS-CoV-2 RBD结合的羊驼源纳米抗体
CN113912729B (zh) 针对sST2的单域抗体及其衍生蛋白和应用
CN108059678B (zh) 全人源抗pdl-1单链抗体b30及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant