CN111465397A - 外显子18和/或外显子21突变型egfr的选择性抑制剂 - Google Patents

外显子18和/或外显子21突变型egfr的选择性抑制剂 Download PDF

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Abstract

本申请涉及治疗表达具有至少一种选自以下突变的EGFR的恶性肿瘤患者的抗肿瘤剂：外显子18的G719X突变、外显子18的E709X突变和外显子21的L861X突变，其中X表示任意氨基酸残基，所述抗肿瘤剂包含(S)‑N‑(4‑氨基‑6‑甲基‑5‑(喹啉‑3‑基)‑8,9‑二氢嘧啶并[5,4‑b]吲嗪‑8‑基)丙烯酰胺或其盐。

Description

外显子18和/或外显子21突变型EGFR的选择性抑制剂
技术领域
本发明涉及对抗癌症的抗肿瘤剂，其包含外显子18和/或外显子21突变型表皮生长因子受体(下文也称为“EGFR”)。
背景技术
EGFR为受体型的酪氨酸激酶，通过与为配体的表皮生长因子(下文也称为EGF)结合，在正常组织中发挥其生理功能，并有助于在上皮组织中的生长和凋亡抑制(NPL 1)。而且，EGFR基因的体细胞突变被称为致癌基因；例如，其中外显子19中的密码子746至750被删除(下文也称为“外显子19缺失突变”)的EGFR和其中外显子21中的密码子858编码的亮氨酸突变为精氨酸(下文也称为“L858R突变”)的EGFR，不断诱导EGF非依赖性激酶活性，并有助于癌细胞的生长和存活(NPL 2)。在东亚的30至50％的非小细胞肺癌中观察到这些突变。在欧洲和美国，约有10％的非小细胞肺癌也观察到了突变，并且被认为是引起癌症的原因之一(NPL 3)。
因此，积极开展了EGFR抑制剂作为抗肿瘤剂的研究和开发，并将其引入了各种EGFR突变阳性肺癌的治疗中(NPL 2和NPL 4)。吉非替尼(gefitinib)、埃罗替尼(erlotinib)和阿法替尼(afatinib)已被用作针对外显子19缺失突变型和L858R突变型EGFR阳性肺癌的治疗剂。外显子19缺失突变和L858R突变占EGFR突变的90％。而且，已知使用这些药物治疗过程中出现了获得性耐药，其中50％是由耐药突变EGFR引起的，其中外显子20的密码子790从苏氨酸变为甲硫氨酸(下文也称为“T790M突变”)。为治疗具有这种突变的肿瘤，奥西替尼(osimertinib)已被用作治疗剂。因此，针对具有主要EGFR突变的肺癌患者，正在确立使用EGFR抑制剂的治疗方法。
另一方面，目前，对于一些罕见的EGFR突变，如外显子18的点突变或缺失突变、外显子21的点突变等，尚未建立使用EGFR抑制剂的治疗方法；并且据报道，这些突变型EGFR的药物敏感性根据突变类型而不同(NPL 4)。例如，具有点突变(其中由外显子18的密码子719编码的甘氨酸被任意氨基酸取代，下文也称为“G719X突变”)的肺癌或其中由外显子21的密码子861编码的亮氨酸被谷氨酰胺取代(下文也称为“L861Q突变”)的肺癌对于吉非替尼、埃罗替尼和阿法替尼的敏感性低于为药物敏感性突变的外显子19缺失突变和L858R突变对所述药物的敏感性。此外，有报道称通过给予治疗剂量的阿法替尼、吉非替尼和埃罗替尼的常见副作用为皮肤疾病和消化道疾病。普遍认为，这些副作用可归因于治疗剂抑制了正常组织(如皮肤或消化道)中表达的野生型EGFR的功能(NPL 1)；出于减少副作用的考虑，期望开发一种与肿瘤组织中表达的突变型EGFR相比特征在于对正常组织的野生型EGFR具有较低抑制活性的抑制剂。
因此，开发对外显子18和外显子21突变型EGFR具有高抑制活性，并且与野生型EGFR相比对突变型EGFR具有高选择性的药物，预期该药物以低于引起皮肤或消化道副作用的剂量抑制具有突变型EGFR的肺癌细胞的生长，从而有助于延长突变型EGFR阳性癌症患者(针对该类型癌症尚未建立治疗方法)的寿命或增加其QOL。此外，预期对T790M(其为针对使用EGFR抑制剂的治疗的获得性抗性突变)具有高抑制活性的药物，其在使用EGFR抑制剂对抗为新生突变的外显子18或外显子21突变型EGFR的治疗过程中减少获得性抗性的表达频率，因此有望有助于延长癌症患者的寿命。
引用列表
专利文献
PTL 1：WO2015/175632A1
PTL 2：WO2015/025936A1
非专利文献
NPL 1:Nat.Rev.Cancer,Vol.6,pp.803-812(2006)
NPL 2:Nature Medicine,Vol.19,pp.1389-1400(2013)
NPL 3:Nat.Rev.Cancer,Vol.7,pp.169-181(2007)
NPL 4:Lancet Oncol.Vol.13,e.23-31(2012)
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种不会引起对野生型EGFR的抑制并因此引起较小副作用的抗肿瘤剂，其作为可确保对外显子18和/或外显子21突变型EGFR具有高选择性的抑制剂，而先前已知的EGFR抑制剂对该突变型EGFR的治疗效果不足。
解决问题的方案
本发明发明者进行了深入研究，发现外显子18和/或外显子21突变型EGFR为治疗癌症的合适的靶标，且通常用于治疗的EGFR抑制剂在外显子18和/或外显子21突变型EGFR之间具有较弱的选择性。而且，本发明者还证实本发明的化合物对外显子18和/或外显子21突变型EGFR表现出优异的选择性和肿瘤生长抑制作用。由于该发现，本发明者完成了本发明。
本发明包括以下实施方案。
项1.
抗肿瘤剂，其用于治疗恶性肿瘤患者，所述患者表达具有至少一种选自以下的突变的EGFR的：外显子18的G719X突变、外显子18的E709X突变和外显子21的L861X突变，其中X表示任意氨基酸残基，所述抗肿瘤剂包含S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐。
项2.
根据项1的抗肿瘤剂，其中所述外显子18突变为至少一种选自以下的突变：G719A、G719S、G719C、E709K和E709A。
项3.
根据项1或2抗肿瘤剂，其中所述外显子21突变为L861Q。
项4.
根据项1至3任一项的抗肿瘤剂，其中所述EGFR进一步具有T790M突变。
项5.
治疗恶性肿瘤患者的方法，包括向恶性肿瘤患者施用(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐的步骤，所述患者表达具有至少一种选自以下的突变的EGFR：外显子18的G719X突变、外显子18的E709X突变、和外显子21的L861X突变，其中X表示任意氨基酸残基。
项6.
根据项5的方法，其中所述外显子18突变为至少一种选自以下的突变：G719A、G719S、G719C、E709K和E709A。
项7.
根据项5或6的方法，其中所述外显子21突变为L861Q。
项8.
根据项5至7任一项的的方法，其中所述EGFR进一步具有T790M突变。
项9.
(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐，其用于治疗恶性肿瘤患者，所述患者表达具有至少一种选自以下的突变的EGFR：外显子18的G719X突变、外显子18的E709X突变、和外显子21的L861X突变，其中X表示任意氨基酸残基。
项10.
根据项9的(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐，其中所述外显子18突变为至少一种选自以下的突变：G719A、G719S、G719C、E709K和E709A。
项11.
根据项9或10的(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐，其中所述外显子21突变为L861Q。
项12.
根据项9至11任一项的的(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐，其中所述EGFR进一步具有T790M突变。
项13.
(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐用于治疗恶性肿瘤患者的用途，所述患者表达具有至少一种选自以下的突变的EGFR：外显子18的G719X突变、外显子18的E709X突变、和外显子21的L861X突变，其中X表示任意氨基酸残基。
项14.
根据项13的用途，其中所述外显子18突变为至少一种选自以下的突变：G719A、G719S、G719C、E709K和E709A。
项15.
根据项13或14的用途，其中所述外显子21突变为L861Q。
项16.
根据项13至15任一项的用途，其中所述EGFR进一步具有T790M突变。
项17.
(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐在制备用于治疗恶性肿瘤患者的药物中的用途，所述患者表达具有至少一个选自以下的突变的EGFR：外显子18的G719X突变、外显子18的E709X突变、和外显子21的L861X突变，其中X表示任意氨基酸残基。
项18.
根据项17的用途，其中所述外显子18突变为至少一种选自以下的突变：G719A、G719S、G719C、E709K和E709A。
项19.
根据项17或18的用途，其中所述外显子21突变为L861Q。
项20.
根据项17至19任一项的用途，其中所述EGFR进一步具有T790M突变。
项21.
药物组合物，其包含(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐和药学上可接受的载体，其用于治疗恶性肿瘤患者，所述患者表达具有至少一种选自以下的突变的EGFR：外显子18的G719X突变、外显子18的E709X突变、和外显子21的L861X突变，其中X表示任意氨基酸残基。
项22.
根据项21的药物组合物，其中所述外显子18突变为至少一种选自以下的突变：G719A、G719S、G719C、E709K和E709A。
项23.
根据项21或22的药物组合物，其中所述外显子21突变为L861Q。
项24.
根据项21至23任一项的药物组合物，其中所述EGFR进一步具有T790M突变。
项25.
在恶性肿瘤患者中预测使用抗肿瘤剂进行化疗的治疗效果的方法，该抗肿瘤剂包含(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐作为活性成分，该方法包括以下步骤(1)和(2):
(1)检测获自患者的生物样品中包含的EGFR基因存在或不存在突变的步骤；和
(2)当步骤(1)中的检测结果发现EGFR基因具有至少一种选自以下的突变时，预测该化疗非常有可能对患者显示出充分的治疗效果的步骤，所述突变为：外显子18的G719X突变、外显子18的E709X突变、和外显子21的L861X突变，其中X表示任意氨基酸残基。
项26.
根据项25的方法，其中所述外显子18突变为至少一种选自以下的突变：G719A、G719S、G719C、E709K和E709A。
项27.
根据项25或26的方法，其中所述外显子21突变为L861Q。
项28.
根据项25至27任一项的方法，其中所述EGFR进一步具有T790M突变。
项29.
治疗恶性肿瘤患者的方法，包括以下步骤(1)至(3):
(1)检测获自患者的生物样品中包含的EGFR基因存在或不存在突变的步骤；
(2)当步骤(1)中的检测结果发现EGFR基因具有至少一种选自以下的突变时，预测使用抗肿瘤剂进行化疗非常有可能对患者显示出充分的治疗效果的步骤，所述抗肿瘤剂包含(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐作为活性成分，所述突变为：外显子18的G719X突变、外显子18的E709X突变、和外显子21的L861X突变，其中X表示任意氨基酸残基；和
(3)向恶性肿瘤患者施用(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐的步骤，所述恶性肿瘤患者在步骤(2)中被预测非常有可能对使用抗肿瘤剂进行的化疗有充分响应，所述抗肿瘤剂包含(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐作为活性成分。
项30.
根据项29的方法，其中所述外显子18突变为至少一种选自以下的突变：G719A、G719S、G719C、E709K和E709A。
项31.
根据项29或30的方法，其中所述外显子21突变为L861Q。
项32.
根据项29至31任一项的方法，其中所述EGFR进一步具有T790M突变。
发明的有益效果
本发明的抗肿瘤剂对外显子18和/或外显子21突变型EGFR具有高选择性。因此，本发明的抗肿瘤剂可用于提供对恶性肿瘤患者发挥优异治疗作用的抗肿瘤剂，所述患者表达具有外显子18和/或外显子21突变的EGFR，对于所述患者，之前已知的EGFR抑制剂的治疗作用不足。
本发明还用于提供治疗恶性肿瘤患者的方法，所述患者表达具有外显子18和/或外显子21突变的EGFR。
与野生型EGFR相比，先前已知的EGFR抑制剂对外显子18和外显子21突变型EGFR的选择性低；因此，用于确保抗肿瘤作用的剂量与引起源自野生型EGFR抑制的副作用(皮肤疾病、消化道疾病等)的剂量之间的差异很小。因此，先前已知的EGFR抑制剂难以发挥足够的治疗效果。相反，由于本发明的抗肿瘤剂对外显子18和外显子21突变型EGFR具有高选择性，因此可以增加剂量而不会引起源自野生型EGFR抑制的副作用。因此，本发明的抗肿瘤剂对表达具有外显子18和/或外显子21突变的EGFR的恶性肿瘤患者发挥优异的治疗作用。
另外，在存在T790M突变的情况下，本发明的抗肿瘤剂对外显子18和外显子21突变型EGFR表现出高抑制活性，所述T790M突变是在外显子20区域中的获得性抗性突变。因此，本发明的抗肿瘤剂对于恶性肿瘤患者发挥优异的治疗效果，所述患者由于获得性抗性突变(使用现有抗肿瘤剂引起)而对现有药物应答低。
而且，本发明的抗肿瘤剂还可用于在使用EGFR抑制剂对抗外显子18或外显子21突变型EGFR(新生突变)的治疗过程中减少获得性抗性的表达频率，这是因为即使在存在T790M突变的情况下，本发明的抗肿瘤剂对外显子18和外显子21突变型EGFR的抑制活性也很高，该T790M突变是在外显子20区域中的获得性抗性突变。
附图简述
图1示出了皮下移植有表达G719A突变型EGFR的细胞系的小鼠模型的肿瘤体积(在下文中可以称为“TV”)以测量化合物A的抗肿瘤作用。
图2示出了给药化合物期间皮下移植有表达G719A突变型EGFR的细胞系的小鼠模型的体重变化，以测量化合物A的毒性。
图3示出了皮下移植有表达G719A+T790M突变型EGFR的细胞系的小鼠模型的肿瘤体积，以测量化合物A的抗肿瘤作用。
图4示出了给药化合物期间皮下移植有表达G719A+T790M突变型EGFR的细胞系的小鼠模型的体重变化，以测量化合物A的毒性。
实施方案的描述
下面详细解释在本说明书中使用的本发明范围内的各种定义的优选实例。
在本说明书中，“EGFR”是指人表皮生长因子受体蛋白，且也称为ErbB-1或HER1。
在本说明书中，“野生型EGFR”是指无体细胞突变的EGFR，其为包含SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列的蛋白质(GenBank登录号：NP_005219.2)。
在本说明书中，“外显子18”是指野生型EGFR(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列中的688-728区。
在本说明书中，“外显子18突变”是指野生型EGFR(SEQ ID NO：1)的外显子18区中的氨基酸的点突变。优选的外显子18突变为在外显子18区具有1个氨基酸取代的点突变或缺失突变。更优选地，外显子18突变为E709X，其为其中由外显子18的密码子709编码的谷氨酸被任意氨基酸取代的点突变；或G719X，其为其中由外显子18的密码子719编码的甘氨酸被任意氨基酸取代的点突变。更具体地，E709X的优选实例包括E709K，其为其中由外显子18区中的密码子709编码的谷氨酸被赖氨酸取代的点突变；和E709A，其为其中由外显子18区中的密码子709编码的谷氨酸被丙氨酸取代的点突变。G719X的优选实例包括G719A，其为其中由外显子18区中的密码子719编码的甘氨酸被丙氨酸取代的点突变；G719S，其为其中由外显子18区中的密码子719编码的甘氨酸被丝氨酸取代的点突变；和G719C，其为其中由外显子18区中的密码子719编码的甘氨酸被半胱氨酸取代的点突变。在这些之中，特别优选G719A。
在本发明中，“外显子21”是指野生型EGFR(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列中的824-875区。
在本说明书中，“外显子21突变”是指野生型EGFR(SEQ ID NO：1)的外显子21区中的氨基酸的点突变。优选的外显子21突变为在外显子21区具有1个氨基酸取代的点突变。更优选地，外显子21突变为L861X，其为其中由外显子21区中的密码子861编码的亮氨酸被任意氨基酸取代的点突变。更具体地，优选L861Q，其为其中由外显子21区中的密码子861编码的亮氨酸被谷氨酰胺取代的点突变。
在本发明中，“外显子18和/或外显子21突变”包括“外显子18突变”、“外显子21突变”和“外显子18和外显子21突变”。
在本发明中，“点突变”是指引起一个或多个(例如，约1至10，优选约1至5，更优选约1、2或3个)氨基酸残基的取代、插入或缺失的突变；并且可以包括如核酸的框内插入和/或缺失突变。
“具有外显子18和/或外显子21突变的EGFR”包括“具有外显子18突变的EGFR”、“具有外显子21突变的EGFR”和“具有外显子18和外显子21突变的EGFR”。
在本说明书中，“具有外显子18突变的EGFR”是指具有至少一种外显子18突变的EGFR。EGFR可具有两个或更多个不同的外显子18突变，优选具有单一外显子18突变。而且，EGFR也可具有除了外显子18突变之外的突变(如外显子19缺失突变、L858R突变、或L790M突变)。
在本说明书中，“具有外显子21突变的EGFR”是指具有至少一种外显子21突变的EGFR。EGFR可具有两个或更多个不同的外显子21突变，且优选具有单一外显子21突变。而且，EGFR也可具有除了外显子21突变之外的突变(如外显子19缺失突变、L858R突变或L790M突变)。
而且，具有外显子18和/或外显子21突变的EGFR可进一步具有T790M突变。T790M为外显子20区中的获得性抗性突变。已知T790M是通过使用现有的EGFR抑制剂产生的。T790M的获得通常会降低现有药物针对恶性肿瘤患者的作用。
在本发明中，具体地，具有外显子18和/或外显子21突变并且进一步具有T790M突变的EGFR优选为以下之一：在外显子18区具有E709X和/或G719X突变并且进一步具有T790M突变的EGFR，和在外显子21区具有L861X突变并且进一步具有T790M突变的EGFR。在本发明中，更具体地，具有外显子18和/或外显子21突变并且进一步具有T790M突变的EGFR优选为以下之一：具有E709K或E709A突变并且进一步具有T790M突变的EGFR，具有G719A、G719S或G719C突变并且进一步具有T790M突变的EGFR，和具有L861Q突变并且进一步具有T790M突变的EGFR。在这些之中，具有G719A突变并且进一步具有T790M突变的EGFR和具有L861Q突变并且进一步具有T790M突变的EGFR是特别优选的。
在本发明中，对检测恶性肿瘤患者表达的EGFR的外显子18和/或外显子21突变的方法没有特别限制，可以使用任何已知的检测方法，只要该方法能够检测突变。
对检测外显子18和/或外显子21突变中使用的样品没有特别限制，只要该样品为从恶性肿瘤患者分离的生物样品，特别是，获自恶性肿瘤患者的样品，且包含恶性肿瘤细胞。生物样品的例子包括体液(例如，血液、尿液等)、组织、其提取物以及所获得的组织的培养物。可以根据生物样品的种类适当选择用于获得生物样品的方法。
生物样品是根据测量方法进行适当的处理而制备的。而且，包含引物或探针的用于检测的试剂可以通过常规方法根据使用其的测量方法来制备。
在本发明一个实施方案中，检测恶性肿瘤患者表达的存在EGFR的外显子18和/或外显子21突变的步骤可在向恶性肿瘤患者施用抗肿瘤剂之前进行。
恶性肿瘤可包括两种或更多种不同的恶性肿瘤细胞。而且，两种或更多种恶性肿瘤可在单一患者中产生。因此，单一患者可同时在EGFR的相同氨基酸位置具有不同的突变(例如，外显子18突变为G719A、G719S和G719C外显子18突变；E709K和E709A外显子18突变)。
本发明的抗肿瘤剂包含作为活性成分的(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺(化合物(A))或其盐。化合物(A)通过以下化学式表示。
Figure BDA0002434823420000111
制备本发明的化合物的方法在以下阐述。
本发明的化合物A可例如通过WO2015/025936A1公开的制备方法、实施例所述的方法等制备。然而，本发明的化合物的制备方法不限于这些反应实例。
当本发明的化合物A具有异构体如旋光异构体、立体异构体和互变异构体时，任何异构体及其混合物包括在本发明的化合物的范围内，除非另有所述。例如，当本发明的化合物A具有旋光异构体时，外消旋混合物和从外消旋混合物分离的旋光异构体也包括在本发明的化合物的范围内，除非另有所述。
化合物A的盐是指任何药学上可接受的盐；实例包括碱加成盐和酸加成盐。
碱加成盐的实例包括碱金属盐如钠盐和钾盐；碱土金属盐如钙盐和镁盐；铵盐；和有机胺盐如三甲基胺盐、三乙胺盐、二环己基胺盐、乙醇胺盐、二乙醇胺盐、三乙醇胺盐、普鲁卡因盐和N,N’-二苄基乙二胺盐。
酸加成盐的例子包括无机酸盐、如盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐和高氯酸盐；有机酸盐如乙酸盐、甲酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐和三氟乙酸盐；和磺酸盐如甲磺酸盐、羟乙基磺酸盐、苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐。
本发明的化合物及其盐还包括其前药。前药是指在体内生理条件下通过与酶、胃酸等的反应可转化为本发明的化合物或其盐的化合物，即，通过酶氧化、还原、水解等可转化为本发明的化合物或其盐的化合物；或通过用胃酸等水解等可转化为本发明的化合物或其盐的化合物。而且，前药可为在生理条件下可转化为本发明的化合物或其盐的化合物，如“Iyakuhin no Kaihatsu[Development of Pharmaceuticals]”，Vol.7，MolecularDesign，Hirokawa Shoten Co.公开于1990年，pp.163-198中所述的那些。
疾病的描述
本发明靶向的肿瘤的具体实例包括，但不特别限于，头颈部癌症、胃肠癌症(食管癌、胃癌、十二指肠癌、肝癌、胆癌(例如，胆囊癌和胆管癌)、胰腺癌、结肠直肠癌(例如，结肠癌和直肠癌)、等)、肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌和间皮瘤)、乳腺癌、生殖器癌症(卵巢癌、子宫癌(例如，子宫颈癌、和子宫内膜癌)、等)、泌尿系统癌症(例如，肾癌、膀胱癌、前列腺癌、和睾丸瘤)、造血系统肿瘤(例如，白血病、恶性淋巴瘤、和多发性骨髓瘤)、骨肉瘤、软组织肉瘤、皮肤癌、脑肿瘤等。优选实例包括肺癌、乳腺癌、头颈部癌症、脑肿瘤、子宫癌、消化器官癌症、造血系统肿瘤或皮肤癌。
特别优选肺癌。
当化合物A或其盐用作药物试剂时，可以根据预防和治疗目的添加药物载体，如果需要的话，从而形成适当的剂型。剂型的实例包括口服制剂、注射剂、栓剂、软膏、贴片等。口服制剂是优选的。这些剂型可以通过本领域技术人员已知的常规方法形成。
在一个实施方案中，本发明的抗肿瘤剂作为包含化合物A或其盐和药学上可接受的载体的药物组合物提供。
作为药学上可接受的载体，多种用作制剂材料的常规有机或无机载体材料可混合作为固体制剂中的赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、或着色剂；或作为液体制剂中的溶剂、增溶剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲液、或安抚剂。而且，也可根据需要使用药物制剂添加剂如防腐剂、抗氧化剂、着色剂、增甜剂、和稳定剂。
口服固体制剂如下制备。在向本发明的化合物中添加赋形剂并任选一起添加赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、掩味剂或调味剂等之后，将所得混合物通过常规方法配制成片剂、包衣片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊等。
赋形剂的实例包括乳糖、蔗糖、D-甘露醇、葡萄糖、淀粉、碳酸钙、高岭土、微晶纤维素、和硅酸酐。粘合剂的实例包括水、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、单糖浆、液体葡萄糖、液体α-淀粉、液体明胶、D-甘露醇、羧基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基淀粉、甲基纤维素、乙基纤维素、虫胶、磷酸钙、聚乙烯吡咯烷酮等。崩解剂的实例包括干淀粉、海藻酸钠、粉末琼脂、碳酸氢钠、碳酸钙、月桂基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、乳糖等。润滑剂的实例包括纯化滑石、硬脂酸钠、硬脂酸镁、硼砂、聚乙二醇等。着色剂的实例包括氧化钛、氧化铁等。掩味剂或调味剂的实例包括蔗糖、苦橙皮、柠檬酸、酒石酸等。
当制备用于口服给药的液体制剂时，可将掩味剂、缓冲液、稳定剂、调味剂等添加至本发明的化合物中；且将所得混合物根据普通方法配制为口服液体制剂、糖浆、酏剂等。
当制备注射剂时，可以将pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、等渗剂、局部麻醉剂等添加到本发明的化合物中，且将混合物根据普通方法配制为皮下、肌内或静脉内注射。
本文使用的pH调节剂和缓冲剂的实例包括柠檬酸钠、乙酸钠和磷酸钠。稳定剂的实例包括焦亚硫酸钠、EDTA、巯基乙酸和硫代乳酸。局部麻醉剂的实例包括盐酸普鲁卡因和盐酸利多卡因。张度剂的实例包括氯化钠、葡萄糖、D-甘露醇和甘油。
当制备栓剂时，可以将在相关领域中已知的药学上可接受的载体，例如聚乙二醇、羊毛脂、可可脂和脂肪酸甘油三酯；以及必要时，表面活性剂例如吐温80(注册商标)加入化合物A中，然后可以按照常规方法将所得混合物制成栓剂。
当制备软膏时，常用的基质、稳定剂、湿润剂、防腐剂等可按需要混入化合物A中；且将所得混合物按照常规方法混合并配制为软膏。
基质的实例包括液体石蜡、白色矿脂、白色蜂蜡、辛基十二烷基醇和石蜡。
防腐剂的实例包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、和对羟基苯甲酸丙酯。
当制备贴剂时，可以根据常规方法将上述软膏、乳膏、凝胶、糊剂等施加到常规基材上。
基材的实例包括包含棉、短纤维或化学纤维的纺织物或无纺布；也可以使用软氯乙烯、聚乙烯、聚氨酯等的薄膜或泡沫片。
每种这样的单位剂量形式中所掺入的化合物A的量取决于被施用化合物的患者的病症、其剂型等。通常，在口服剂的情况下，该化合物的量优选为每单位剂量形式0.05至1000mg。在注射的情况下，该化合物的量优选为每单位剂量形式0.01至500mg；在栓剂的情况下，该化合物的量优选为每单位剂量形式1至1000mg。
此外，这种剂型的药物的日剂量取决于患者的病症、体重、年龄、性别等，并且不能被泛化或限制。通常，对于成人(体重：50kg)，化合物A的日剂量通常可以为0.05至5000mg，优选为0.1至1000mg；并且优选每天给药一剂或分两至三剂给药。
本发明还提供治疗恶性肿瘤患者的方法，包括将化合物A或其盐施用至恶性肿瘤患者的步骤，所述患者表达具有外显子18和/或外显子21突变的EGFR。
本发明还提供化合物A或其盐，其用于治疗恶性肿瘤患者，所述患者表达具有外显子18和/或外显子21突变的EGFR。
本发明还提供化合物A或其盐治疗恶性肿瘤患者的用途，所述患者表达具有外显子18和/或外显子21突变的EGFR。
本发明还提供化合物A或其盐在制备用于治疗恶性肿瘤患者的药物中的用途，所述患者表达具有外显子18和/或外显子21突变的EGFR。
本发明还提供药物组合物，其用于治疗恶性肿瘤患者，所述患者表达具有外显子18和/或外显子21突变的EGFR，所述药物组合物包含化合物A或其盐和药学上可接受的载体。
本发明还提供在恶性肿瘤患者中预测使用抗肿瘤剂进行化疗的治疗效果的方法，所述抗肿瘤剂包含化合物A或其盐作为活性成分，该方法包括以下步骤(1)和(2):
(1)检测获自患者的生物样品中包含的EGFR基因存在或不存在突变的步骤；和
(2)当步骤(1)中的检测结果发现EGFR基因具有外显子18和/或外显子21突变时，预测所述化疗非常有可能对所述患者显示出充分的治疗效果的步骤。
本发明还提供治疗恶性肿瘤患者的方法，包括以下步骤(1)至(3):
(1)检测获自患者的生物样品中包含的EGFR基因存在或不存在突变的步骤；和
(2)当步骤(1)中的检测结果发现EGFR基因具有外显子18和/或外显子21突变时，预测使用抗肿瘤剂的化疗非常有可能对所述患者显示出充分的治疗效果的步骤，所述抗肿瘤剂包含(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐作为活性成分；和
(3)向恶性肿瘤患者施用(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐的步骤，所述患者在步骤(2)中被预测非常有可能对使用抗肿瘤剂的化疗有充分响应，所述抗肿瘤剂包含(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐作为活性成分。
EGFR基因的碱基序列是公知的。cDNA的碱基序列的GenBank登录号为NM_005228.4。
可以通过肿瘤缩小作用、抑制复发作用、延长寿命作用等来评价“治疗作用”。复发抑制作用可以表示为非复发期的延长程度或复发率的改善程度；并且延长寿命作用可以表示为总存活时间的程度或中位无进展生存的延长程度，等等。使用包含化合物A或其盐作为活性成分的抗肿瘤剂进行的化疗的“充分的治疗效果”是指，例如，通过施用包含化合物A或其盐作为活性成分的抗肿瘤剂可以获得优异的治疗效果，例如与不施用相比，生存时间延长、复发受到抑制等。
实施例
下面参考以下测试实施例更详细地描述本发明。但是，本发明不限于这些实施例(测试例)。
测试例1：体外药物功效测试
使用HEK293细胞评估突变型EGFR强势表达系统中细胞内磷酸化的结果(抑制活 性)
基于以下作为指标，评估化合物的细胞内靶标的抑制活性：使用Jump-In(商标)Grip(商标)HEK293细胞(Thermo Fisher Scientific Inc.)(可在下文中称为“HEK293细胞”)在突变型EGFR强势表达系统中的细胞内EGFR磷酸化。
将HEK293细胞保持在含有GlutaMAX(商标)-I(高浓度葡萄糖)(Thermo FisherScientific Inc.)的D-MEM中，其包含10％透析的FBS和100U/mL青霉素/100μg/mL链霉素(Thermo Fisher Scientific Inc.)；向HEK293细胞中加入编码人EGFR基因(G719A、G719S、G719C、E709K、E709A、L861Q、G719A+T790M，或L861Q+T790M；符号“+”指示包含两种突变)的pJTITM R4DEST CMV pA载体，连同Opti-MEM(商标)I(Thermo Fisher Scientific Inc.)，使用ViaFect(商标)转染试剂(Promega Corporation)。
将表达突变型人EGFR的HEK293细胞接种到384孔平底微孔板的每个孔中，使每个孔的细胞计数为10,000，并在含5％CO2气体的培养箱中于37℃孵育1天。将化合物A、埃罗替尼、阿法替尼和奥西替尼(以下可将埃罗替尼、阿法替尼和奥西替尼分别称为“比较化合物”)分别溶解在DMSO中，并用DMSO或用于悬浮细胞的培养基稀释。然后将溶液分别加入到细胞培养板的每个孔中，并将细胞在含5％CO2气体的培养箱中在37℃下培养6小时。孵育后，将细胞用20％中性缓冲福尔马林(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)固定，并用Odyssey(商标)封闭缓冲液(PBS)(M&S TechnoSystems Inc.)封闭。然后使细胞与用Odyssey(商标)封闭缓冲液(PBS)稀释至1/200的初级抗体(EGFR单克隆抗体(R19/48MIX)#AHR5062)(Thermo Fisher Scientific Inc.)()和磷酸-EGFR受体(Tyr1068)抗体#2234L(CST))反应，然后使细胞在4℃渗透过夜。第二天，将细胞与用Odyssey(商标)封闭缓冲液(PBS)稀释至1/800的次级抗体(IRDye 800CW Goat aRabbit#926-32211和IRDye 680RDGoat aMouse#926-68070(M&S TechnoSystems Inc.))反应，并在室温下渗透1小时。用Odyssey红外成像系统(LI-COR Bioscience)在800nm和700nm的荧光波长下检测荧光强度(以下可称为“FI”)。
通过从在800nm或700nm荧光波长处检测到的FI减去没有细胞的孔的FI所得的值称为FI(800，EGFR)-空白(在800nm)和FI(700，p-EGFR)-空白(在700nm)。通过将每个孔的FI(700，p-EGFR)-空白除以FI(800，EGFR)-空白得到的值确定为FI(p-EGFR/EGFR)。使用下式计算磷酸化EGFR的抑制率，以确定50％的磷酸化EGFR被抑制时的受试化合物的浓度(IC50(μM))。表1说明了结果。
磷酸化EGFR率(％)＝T/C×100
T：添加测试化合物的孔的FI(p-EGFR/EGFR)。
C：未添加测试化合物的孔的FI(p-EGFR/EGFR)。
从表1清楚可见，化合物A对外显子18或外显子21突变型EGFR的细胞内磷酸化表现出高抑制活性；且活性高于埃罗替尼或奥西替尼，并且与阿法替尼相当。在存在获得性抗性突变即T790M突变存在下，化合物A对外显子18或外显子21突变型EGFR的抑制活性高于阿法替尼的抑制活性。
表1
Figure BDA0002434823420000171
测试例2
对表达野生型EGFR和突变型EGFR的细胞系的细胞生长抑制作用的评估(体外)
使用Ba/F3细胞评估化合物对野生型EGFR和突变型EGFR的抑制活性，Ba/F3细胞是引入人EGFR基因的小鼠B淋巴细胞前体细胞系。将Ba/F3细胞保存在RPMI-1640培养基(Thermo Fisher Scientific Inc.)中，该培养基包含10％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素/100μg/mL链霉素(Thermo Fisher Scientific Inc.)和1ng/mL小鼠白介素-3(mIL-3)(CST)。将其中已编码加入人EGFR基因(野生型(WT)，G719A或L861Q)的PB-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro载体或PB-CMV-MCS-EF1-RFP+Puro载体引入细胞中，连同加入Super PiggyBac转座酶表达载体，其通过使用了Amaxa(商标)Cell Line Nucleofector(商标)Kit V进行的电穿孔，然后使用嘌呤霉素(SIGMA)进行选择。表达野生型EGFR的Ba/F3细胞(以下可称为“Ba/F3―EGFR_WT”)在50ng/mL EGF(R&D Systems)存在下表现出mIL-3非依赖性生长；表达外显子18或外显子21活性突变型EGFR的Ba/F3细胞(以下可称为“Ba/F3-EGFR G719A”和“Ba/F3-EGFR L861Q”)在没有EGF的情况下显示出mIL-3非依赖性生长。
为了评估细胞生长抑制作用，将Ba/F3―EGFR_WT细胞悬浮在含有10％FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和50ng/mL EGF的RPMI-1640培养基中；且将细胞悬浮液接种在96孔平底微板的每个孔中，使得每个孔的细胞数为30,000。将Ba/F3-EGFR G719A细胞和Ba/F3-EGFR L861Q细胞悬浮在含有10％FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的各自RPMI-1640培养基中；且将细胞悬液分别接种在96孔平底微板的每个孔中，使得每个孔的细胞数为15,000。随后，将化合物A、吉非替尼、埃罗替尼、阿法替尼和奥西替尼(吉非替尼、埃罗替尼、阿法替尼和奥西替尼可各自在下文称为“比较化合物”)各自溶于DMSO，且使用DMSO或用于悬浮细胞的培养基稀释。然后将溶液添加至细胞培养板的每个孔中，并将细胞在含5％CO2气体的培养箱中于37℃孵育3天。孵育后的细胞数通过CellTiter-Glo(商标)发光细胞活力测定(Promega Corporation)根据制造商推荐的方案进行测量。使用下式计算生长率，以确定每种测试化合物实现50％抑制时的浓度(IC50(μM))。
生长率(％)＝T/C×100
T：添加测试化合物的孔的发光强度。
C：未添加测试化合物的孔的发光强度。
野生型EGFR与G719A突变型EGFR之间的IC50比率，或野生型EGFR与L861Q突变型EGFR之间的IC50比率使用下式确定。表2示出了结果。
IC50比率＝IC50(野生型)/IC50(G719A或L861Q)
从表2清楚可见，化合物A对G719A突变和L861Q突变显示出选择性抑制活性。
表2
Figure BDA0002434823420000191
测试例3：体内药物功效测试
对皮下移植表达G719A突变型EGFR的细胞系的小鼠模型的抗肿瘤作用的评估
使用NIH-3T3细胞对皮下移植有表达G719A突变型EGFR的细胞系的小鼠模型进行评估，NIH-3T3细胞是其中引入了人类EGFR基因的小鼠成纤维细胞系。NIH-3T3细胞保存在D-MEM(高葡萄糖)培养基(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)中，该培养基含有10％新生小牛血清(NBCS)、1,500mg/L碳酸氢钠和100U/mL青霉素/100μg/mL链霉素(ThermoFisher Scientific Inc.)；将已编码加入人EGFR基因(G719A)的PB-CMV-MCS-EF1-RFP+Puro载体引入细胞，连同加入Super PiggyBac转座酶表达载体，其通过使用Amaxa(商标)Cell Line Nucleofector(商标)Kit R进行的电穿孔，然后使用嘌呤霉素(SIGMA)进行选择。表达外显子18突变型EGFR的NIH-3T3细胞(以下可称为“NIH3T3-EGFR G719A”)在1％NBCS条件下在不存在EGF的情况下表现出生长。
在使用皮下移植有表达G719A突变型EGFR的细胞系的小鼠模型进行评价的过程中，裸小鼠皮下移植NIH3T3-EGFR G719A细胞，向该细胞中引入了突变型人EGFR。在植入小鼠中的肿瘤的肿瘤体积生长至约100至200mm3时，通过分层随机化将小鼠分组，每组5或6只小鼠，以使组之间平均肿瘤体积是均一的。然后向小鼠口服给予化合物A、阿法替尼或奥西替尼，每天一次，连续14天。
阿法替尼的剂量为20mg/kg/天，这是最大耐受剂量(给药期间体重减轻小于20％的最大剂量)，持续14天(该测试的给药期)。奥西替尼的剂量为25mg/kg/天，其为临床有效剂量。对于化合物A，设定三种剂量：200mg/kg/天(最大耐受剂量)、100mg/kg/天和50mg/kg/天。从人道主义的角度，根据美国国家癌症研究所(NCI)的“Guidelines InvolvingExperimental Neoplasia Proposals in Mice and Rats”确定了最大耐受剂量。
为了比较由于施用单个测试化合物而导致的肿瘤生长随时间的变化，将肿瘤体积(下文可称为“TV”)用作指标。对于毒性指数，随时间测量体重，并根据下式计算从将小鼠分组之日起的体重变化(下文可称为“BWC(％)”)。
BWC(％)＝(在体重测量日测量的体重)/(小鼠在分组当天的体重)
当对照组和被给药测试化合物的组在最后评价日的平均TV差异是统计学显著的(Dunnett检验，p<0.05)，且使用下式计算的治疗/对照(T/C)的值小于100，则确定该测试化合物有效。这种情况在图中用符号“*”表示。
T/C(％)＝(被给药测试化合物的组的平均TV)/(对照组的平均TV)×100
从图1所示的结果可以清楚地看出，本发明的化合物A对皮下移植到裸小鼠中的表达G719A突变型EGFR的细胞系具有显著的抗肿瘤作用，并伴随着肿瘤的消退。该作用也高于阿法替尼或奥西替尼的抗肿瘤作用。小鼠没有出现症状，如图2所示，例如体重严重减轻、粪便异常或皮肤异常。
测试例4：体外药物功效测试
对表达T790M突变型EGFR的细胞系的细胞生长抑制作用的评估(体外)
使用Ba/F3细胞评估了化合物对T790M突变型EGFR的抑制活性，Ba/F3细胞是引入了人EGFR基因的小鼠B-淋巴细胞前体细胞系。将Ba/F3细胞保存在含有10％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素/100μg/mL链霉素(Thermo Fisher Scientific Inc.)和1ng/mL小鼠白介素-3(mIL-3)(CST)的RPMI-1640培养基(Thermo Fisher Scientific Inc.)中；且将已编码加入人EGFR基因(野生型(WT)、G719A+T790M或L861Q+T790M)的PB-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro载体或PB-CMV-MCS-EF1-RFP+Puro载体引入所述细胞中，连同加入Super PiggyBac转座酶表达载体，其通过使用Amaxa(商标)Cell Line Nucleofector(商标)Kit V进行的电穿孔，然后使用嘌呤霉素(SIGMA)进行选择。表达G719A+T790M突变型EGFR或L861Q+T790M突变型EGFR的Ba/F3细胞(下文可称为“Ba/F3-EGFR G719A+T790M”和“Ba/F3-EGFR L861Q+T790M”)在不存在EGF的情况下显示出mIL-3-非依赖性生长。
为了评估细胞生长抑制作用，将Ba/F3-EGFR G719A+T790M细胞和Ba/F3-EGFRL861Q+T790M细胞各自悬浮在含有10％FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中；且将细胞悬浮液各自接种在96孔平底微板的每个孔中，使得每个孔的细胞数为15,000。随后，将化合物A、吉非替尼、埃罗替尼、阿法替尼和奥西替尼(吉非替尼、埃罗替尼、阿法替尼和奥西替尼可各自在下文称为“比较化合物”)各自溶于DMSO，且使用DMSO或用于悬浮细胞的培养基稀释。然后将溶液添加至细胞培养板的每个孔中，并在含5％CO2气体的培养箱中于37℃孵育3天。孵育后的细胞数通过CellTiter-Glo(商标)发光细胞活力测定(Promega Corporation)根据制造商推荐的方案进行测量。使用下式计算生长率，以确定每种测试化合物实现50％抑制的浓度(IC50(μM))。
生长率(％)＝T/C×100
T：添加测试化合物的孔的发光强度。
C：未添加测试化合物的孔的发光强度。
此外，野生型EGFR与G719A+T790M突变型EGFR之间的IC50比率，或野生型EGFR与L861Q+T790M突变型EGFR之间的IC50比率使用下式计算。表3示出了结果。
IC50比率＝IC50(野生型)/IC50(G719A+T790M或L861Q+T790M)
从表3清楚可见，化合物A对G719A+T790M突变和L861Q+T790M突变显示出选择性抑制活性。
表3
Figure BDA0002434823420000211
测试例5：体内药物功效测试
对皮下移植有表达G719A+T790M突变型EGFR的细胞系的小鼠模型的抗肿瘤作用的 评估
使用NIH-3T3细胞对皮下移植有表达G719A+T790M突变型EGFR的细胞系的小鼠模型进行评估，NIH-3T3细胞是引入了人类EGFR基因的小鼠成纤维细胞系。将NIH-3T3细胞保存在D-MEM(高葡萄糖)培养基(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)中，该培养基含有10％新生小牛血清(NBCS)、1,500mg/L碳酸氢钠和100U/mL青霉素/100μg/mL链霉素(ThermoFisher Scientific Inc.)；且将已编码加入人EGFR基因(G719A+T790M)的PB-CMV-MCS-EF1-RFP+Puro载体引入到所述细胞中，连同一起引入Super PiggyBac转座酶表达载体，其通过使用Amaxa(商标)Cell Line Nucleofector(商标)Kit R进行的电穿孔，然后使用嘌呤霉素(SIGMA)进行选择。表达外显子18突变型EGFR的NIH-3T3细胞(以下可称为“NIH3T3-EGFR G719A+T790M”)在1％NBCS条件下在不存在EGF的情况下表现出生长。
在使用皮下移植有表达G719A+T790M突变型EGFR的细胞系的小鼠模型的评价中，裸小鼠皮下移植有其中引入突变型人EGFR的NIH3T3-EGFR G719A+T790M细胞。在植入小鼠中的肿瘤的肿瘤体积生长至约100至300mm3时，通过分层随机化将小鼠分组，每组5只小鼠，以使组之间平均肿瘤体积是均一的。然后向小鼠口服给予本发明的化合物A或阿法替尼，每天一次连续几天。
阿法替尼的剂量为20mg/kg/天，这是最大耐受剂量(给药期间体重减轻小于20％的最大剂量)，持续14天(该测试的给药期)。对于本发明的化合物A，设定三种剂量：200mg/kg/天(最大耐受剂量)、100mg/kg/天和50mg/kg/天。从人道主义的角度，根据美国国家癌症研究所(NCI)的“Guidelines Involving Experimental Neoplasia Proposals in Miceand Rats”确定了最大耐受剂量。
为了比较由于施用单个测试化合物而导致的肿瘤生长随时间的变化，将肿瘤体积(下文可称为“TV”)用作指标。图3示出了TV随时间的变化。对于毒性指数，随时间测量体重，并根据下式计算从将小鼠分组之日起的体重变化(下文可称为“BWC(％)”)。图4示出了体重随时间的变化。
BWC(％)＝(在体重测量日测量的体重)/(小鼠在分组当天的体重)
使用最后评价日的平均TV作为指标进行Dunnett检验。当对照组和给药测试化合物的组的平均TV差异是统计学显著的(p<0.05)，且使用下式计算的治疗/对照(T/C)的值小于100，则确定该测试化合物有效。这种情况在图3和表4中用符号“*”表示(*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001)。此外，当给予本发明的化合物A的组与给予阿法替尼组之间的平均TV差异为统计学显著的(p<0.05)，且给予本发明化合物A的组的T/C值小于给予阿法替尼的组的T/C值时，则该化合物A被确定具有比阿法替尼更高的抗肿瘤作用。这种情况在图3和表4中用符号“#”表示(#：p<0.05,##：p<0.01，###：p<0.001)。
T/C(％)＝(被给药测试化合物的组的平均TV)/(对照组的平均TV)×100
从图3所示的结果可以清楚地看出，本发明的化合物A对皮下皮移植到裸小鼠中的表达G719A+T790M突变型EGFR的细胞系具有显著的抗肿瘤作用。此外，如表4所示，该作用高于阿法替尼的抗肿瘤作用，小鼠没有症状如严重的体重减轻(如图4所示)、粪便异常或皮肤异常。
表4
Figure BDA0002434823420000231
N.S.：无显著性差异
***：p<0.001(Dunnett检验，相对于对照组)
##：p<0.01(Dunnett检验，相对于阿法替尼组)
###：p<0.001(Dunnett检验，相对于阿法替尼组)
序列表
<110> 大鹏药品工业株式会社
<120> 外显子18和/或外显子21突变型EGFR的选择性抑制剂
<130> P18-145WO
<150> JP 2017-168606
<151> 2017-09-01
<160> 1
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 1210
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln
20 25 30
Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe
35 40 45
Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn
50 55 60
Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys
65 70 75 80
Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val
85 90 95
Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr
100 105 110
Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn
115 120 125
Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu
130 135 140
His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu
145 150 155 160
Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met
165 170 175
Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro
180 185 190
Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln
195 200 205
Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg
210 215 220
Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys
225 230 235 240
Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp
245 250 255
Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro
260 265 270
Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly
275 280 285
Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His
290 295 300
Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu
305 310 315 320
Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val
325 330 335
Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn
340 345 350
Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp
355 360 365
Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr
370 375 380
Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu
385 390 395 400
Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp
405 410 415
Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln
420 425 430
His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu
435 440 445
Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser
450 455 460
Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu
465 470 475 480
Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu
485 490 495
Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro
500 505 510
Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn
515 520 525
Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly
530 535 540
Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro
545 550 555 560
Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro
565 570 575
Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val
580 585 590
Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp
595 600 605
Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys
610 615 620
Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly
625 630 635 640
Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu
645 650 655
Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His
660 665 670
Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu
675 680 685
Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu
690 695 700
Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser
705 710 715 720
Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu
725 730 735
Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser
740 745 750
Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser
755 760 765
Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser
770 775 780
Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp
785 790 795 800
Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn
805 810 815
Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg
820 825 830
Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro
835 840 845
Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala
850 855 860
Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp
865 870 875 880
Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp
885 890 895
Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser
900 905 910
Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu
915 920 925
Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr
930 935 940
Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys
945 950 955 960
Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln
965 970 975
Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro
980 985 990
Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp
995 1000 1005
Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe
1010 1015 1020
Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu
1025 1030 1035
Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn
1040 1045 1050
Gly Leu Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg
1055 1060 1065
Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp
1070 1075 1080
Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro
1085 1090 1095
Lys Arg Pro Ala Gly Ser Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln
1100 1105 1110
Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro
1115 1120 1125
His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln
1130 1135 1140
Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala His Trp Ala
1145 1150 1155
Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp Asn Pro Asp Tyr Gln
1160 1165 1170
Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe Lys
1175 1180 1185
Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln
1190 1195 1200
Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala
1205 1210

Claims (32)

1.抗肿瘤剂，其用于治疗恶性肿瘤患者，所述患者表达具有至少一种选自以下突变的EGFR：外显子18的G719X突变、外显子18的E709X突变和外显子21的L861X突变，其中X表示任意氨基酸残基，所述抗肿瘤剂包含(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐。
2.根据权利要求1的抗肿瘤剂，其中所述外显子18突变为至少一种选自以下的突变：G719A、G719S、G719C、E709K和E709A。
3.根据权利要求1或2的抗肿瘤剂，其中所述外显子21突变为L861Q。
4.根据权利要求1至3任一项的抗肿瘤剂，其中所述EGFR进一步具有T790M突变。
5.治疗恶性肿瘤患者的方法，包括向恶性肿瘤患者施用(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐的步骤，所述患者表达具有至少一种选自以下突变的EGFR：外显子18的G719X突变、外显子18的E709X突变、和外显子21的L861X突变，其中X表示任意氨基酸残基。
6.根据权利要求5的方法，其中所述外显子18突变为至少一种选自以下的突变：G719A、G719S、G719C、E709K和E709A。
7.根据权利要求5或6的方法，其中所述外显子21突变为L861Q。
8.根据权利要求5至7任一项的方法，其中所述EGFR进一步具有T790M突变。
9.(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐，其用于治疗恶性肿瘤患者，所述患者表达具有至少一种选自以下突变的EGFR：外显子18的G719X突变、外显子18的E709X突变、和外显子21的L861X突变，其中X表示任意氨基酸残基。
10.根据权利要求9的(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐，其中所述外显子18突变为至少一种选自以下的突变：G719A、G719S、G719C、E709K和E709A。
11.根据权利要求9或10的(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐，其中所述外显子21突变为L861Q。
12.根据权利要求9至11任一项的(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐，其中所述EGFR进一步具有T790M突变。
13.(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐用于治疗恶性肿瘤患者的用途，所述患者表达具有至少一种选自以下突变的EGFR：外显子18的G719X突变、外显子18的E709X突变、和外显子21的L861X突变，其中X表示任意氨基酸残基。
14.根据权利要求13的用途，其中所述外显子18突变为至少一种选自以下的突变：G719A、G719S、G719C、E709K和E709A。
15.根据权利要求13或14的用途，其中所述外显子21突变为L861Q。
16.根据权利要求13至15任一项的用途，其中所述EGFR进一步具有T790M突变。
17.(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐在制备用于治疗恶性肿瘤患者的药物中的用途，所述患者表达具有至少一种选自以下突变的EGFR：外显子18的G719X突变、外显子18的E709X突变、和外显子21的L861X突变，其中X表示任意氨基酸残基。
18.根据权利要求17的用途，其中所述外显子18突变为至少一种选自以下的突变：G719A、G719S、G719C、E709K和E709A。
19.根据权利要求17或18的用途，其中所述外显子21突变为L861Q。
20.根据权利要求17至19任一项的用途，其中所述EGFR进一步具有T790M突变。
21.药物组合物，其包含(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐和药学上可接受的载体，所述组合物用于治疗恶性肿瘤患者，所述患者表达具有至少一种选自以下突变的EGFR：外显子18的G719X突变、外显子18的E709X突变、和外显子21的L861X突变，其中X表示任意氨基酸残基。
22.根据权利要求21的药物组合物，其中所述外显子18突变为至少一个选自以下的突变：G719A、G719S、G719C、E709K和E709A。
23.根据权利要求21或22的药物组合物，其中所述外显子21突变为L861Q。
24.根据权利要求21至23任一项的药物组合物，其中所述EGFR进一步具有T790M突变。
25.在恶性肿瘤患者中预测使用抗肿瘤剂进行化疗的治疗效果的方法，所述抗肿瘤剂包含(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐作为活性成分，所述方法包括以下步骤(1)和(2):
(1)检测获自患者的生物样品中包含的EGFR基因存在或不存在突变的步骤；和
(2)当步骤(1)中的检测结果发现EGFR基因具有至少一种选自以下的突变时，预测所述化疗非常有可能对所述患者显示出充分的治疗效果的步骤，所述突变为：外显子18的G719X突变、外显子18的E709X突变、和外显子21的L861X突变，其中X表示任意氨基酸残基。
26.根据权利要求25的方法，其中所述外显子18突变为至少一种选自以下的突变：G719A、G719S、G719C、E709K和E709A。
27.根据权利要求25或26的方法，其中所述外显子21突变为L861Q。
28.根据权利要求25至27任一项的方法，其中所述EGFR进一步具有T790M突变。
29.治疗恶性肿瘤患者的方法，包括以下步骤(1)至(3):
(1)检测获自患者的生物样品中包含的EGFR基因存在或不存在突变的步骤；
(2)当步骤(1)中的检测结果发现EGFR基因具有至少一种选自以下的突变时，预测使用抗肿瘤剂进行化疗非常有可能对患者显示出充分的治疗效果的步骤，所述抗肿瘤剂包含(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐作为活性成分，所述突变为：外显子18的G719X突变、外显子18的E709X突变、和外显子21的L861X突变，其中X表示任意氨基酸残基；和
(3)向恶性肿瘤患者施用(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐的步骤，所述恶性肿瘤患者在步骤(2)中被预测非常有可能对使用抗肿瘤剂进行的化疗有充分响应，所述抗肿瘤剂包含(S)-N-(4-氨基-6-甲基-5-(喹啉-3-基)-8,9-二氢嘧啶并[5,4-b]吲嗪-8-基)丙烯酰胺或其盐作为活性成分。
30.根据权利要求29的方法，其中所述外显子18突变为至少一种选自以下的突变：G719A、G719S、G719C、E709K和E709A。
31.根据权利要求29或30的方法，其中所述外显子21突变为L861Q。
32.根据权利要求29至31任一项的方法，其中所述EGFR进一步具有T790M突变。
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