CN111466485B - 一种α-半乳糖苷酶在酶解豆粕中的应用 - Google Patents

一种α-半乳糖苷酶在酶解豆粕中的应用 Download PDF

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Abstract

一种α‑半乳糖苷酶在酶解豆粕中的应用，所述α‑半乳糖苷酶由黑曲霉发酵制得，所述α‑半乳糖苷酶酶解豆粕的方法包括：将豆粕加入水中，加入第一pH调节剂将pH调节至4～5，再加入α‑半乳糖苷酶酶解液进行反应。利用本申请中的应用可以有效提高黑曲霉来源α‑半乳糖苷酶发酵水平，降低生产成本。而且可以有效降解抗营养成分，例如水苏糖和棉子糖，且可以提高酶解豆粕产品TCA‑N含量。

Description

一种α-半乳糖苷酶在酶解豆粕中的应用
技术领域
本发明属于酶应用技术领域，具体涉及一种α-半乳糖苷酶在酶解豆粕中的应用。
背景技术
豆粕是大豆经提油后得到的副产品，其蛋白质含量高、氨基酸组成平衡，是动物饲养中常用的一种优质植物性蛋白原料。豆粕中存在约5％-7％的以水苏糖、棉子糖为主的α-半乳糖苷类抗营养因子。α-半乳糖苷是由一个蔗糖分子与1个或2个半乳糖分子通过α-1,6-糖苷键连接而成的一种低聚寡糖类物质，具有良好的热稳定性，一般的加工方法不能使其失活，现一般通过微生物发酵，生产发酵豆粕降解α-半乳糖苷类抗营养因子。而α-半乳糖苷进入大肠后，经肠道微生物发酵利用后产生的挥发性脂肪酸和各种气体会使动物胃肠胀气、腹痛、腹泻、恶心和厌食等，同时，一些低聚糖还会刺激肠道蠕动，加快饲料通过消化道的速度以减少食糜在消化道停留的时间，影响了营养成分的消化、吸收和代谢，对动物体的健康和生产性能产生不良影响。
α-半乳糖甘酶能够催化水解水苏糖、棉子糖糖链末端的α-1,6-糖苷键，催化α-半乳糖苷类物质分解得到具有还原性末端的低聚寡糖和单糖。与发酵饲料相比酶解豆粕作为生物饲料的一种，因生产周期短、产品附加值高得到广泛关注，现被普遍应用于幼龄畜禽饲料中。但是目前利用酶解豆粕的方法，对α-半乳糖苷类抗营养因子的降解效果不佳。
发明内容
为了解决上述问题，本申请提出了一种α-半乳糖苷酶在酶解豆粕中的应用，所述α-半乳糖苷酶由黑曲霉发酵制得，所述α-半乳糖苷酶酶解豆粕的方法包括：将豆粕加入水中，加入第一pH调节剂将pH调节至4～5，再加入α-半乳糖苷酶酶解液进行反应。
优选地，加入α-半乳糖苷酶酶解液进行反应的反应条件为：在恒温振荡水浴槽中进行反应，反应温度为45～55℃、搅拌速率为180～200rpm，反应时间为15～17h。
优选地，还包括在豆粕水溶液中先加入第二pH调节剂将pH调节至7～8再加入复合蛋白酶进行反应的步骤。
优选地，按质量百分比计，所述复合蛋白酶的添加量为所述豆粕的0.5～1％，所述复合蛋白酶包括中性蛋白酶、碱性蛋白酶中的一种或多种。
优选地，加入复合蛋白酶进行反应的反应条件为：反应温度为45～55℃，搅拌速率为550～650rpm，反应时间为5～7h。
优选地，加入复合蛋白酶进行反应后，再加入第一pH调节剂将pH调节至4～5，加入NSP酶，再加入所述α-半乳糖苷酶酶液进行反应，反应条件为：反应温度为45～55℃，搅拌速率为550～650rpm，反应时间为15～17h。
优选地，按质量百分比计，所述NSP酶的添加量为所述豆粕的0.1～0.3％，所述NSP酶包括木聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶中的一种或多种。
优选地，所述α-半乳糖苷酶酶解液的加入量为4～20U/g。
优选地，所述豆粕与水的质量比为1：(3～5)。
优选地，所述第一pH调节剂为盐酸，所述第二pH调节剂为氢氧化钠。
优选地，还包括对豆粕进行预处理的步骤，所述预处理的步骤为将豆粕进行粉碎过30目筛。
优选地，所述黑曲霉制备α-半乳糖苷酶的步骤包括准备菌种及培养基、接种培养、提取得到α-半乳糖苷酶酶解液的步骤。
本申请能够带来如下有益效果：本申请中一种α-半乳糖苷酶在酶解豆粕中的应用可以有效提高黑曲霉来源α-半乳糖苷酶发酵水平，降低生产成本。而且可以有效降解抗营养成分，例如水苏糖和棉子糖，且可以提高酶解豆粕产品TCA-N含量。
在本申请中的生产工艺下，半乳糖苷酶发酵酶活达6500U/mL，液体产品酶活达30000U/mL，酶解豆粕生产过程中，添加量为16U/g时，水苏糖和棉子糖能被降解完全，同时协同复合蛋白酶和复合NSP酶作用，使酶解豆粕TCA-N含量提高约21％，提高了产品的附加值。
具体实施方式
在具体实施方式中各实施例中涉及到的性能参数指标的表征方法如下：
一、还原糖检测方法：将上清液稀释至相应倍数，取待测液1mL置于试管中(空白组加1mL水)，每管各加水10mL，混合均匀，加DNS 2.5mL，漩涡混合30s，沸水浴5min，冷却至室温，再依次加入水8.0mL，漩涡混合30s，以空白组归0，用1cm比色皿在540nm测定吸光度。在标准曲线上求出相应浓度(ug/mL)，计算其还原糖质量。
还原糖含量，％＝还原糖质量×100/[m1×(1-x)]
二、α-半乳糖苷酶酶活检测方法：直接用醋酸钠缓冲液进行逐级稀释至约0.02U/mL。将上述稀释酶液和底物对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖溶液于37℃下振荡10分钟预热。然后再吸取各溶液0.1mL，充分混合，于37℃恒温振荡10分钟，加入0.8mL碳酸钠溶液，振荡混匀，终止酶反应，以蒸馏水调零，在400nm处测定吸光度OD值。酶液空白用经过预热的酶液各0.1mL，然后加入0.8mL碳酸钠溶液，振荡混匀，再各加入0.1mL预热的底物对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖溶液于37℃振荡10分钟，在400nm处测定吸光度OD值。
Figure BDA0002504433380000031
式中：
X——试样中半乳糖苷酶的活力，u/mL；
AE——酶反应液的吸光值；
AB——酶空白液的吸光值；
K——标准曲线的斜率；
C0——标准曲线的截距；
n——试样的稀释倍数；
t——待测液与底物反应时间，10min；
m——试验的质量或体积，g或mL。
三、水苏糖棉子糖检测方法(HPAEC-PAD法)：称取2g样品，加入20ml纯水，超声破碎15min(400W)，之后70℃水浴1h，加入0.5g三氯乙酸，摇匀冰浴2h，转速12000r/min下离心5min，取上清，纯水稀释，进行离子色谱分析。
四、TCA-N检测方法：取4.00g粉末，加入15％TCA(三氯乙酸)溶液20ml，震荡混匀，静置5min后，4500rpm离心10min，取上清液上凯氏定氮仪测定蛋白质含量。
Figure BDA0002504433380000041
实施例1：
黑曲霉产α-半乳糖苷酶的制备，包括如下操作步骤：
(1)菌种及培养基准备
菌种：黑曲霉菌株，购于中国广东省微生物菌种保藏中心，菌株编号为GIM3.486；
培养基包括斜面肉汤培养基、扩大培养基、种子培养基和发酵培养基；
斜面培养：综合马铃薯培养基(PDA)，20％马铃薯1L，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，硫胺素8mg，琼脂20g，自然pH，118-122℃灭菌30-40min左右；
扩大培养基：葡萄糖1.3～1.7％，酵母膏0.8～1.2％，硫酸镁0.003～0.006％，氯化钾0.004～0.006％，磷酸二氢钾0.08～0.12％，硫酸亚铁0.04～0.06％，pH为4.3-4.7，118～122℃灭菌30-40min左右；
一级种子培养基：蛋白胨1.8～2.2％、牛肉膏0.8～1％，118～122℃灭菌30min左右；
二级种子培养基：玉米粉5～7％，硫酸铵0.3～0.4％，磷酸氢二钠0.04～0.06％，硫酸镁0.01～0.03％，硫酸亚铁0.01～0.02％，118～122℃灭菌30～40min左右；
发酵培养基：高温豆饼粉1.8～2.2％，葡萄糖4.0～4.4％，硫酸铵0.2～0.3％，硫酸镁0.03～0.05％，氯化钙0.22～0.27％，磷酸二氢钾0.3～0.4％，磷酸氢二钾1.2～1.3％，118～122℃灭菌30～40min左右；
(2)接种培养
斜面菌种于28℃恒温培养箱斜面培养约120h，接种至扩大培养基，制成液体种子，34±2℃扩大培养12h；将由扩大培养基培养的液体种子，按体积分数0.8～1.2％的接种量接种至一级种子罐，于32～36℃、通风量10～14L/min，自然pH条件下培养12h；继续按体积分数1.3～1.5％的接种量接种一级种子液至二级种子罐，于32～36℃、通风量50±5m3/h，自然pH条件下培养12h；最后，按体积分数9～11％的接种量接种二级种子液至发酵罐中，于32～36℃、通风量400±50m3/h，pH4.3～4.7条件下培养125h，检测发酵液酶活约为6500U/mL；
(3)提取
对步骤(2)的发酵液进行板框过滤、超滤浓缩及精滤，具体为：
发酵液中加入1％的珍珠岩和1％的10#硅藻土，搅拌30min，0.6MPa压力过滤机过滤至澄清，检测板框滤液酶活约为8000U/mL；0.4MPa管式超滤机超滤，通循环冷却水保持超滤过程温度低于25℃，超滤至浓缩液酶活为33000U/mL，加入2％的10#硅藻土，10％的氯化钠，0.2％的山梨酸钾，板框过滤至澄清，检测酶活约为30000U/mL。
利用黑曲霉发酵制备得到的α-半乳糖苷酶酶解液酶解豆粕的方法为：控制料水质量比为1：(3～5)，将豆粕加入水中，加入1mol/L的盐酸，调节pH至4.5，再加入4～20U/g的α-半乳糖苷酶酶解液，在恒温振荡水浴槽中于45～55℃、180～200rpm的条件下反应15～17h。
具体的实施条件如下：
表1实施例1中各个样品以及对比样品的制备条件
Figure BDA0002504433380000061
表征：对实施例1中各个制备得到的样品进行表征，表征手段包括：将实施例1中制备得到的样品取部分转入中离心管，4000r/min离心10min，取上清备用。
表2实施例1中各个样品以及对比样品的测试结果
样品编号 TCA-N增量(％) 还原糖增量(％)
1 2.23 2.96
2 2.41 5.64
3 2.60 7.68
4 2.87 10.13
5 3.06 10.07
对比例1 1.19 0.54
对比例2 2.08 7.78
对比例3 1.95 2.61
对比例4 2.01 4.57
根据表2中的测试结果可知，本实施例中豆粕经过酶解后，TCA-N增量可达到3％，还原糖增量可达到10％；对比例1与实施例1相比，如果不添加α-半乳糖苷酶，会大大影响TCA-N和还原糖的增量；对比例2与实施例4相比可知，利用黑曲霉比其他原料生产得到的α-半乳糖苷酶，在酶解豆粕中的应用效果更好，具体体现在豆粕酶解后的TCA-N和还原糖的增量有所提高；对比例3和对比例4的测试结果可知，反应温度对于酶解豆粕的影响较大，温度过低或者温度过高，都会影响酶解豆粕的效果，具体体现为，影响TCA-N和还原糖的量。
实施例2：
利用黑曲霉产α-半乳糖苷酶的制备方法如实施例1，本实施例中不再赘述。利用黑曲霉发酵制备得到的α-半乳糖苷酶酶解液酶解豆粕的方法为：对豆粕进行预处理的步骤，所述预处理的步骤为将豆粕进行粉碎后过30目筛；控制料水质量比为1：(3～5)，将豆粕加入水中，加入1mol/L的氢氧化钠调节pH至7.5，加入复合蛋白酶0.5％-1％，于45～55℃、550～650rpm的条件下反应5～7h，加盐酸调pH至4.5，加入NSP酶0.3％-0.5％，再加入4～20U/g的α-半乳糖苷酶酶解液，于45～55℃、550～650rpm的条件下反应15～17h。
具体的实施条件如下：
表3实施例2中各个样品以及对比样品的制备条件
Figure BDA0002504433380000071
另外，本实施例1-7中使用的复合蛋白酶以及NSP酶成分的具体成分如下表：
表4复合蛋白酶和NSP酶的成分列表
样品序号 复合蛋白酶成分 NSP酶成分
1 碱性蛋白酶30000U/g，中性蛋白酶60000U/g 无
2 碱性蛋白酶35000U/g，中性蛋白酶55000U/g 木聚糖酶30000U/g、甘露聚糖酶1000U/g、纤维素酶600U/g
3 碱性蛋白酶40000U/g，中性蛋白酶50000U/g 木聚糖酶15000U/g、甘露聚糖酶2000U/g、纤维素酶500U/g
4 碱性蛋白酶45000U/g，中性蛋白酶45000U/g 木聚糖酶18000U/g、甘露聚糖酶1500U/g、纤维素酶700U/g
5 碱性蛋白酶60000U/g，中性蛋白酶20000U/g 木聚糖酶10000U/g、甘露聚糖酶3000U/g、纤维素酶650U/g
6 碱性蛋白酶50000U/g，中性蛋白酶40000U/g 木聚糖酶10000U/g、甘露聚糖酶2500U/g、纤维素酶800U/g
7 碱性蛋白酶70000U/g，中性蛋白酶20000U/g 木聚糖酶12000U/g、甘露聚糖酶1500U/g、纤维素酶900U/g
表征：对实施例2中各个制备得到的样品进行表征，表征手段包括：将实施例2中制备得到的样品于80℃烘干6h，测试样品中TCA-N增量、还原糖增量。
表5实施例2中各个样品以及对比样品的测试结果
样品编号 TCA-N增量(％) 还原糖增量(％)
1 12.92 2.06
2 13.74 5.15
3 17.08 7.09
4 18.89 9.26
5 21.08 9.99
6 21.18 10.08
7 17.01 7.11
对比例1 10.27 7.02
对比例2 12.68 5.94
根据表5中的测试结果可知，加入复合蛋白酶和NSP酶后，使得豆粕中TCA-N的增量大大提高，TCA-N的增量可达21％，对比例1与实施例7相比，不添加复合蛋白酶会影响TCA-N和还原糖的增量；对比例2与实施例7相比，不添加α-半乳糖苷酶也会会影响TCA-N和还原糖的增量，由此可知，在酶解豆粕中，α-半乳糖苷酶、复合蛋白酶和NSP酶三者起到协同作用，提高了产品的附加值。
另外，再对本实施例中的样品1-5进行HPAEC-PAD法检测含量，如下表6所示，结果分析可知：经本方法进行酶解处理获得的酶解豆粕棉籽糖、水苏糖降解率达90％以上，消除棉籽糖、水苏糖的抗营养作用。
表6实施例2中各个样品棉籽糖、水苏糖降解效果测试结果
样品编号 棉籽糖降解率(％) 水苏糖降解率(％)
1 90.79 90.44
2 91.06 92.14
3 92.46 94.37
4 94.28 96.47
5 96.56 98.81
实施例3
在豆粕中加复合蛋白酶、复合NSP酶、α-半乳糖苷酶酶解处理烘干后备用。挑选25日龄仔猪100只，初始体重接近，随机分为两组，每组5个重复，每个重复10只，试验分组见表3，试验期15天。对照组饲喂正常日粮，实验组将日粮配方中的4％的发酵豆粕替换为4％的酶解豆粕。
表7仔猪(26-40d)生产性能相对比较，％
名称 期初体重，kg 期末体重，kg 日增重，g 采食量，g 腹泻率，％ 料重比
对照组 7.51 13.87 424 513 6.0 1.21
实验组 7.52 14.15 442 517 2.0 1.17
与对照组相比，实验组期末体重比对照组高280g，料重比降低了3.3％，腹泻率由6.0％降低为2.0％。
本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。
以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

Claims (10)

1.一种α-半乳糖苷酶在酶解豆粕中的应用，其特征在于，所述α-半乳糖苷酶由黑曲霉发酵制得，所述α-半乳糖苷酶酶解豆粕的方法包括：
（1）将豆粕加入水中，加入复合蛋白酶进行反应；
（2）加入复合蛋白酶进行反应后，加入第一pH调节剂将pH调节至4~5，加入NSP酶进行反应；
（3）加入NSP酶进行反应后，再加入所述α-半乳糖苷酶酶液进行反应；
所述NSP酶包括木聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶；
所述黑曲霉的菌株编号为GIM3.486；
所述木聚糖酶的用量为10000-30000U/g，甘露聚糖酶的用量为1000-3000U/g，纤维素酶500-900U/g。
2.根据权利要求1所述的一种α-半乳糖苷酶在酶解豆粕中的应用，其特征在于，加入α-半乳糖苷酶酶解液进行反应的反应条件为：在恒温振荡水浴槽中进行反应，反应温度为45~55℃、搅拌速率为180~200rpm，反应时间为15~17h。
3.根据权利要求1所述的一种α-半乳糖苷酶在酶解豆粕中的应用，其特征在于：还包括在豆粕水溶液中先加入第二pH调节剂将pH调节至7~8再加入复合蛋白酶进行反应的步骤。
4.根据权利要求1所述的一种α-半乳糖苷酶在酶解豆粕中的应用，其特征在于，按质量百分比计，所述复合蛋白酶的添加量为所述豆粕的0.5~1%，所述复合蛋白酶包括中性蛋白酶、碱性蛋白酶中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的一种α-半乳糖苷酶在酶解豆粕中的应用，其特征在于，加入复合蛋白酶进行反应的反应条件为：反应温度为45~55℃，搅拌速率为550~650rpm，反应时间为5~7h。
6.根据权利要求1所述的一种α-半乳糖苷酶在酶解豆粕中的应用，其特征在于：加入复合蛋白酶进行反应后，再加入第一pH调节剂将pH调节至4~5，加入NSP酶、α-半乳糖苷酶酶液进行反应，反应温度为45~55℃，搅拌速率为550~650rpm，反应时间为15~17h。
7.根据权利要求6所述的一种α-半乳糖苷酶在酶解豆粕中的应用，其特征在于：按质量百分比计，所述NSP酶的添加量为所述豆粕的0.1~0.3%。
8.根据权利要求1所述的一种α-半乳糖苷酶在酶解豆粕中的应用，其特征在于：所述α-半乳糖苷酶酶解液的加入量为4~20 U/g；所述豆粕与水的质量比为1：（3~5）。
9.根据权利要求3所述的一种α-半乳糖苷酶在酶解豆粕中的应用，其特征在于：所述第一pH调节剂为盐酸，所述第二pH调节剂为氢氧化钠。
10.根据权利要求1所述的一种α-半乳糖苷酶在酶解豆粕中的应用，其特征在于：还包括对豆粕进行预处理的步骤，所述预处理的步骤为将豆粕进行粉碎后过30目筛。
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