BR112020004000A2 - inibidor seletivo de egfr mutante no exon 18 e/ou exon 21 - Google Patents

Abstract

Agente antitumoral para tratamento de um paciente com tumor maligno que expressa EGFR com pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste na mutação G719X do exon 18, mutação E709X do exon 18 e mutação L861X do exon 21, em que X representa um resíduo de aminoácido arbitrário, o agente antitumoral compreendendo (S) -N- (4-amino-6-metil-5- (quinolin-3-il) -8,9-di-hidropirimido [5,4-b] indolizin-8-il) acrilamida ou um sal do mesmo.

Description

INIBIDOR SELETIVO DE EGFR MUTANTE NO ÉXON 18 E/OU ÉXON 21 Campo Técnico

[001] A presente invenção se refere a um agente antitumoral contra cânceres, compreendendo um receptor do fator de crescimento epidérmico mutante no éxon 18 e/ou éxon 21 (daqui em diante também referido como “EGFR”). Antecedentes da Técnica

[002] O EGFR é uma tirosina quinase do tipo receptor, exerce sua função fisiológica no tecido normal ao ser ligado ao Fator de Crescimento Epidérmico (doravante também denominado EGF), que é um ligando, e contribui para a inibição do crescimento e da apoptose nos tecidos epiteliais (NPL 1). Além disso, a mutação somática do gene EGFR é conhecida como gene causador de câncer; por exemplo, EGFR no qual os códons 746 a 750 no éxon 19 são excluídos (doravante também denominados “mutação por exclusão no éxon 19”) e EGFR na qual a leucina codificada pelo códon 858 no éxon 21 sofre mutação em arginina (a seguir também denominada “mutação L858R”) induz constantemente atividade de quinase independente de EGF, e contribui para o crescimento e a sobrevivência de células cancerígenas (NPL 2). Essas mutações são observadas, por exemplo, em 30 a 50% dos cânceres de pulmão de células não pequenas no leste da Ásia. As mutações também são observadas em cerca de 10% do câncer de pulmão de células não pequenas na Europa e nos Estados Unidos, e são consideradas uma das causas de câncer (NPL 3).

[003] Portanto, a pesquisa e o desenvolvimento do inibidor de EGFR como agente antitumoral foram ativamente conduzidos e introduzidos no tratamento de vários cânceres de pulmão positivos para mutação em EGFR (NPL 2 e NPL 4). O gefitinibe, o erlotinibe e o afatinibe foram usados como agente terapêutico contra os cânceres de pulmão positivos para EGFR mutante para exclusão no éxon 19 e L858R. A mutação por exclusão no éxon 19 e a mutação L858R são responsáveis por 90% da mutação em EGFR. Além disso, é conhecida a ocorrência de resistência adquirida no processo de tratamento usando esses agentes, e 50% da mesma são causadas pela mutação de resistência em EGFR, na qual o códon 790 do éxon 20 é alterado de treonina para metionina (daqui em diante também referido como “mutação T790M”). Para tratar cânceres de pulmão tendo essa mutação, o osimertinibe tem sido usado como agente terapêutico. Portanto, estão sendo estabelecidos tratamentos usando inibidores de EGFR para pacientes com câncer de pulmão tendo grandes mutações em EGFR.

[004] Por outro lado, no momento, nenhum tratamento usando inibidores de EGFR foi estabelecido com relação a algumas mutações raras em EGFR, tal como mutação pontual ou mutação por exclusão do éxon 18, mutação pontual do éxon 21, ou similares; e há relatos de que a sensibilidade a fármaco desses EGFR mutantes varia dependendo do tipo de mutação (NPL 4). Por exemplo, a sensibilidade do câncer de pulmão tendo mutação pontual na qual a glicina codificada pelo códon 719 do éxon 18 é substituída por um aminoácido arbitrário (doravante também denominado “mutação G719X”) ou do câncer de pulmão no qual a leucina codificada pelo códon 861 do éxon 21 é substituído por glutamina (daqui em diante também denominada “mutação L861Q”) em relação a gefitinibe, erlotinibe e afatinibe é menor que a da mutação por exclusão no éxon 19 e mutação L858R, que são mutações sensíveis a fármacos. Além disso, há relatos de distúrbios da pele e distúrbios do trato digestivo como efeitos colaterais comuns pela administração de doses terapêuticas de afatinibe, gefitinibe e erlotinibe. Pensa-se amplamente que esses efeitos colaterais são atribuíveis à inibição da função do EGFR do tipo selvagem expressado em tecidos normais, tal como pele ou trato digestivo, pelo agente terapêutico (NPL 1); o desenvolvimento de um inibidor caracterizado por menor atividade inibitória em relação ao EGFR do tipo selvagem de tecidos normais, em comparação com o EGFR mutante expressado nos tecidos tumorais, foi desejado em vista da redução dos efeitos colaterais.

[005] Portanto, espera-se que o desenvolvimento de um fármaco tendo alta atividade inibitória em relação ao EGFR mutante no éxon 18 e no éxon 21, bem como alta seletividade em relação ao EGFR mutante em comparação com o EGFR de tipo selvagem, permita a inibição do crescimento de células cancerígenas do pulmão tendo EGFR mutante com uma dose menor que a dose que causa efeitos colaterais na pele ou no trato digestivo, contribuindo assim para prolongar a vida ou aumentar a QV de pacientes com cânceres positivos para EGFR mutantes para os quais os métodos de tratamento não foram estabelecidos. Além disso, espera-se que um fármaco tendo alta atividade inibitória em relação a T790M, que é uma mutação de resistência adquirida contra tratamentos usando inibidores de EGFR, reduza a frequência de expressão da resistência adquirida durante os tratamentos usando inibidores de EGFR contra EGFR mutante no éxon 18 ou éxon 21, que é mutação de novo; e, portanto, espera-se que contribua para o prolongamento da vida de pacientes com câncer. Lista de citações Literatura de patentes PTL 1: WO2015/175632A1 PTL 2: WO2015/025936A1 Literatura que não seja de patente NPL 1: Nat. Rev. Cancer, vol. 6, págs. 803-812 (2006) NPL 2: Nature Medicine, vol. 19, págs. 1389-1400 (2013) NPL 3: Nat. Rev. Cancer, vol. 7, págs. 169-181 (2007) NPL 4: Lancet Oncol. Vol. 13 e. 23-31 (2012) Sumário da Invenção Problema Técnico

[006] Um objetivo da presente invenção é prover um agente antitumoral que não cause inibição do EGFR do tipo selvagem e cause efeitos colaterais menores, servindo como um inibidor que pode garantir alta seletividade em relação ao EGFR mutante no éxon 18 e/ou éxon 21 para os quais os efeitos terapêuticos dos inibidores de EGFR conhecidos anteriormente são insuficientes. Solução para o Problema

[007] Os inventores da presente invenção conduziram uma extensa pesquisa e verificou-se que o EGFR mutante do éxon 18 e/ou éxon 21 é um alvo apropriado no tratamento de câncer, e que os inibidores de EGFR convencionalmente usados para os tratamentos têm seletividade inferior entre o EGFR mutante no éxon 18 e/ou o éxon 21. Além disso, os inventores também confirmaram que o composto da presente invenção exerce efeitos inibitórios de crescimento do tumor e de seletividade superior em relação ao EGFR mutante no éxon 18 e/ou no éxon

21. Com esta verificação, os inventores realizaram a presente invenção.

[008] A presente invenção abrange as seguintes modalidades. Item 1.

[009] Um agente antitumoral para tratamento de um paciente com tumor maligno que expressa EGFR tendo pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste na mutação G719X no éxon 18, mutação E709X no éxon 18 e mutação L861X no éxon 21, em que X representa um resíduo de aminoácido arbitrário , o agente antitumoral compreendendo (S)-N-(4- amino-6-metil-5-(quinolin-3-il)-8,9-di-hidropirimido[5,4- b]indolizin-8-il)acrilamida ou um sal do mesmo. Item 2.

[0010] O agente antitumoral de acordo com o Item 1, em que a mutação no éxon 18 é pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste em G719A, G719S, G719C, E709K e E709A. Item 3.

[0011] O agente antitumoral de acordo com o Item 1 ou 2, em que a mutação no éxon 21 é L861Q. Item 4.

[0012] O agente antitumoral de acordo com qualquer um dos itens 1 a 3, em que o EGFR tem adicionalmente uma mutação T790M. Item 5.

[0013] Um método para tratar um paciente com tumor maligno, compreendendo a etapa de administração de (S)-N-(4- amino-6-metil-5-(quinolin-3-il)-8,9-di-hidropirimido[5,4- b]indolizin-8-il)acrilamida ou um sal do mesmo a um paciente com tumor maligno que expressa EGFR tendo pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste na mutação G719X no éxon 18, mutação E709X no éxon 18 e mutação L861X no éxon 21, em que X representa um resíduo de aminoácido arbitrário. Item 6.

[0014] O método de acordo com o Item 5, em que a mutação no éxon 18 é pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste em G719A, G719S, G719C, E709K e E709A. Item 7.

[0015] O método de acordo com o Item 5 ou 6, em que a mutação no éxon 21 é L861Q. Item 8.

[0016] O método de acordo com qualquer um dos itens 5 a 7, em que o EGFR tem adicionalmente uma mutação T790M. Item 9.

[0017] (S)-N-(4-amino-6-metil-5-(quinolin-3-il)-8,9- di-hidropirimido[5,4-b]indolizin-8-il)acrilamida ou um sal do mesmo para tratar um paciente com tumor maligno que expressa EGFR tendo pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste na mutação G719X no éxon 18, mutação E709X no éxon 18 e mutação L861X no éxon 21, em que X representa um resíduo de aminoácido arbitrário. Item 10.

[0018] (S)-N-(4-amino-6-metil-5-(quinolin-3-il)-8,9- di-hidropirimido[5,4-b]indolizin-8-il)acrilamida ou um sal do mesmo ao Item 9, em que a mutação no éxon 18 é pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste em G719A, G719S, G719C, E709K e E709A. Item 11.

[0019] (S)-N-(4-amino-6-metil-5-(quinolin-3-il)-8,9- di-hidropirimido[5,4-b]indolizin-8-il)acrilamida ou um sal do mesmo ao item 9 ou 10, em que a mutação no éxon 21 é

L861Q. Item 12.

[0020] (S)-N-(4-amino-6-metil-5-(quinolin-3-il)-8,9- di-hidropirimido[5,4-b]indolizin-8-il)acrilamida ou um sal do mesmo a qualquer um dos itens 9 a 11, em que o EGFR tem adicionalmente uma mutação T790M. Item 13.

[0021] Uso de (S)-N-(4-amino-6-metil-5-(quinolin-3- il)-8,9-di-hidropirimido[5,4-b]indolizin-8-il)acrilamida ou um sal do mesmo para tratar um paciente com tumor maligno que expressa EGFR tendo pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste na mutação G719X no éxon 18, mutação E709X no éxon 18 e mutação L861X no éxon 21, em que X representa um resíduo de aminoácido arbitrário. Item 14.

[0022] O uso de acordo com o Item 13, em que a mutação no éxon 18 é pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste em G719A, G719S, G719C, E709K e E709A. Item 15.

[0023] O uso de acordo com o Item 13 ou 14, em que a mutação no éxon 21 é L861Q. Item 16.

[0024] O uso de acordo com qualquer um dos itens 13 a 15, em que o EGFR tem adicionalmente a mutação T790M. Item 17.

[0025] Uso de (S)-N-(4-amino-6-metil-5-(quinolin-3- il)-8,9-di-hidropirimido[5,4-b]indolizin-8-il)acrilamida ou um sal do mesmo para a produção de um agente farmacêutico para o tratamento de um paciente com tumor maligno que expressa EGFR tendo pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste na mutação G719X no éxon 18, mutação E709X no éxon 18 e mutação L861X no éxon 21, em que X representa um resíduo de aminoácido arbitrário. Item 18.

[0026] O uso de acordo com o Item 17, em que a mutação no éxon 18 é pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste em G719A, G719S, G719C, E709K e E709A. Item 19.

[0027] O uso de acordo com o Item 17 ou 18, em que a mutação no éxon 21 é L861Q. Item 20.

[0028] O uso de acordo com qualquer um dos itens 17 a 19, em que o EGFR tem adicionalmente a mutação T790M. Item 21.

[0029] Uma composição farmacêutica compreendendo (S)- N-(4-amino-6-metil-5-(quinolin-3-il)-8,9-di-hidropirimido [5,4-b]indolizin-8-il)acrilamida ou uma sal do mesmo e um carreador farmaceuticamente aceitável, para o tratamento de um paciente com tumor maligno que expressa EGFR tendo pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste na mutação G719X no éxon 18, mutação E709X no éxon 18 e mutação L861X no éxon 21, em que X representa um resíduo de aminoácido arbitrário. Item 22.

[0030] A composição farmacêutica de acordo com o Item 21, em que a mutação no éxon 18 é pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste em G719A, G719S, G719C, E709K e E709A. Item 23.

[0031] A composição farmacêutica de acordo com o Item

21 ou 22, em que a mutação no éxon 21 é L861Q. Item 24.

[0032] A composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos itens 21 a 23, em que o EGFR tem adicionalmente uma mutação T790M. Item 25.

[0033] Um método para prever efeitos terapêuticos da quimioterapia usando um agente antitumoral compreendendo, como um ingrediente ativo, (S)-N-(4-amino-6-metil-5- (quinolin-3-il)-8,9-di-hidropirimido[5,4-b]indolizin-8- il)acrilamida ou um sal do mesmo em um paciente com tumor maligno, o método compreendendo as etapas (1) e (2) abaixo: (1) uma etapa de detecção da presença ou ausência de mutação do gene EGFR contida em uma amostra biológica obtida do paciente; e (2) uma etapa de prever que a quimioterapia tem alta probabilidade de exibir efeitos terapêuticos suficientes em relação ao paciente quando nos resultados da detecção na etapa (1) verificou-se que o gene EGFR tem pelo menos uma mutação selecionada no grupo que consiste em mutação G719X no éxon 18, mutação E709X no éxon 18 e mutação L861X no éxon 21, em que X representa um resíduo de aminoácido arbitrário. Item 26.

[0034] O método de acordo com o Item 25, em que a mutação no éxon 18 é pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste em G719A, G719S, G719C, E709K e E709A. Item 27.

[0035] O método de acordo com o Item 25 ou 26, em que a mutação no éxon 21 é L861Q. Item 28.

[0036] O método de acordo com qualquer um dos itens 25 a 27, em que o EGFR tem adicionalmente uma mutação T790M. Item 29.

[0037] Um método para tratar um paciente com tumor maligno, compreendendo as etapas (1) a (3) abaixo: (1) uma etapa de detecção da presença ou ausência de mutação do gene EGFR contida em uma amostra biológica obtida do paciente; (2) uma etapa de prever que a quimioterapia usando um agente antitumoral compreendendo, como ingrediente ativo, (S)-N-(4-amino-6-metil-5-(quinolin-3-il)-8,9-di- hidropirimido[5,4-b]indolizin-8-il)acrilamida ou sal do mesmo é altamente provável que apresente efeitos terapêuticos suficientes em relação ao paciente quando nos resultados da detecção na etapa (1) verificou-se que o gene EGFR tem pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste na mutação G719X no éxon 18, mutação E709X no éxon 18 e mutação L861X no éxon 21, em que X representa um resíduo de aminoácido arbitrário; e (3) uma etapa de administração de (S)-N-(4-amino-6- metil-5-(quinolin-3-il)-8,9-di-hidropirimido[5,4- b]indolizin-8-il)acrilamida ou um sal do mesmo a um paciente com tumor maligno que era altamente provável que respondesse suficientemente à quimioterapia usando um agente antitumoral compreendendo, como ingrediente ativo, (S)-N-(4-amino-6- metil-5-(quinolin-3-il)-8,9-di-hidropirimido[5,4- b]indolizin-8-il)acrilamida ou um sal do mesmo, na etapa (2). Item 30.

[0038] O método de acordo com o Item 29, em que a mutação no éxon 18 é pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste em G719A, G719S, G719C, E709K e E709A. Item 31.

[0039] O método de acordo com o Item 29 ou 30, em que a mutação no éxon 21 é L861Q. Item 32.

[0040] O método de acordo com qualquer um dos itens 29 a 31, em que o EGFR tem adicionalmente uma mutação T790M. Efeitos vantajosos da invenção

[0041] O agente antitumoral da presente invenção exerce alta seletividade em relação ao EGFR mutante do éxon 18 e/ou éxon 21. Portanto, o agente antitumoral da presente invenção é útil em vista de prover um agente antitumoral que exerce efeitos terapêuticos superiores para um paciente com tumor maligno que expressa EGFR tendo mutação no éxon 18 e/ou éxon 21, para os quais os efeitos terapêuticos dos inibidores de EGFR anteriormente conhecidos são insuficientes.

[0042] A presente invenção também é útil em termos de prover um método para o tratamento de um paciente com tumor maligno que expressa EGFR tendo mutação no éxon 18 e/ou éxon

21.

[0043] Os inibidores de EGFR previamente conhecidos têm baixa seletividade em relação ao EGFR mutante no éxon 18 e no éxon 21, em comparação com o EGFR do tipo selvagem; portanto, a diferença entre a dosagem para garantir os efeitos antitumorais e a dosagem que causa os efeitos colaterais (distúrbios da pele, distúrbios do trato digestivo, etc.) derivados da inibição do EGFR do tipo selvagem foi pequena. Por conseguinte, os inibidores de EGFR previamente conhecidos têm dificuldade em exercer efeitos terapêuticos suficientes. Em contraste, uma vez que o agente antitumoral da presente invenção tem alta seletividade em relação ao EGFR mutante no éxon 18 e no éxon 21, é possível aumentar a dosagem sem causar efeitos colaterais derivados da inibição do EGFR do tipo selvagem. Portanto, o agente antitumoral da presente invenção exerce efeitos terapêuticos superiores para um paciente com tumor maligno que expressa EGFR tendo mutação no éxon 18 e/ou no éxon 21.

[0044] Além disso, o agente antitumoral da presente invenção exibiu alta atividade inibitória em relação ao EGFR mutante do éxon 18 e éxon 21 na presença da mutação T790M, que é uma mutação de resistência adquirida na região do éxon

20. Portanto, o agente antitumoral da presente invenção exerce efeitos terapêuticos superiores em relação a um paciente com tumor maligno cuja resposta ao fármaco existente é baixa devido à mutação de resistência adquirida causada pelo uso do agente antitumoral existente.

[0045] Além disso, o agente antitumoral da presente invenção também é útil em termos de redução da frequência de expressão da resistência adquirida durante os tratamentos usando inibidores de EGFR contra EGFR mutante no éxon 18 ou no éxon 21, que é uma mutação de novo, devido à sua alta atividade inibitória contra o EGFR mutante no éxon 18 e no éxon 21, mesmo sob a presença da mutação T790M, que é uma mutação de resistência adquirida na região do éxon 20. Breve descrição dos desenhos

[0046] A Fig. 1 ilustra o volume do tumor (que pode ser doravante denominado “VT”) de modelos de camundongos transplantados subcutaneamente com a linha celular que expressa o EGFR mutante G719A para medir o efeito antitumoral do composto A.

[0047] A Fig. 2 ilustra a mudança do peso corporal durante um período de dosagem de compostos de modelos de camundongos transplantados subcutaneamente com a linha celular que expressa o EGFR mutante G719A para medir a toxicidade do composto A.

[0048] A Fig. 3 ilustra o volume do tumor de modelos de camundongos transplantados subcutaneamente com a linha celular que expressa o EGFR mutante G719A + T790M para medir o efeito antitumoral do composto A.

[0049] A Fig. 4 ilustra a mudança do peso corporal durante um período de dosagem de compostos de modelos de camundongos transplantados subcutaneamente com a linha de células que expressam EGFR mutante G719A + T790M para medir a toxicidade do composto A. Descrição das Modalidades

[0050] Exemplos preferidos de várias definições no escopo da presente invenção usados nesse relatório descritivo são explicados abaixo em detalhes.

[0051] Nesse relatório descritivo, “EGFR” refere-se a uma proteína receptora do fator de crescimento epidérmico humano, e também é referido como ErbB-1 ou HER1.

[0052] Nesse relatório descritivo, “EGFR do tipo selvagem” refere-se ao EGFR livre de mutação somática, que é uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1 (número de acesso ao Banco de Genes: NP_005219.2).

[0053] Nesse relatório descritivo, “éxon 18” refere-se à região 688-728 na sequência de aminoácidos do EGFR do tipo selvagem (SEQ ID NO: 1).

[0054] Nesse relatório descritivo, “mutação no éxon 18” refere-se à mutação pontual no aminoácido na região do éxon 18 do EGFR do tipo selvagem (SEQ ID NO: 1). A mutação no éxon 18 preferida é a mutação pontual ou por exclusão com 1 substituição de aminoácido na região do éxon 18. Mais de preferência, a mutação no éxon 18 é E709X, que é uma mutação pontual na qual o ácido glutâmico codificado pelo códon 709 do éxon 18 é substituído por um aminoácido arbitrário; ou G719X, que é uma mutação pontual na qual a glicina codificada pelo códon 719 do éxon 18 é substituída por um aminoácido arbitrário. Mais especificamente, exemplos preferíveis de E709X incluem E709K, que é uma mutação pontual na qual o ácido glutâmico codificado pelo códon 709 na região do éxon 18 é substituído por lisina; e E709A, que é uma mutação pontual na qual o ácido glutâmico codificado pelo códon 709 na região do éxon 18 é substituído por alanina. Exemplos preferíveis de G719X incluem G719A, que é uma mutação pontual na qual glicina codificada pelo códon 719 na região do éxon 18 é substituída por alanina; G719S, que é uma mutação pontual na qual a glicina codificada pelo códon 719 na região do éxon 18 é substituída por serina; e G719C, que é uma mutação pontual na qual a glicina codificada pelo códon 719 na região do éxon 18 é substituída por cisteína. Entre estes, o G719A é particularmente preferível.

[0055] Na presente invenção, “éxon 21” refere-se à região 824-875 na sequência de aminoácidos do EGFR do tipo selvagem (SEQ ID NO: 1).

[0056] Nesse relatório descritivo, “mutação no éxon 21” refere-se à mutação pontual no aminoácido na região do éxon 21 do EGFR do tipo selvagem (SEQ ID NO: 1). A mutação no éxon 21 preferível é a mutação pontual com 1 substituição de aminoácido na região do éxon 21. Mais de preferência, a mutação no éxon 21 é L861X, que é uma mutação pontual na qual a leucina codificada pelo códon 861 na região do éxon 21 é substituída por um aminoácido arbitrário. Mais especificamente, é preferível L861Q, que uma mutação pontual na qual a leucina codificada pelo códon 861 na região do éxon 21 seja substituída por glutamina.

[0057] Na presente invenção, “mutação no éxon 18 e/ou éxon 21” abrange “mutação no éxon 18", “mutação no éxon 21” e “mutação no éxon 18 e no éxon 21".

[0058] Na presente invenção, “mutação pontual” refere- se à mutação que causa substituição, inserção ou exclusão de um ou mais (por exemplo, cerca de 1 a 10, de preferência cerca de 1 a 5, mais de preferência cerca de 1, 2 ou 3) resíduo(s) de aminoácidos; e pode incluir inserção na matriz e/ou mutação por exclusão como ácido nucleico.

[0059] “EGFR tendo mutação no éxon 18 e/ou éxon 21” abrange “EGFR tendo mutação no éxon 18", “EGFR tendo mutação no éxon 21” e “EGFR tendo mutação no éxon 18 e no éxon 21”.

[0060] Nesse relatório descritivo, o “EGFR tendo mutação no éxon 18” refere-se ao EGFR tendo pelo menos uma mutação no éxon 18. O EGFR pode ter duas ou mais mutações diferentes no éxon 18 e, de preferência, tem uma única mutação no éxon 18. Além disso, o EGFR também pode ter uma mutação diferente da mutação no éxon 18 (tal como a mutação por exclusão no éxon 19, mutação L858R ou mutação L790M).

[0061] Nesse relatório descritivo, o “EGFR tendo mutação no éxon 21” refere-se ao EGFR tendo pelo menos uma mutação no éxon 21. O EGFR pode ter duas ou mais mutações diferentes no éxon 21 e, de preferência, tem uma única mutação no éxon 21. Além disso, o EGFR também pode ter uma mutação diferente da mutação no éxon 21 (tal como mutação por exclusão no éxon 19, mutação L858R ou mutação L790M).

[0062] Além disso, o EGFR tendo mutação no éxon 18 e/ou no éxon 21 pode adicionalmente ter a mutação T790M. T790M é uma mutação de resistência adquirida na região do éxon 20. Sabe-se que o T790M é gerado pelo uso de inibidores de EGFR existentes. A aquisição do T790M geralmente diminui os efeitos do fármaco existente em relação a pacientes com tumores malignos.

[0063] Na presente invenção, especificamente, o EGFR tendo mutação no éxon 18 e/ou éxon 21 adicionalmente tendo mutação T790M é, de preferência, um de EGFR tendo mutação E709X e/ou G719X na região do éxon 18 tendo mutação T790M, e EGFR tendo a mutação L861X na região do éxon 21 tendo adicionalmente a mutação T790M. Na presente invenção, mais especificamente, o EGFR tendo mutação no éxon 18 e/ou no éxon 21 adicionalmente tendo mutação T790M é, de preferência, um de EGFR tendo mutação E709K ou E709A adicional tendo mutação T790M, EGFR tendo mutação G719A, G719S ou G719C adicionalmente tendo mutação T790M, e EGFR tendo mutação L861Q tendo mutação T790M. Entre estes, são particularmente preferíveis o EGFR tendo mutação G719A tendo adicionalmente mutação T790M e o EGFR tendo mutação L861Q tendo mutação T790M.

[0064] Na presente invenção, o método para detectar a mutação do EGFR no éxon 18 e/ou no éxon 21 expressada por um paciente com tumor maligno não é particularmente limitado, na medida em que o método é capaz de detectar as mutações,

e quaisquer métodos de detecção conhecidos podem ser usados.

[0065] A amostra usada na detecção da mutação no éxon 18 e/ou éxon 21 não é particularmente limitada, desde que a amostra seja uma amostra biológica isolada de um paciente com tumor maligno, em particular, uma amostra obtida de um paciente com tumor maligno e contenha células tumorais malignas. Exemplos de amostras biológicas incluem fluidos corporais (por exemplo, sangue, urina etc.), tecidos, extratos dos mesmos, e as culturas dos tecidos obtidos. O método para obter uma amostra biológica pode ser adequadamente selecionado, dependendo do tipo de amostra biológica.

[0066] A amostra biológica é preparada sendo tratada adequadamente de acordo com o método de medição. Além disso, o reagente que compreende o iniciador ou a sonda usado(a) para a detecção pode ser preparado por um método convencional de acordo com o método de medição para o mesmo.

[0067] Em uma modalidade da presente invenção, uma etapa de detecção da presença da mutação no éxon 18 e/ou do éxon 21 do EGFR expressada por um paciente com tumor maligno pode ser realizada antes da administração de um agente antitumoral a um paciente com tumor maligno.

[0068] Um tumor maligno pode incluir dois ou mais tipos diferentes de células tumorais malignas. Além disso, dois ou mais tumores malignos podem ser gerados em um único paciente. Portanto, um único paciente pode ter mutações diferentes na mesma posição de aminoácido de EGFR (por exemplo, a mutação no éxon 18 é a mutação G719A, G719S e G719C no éxon 18; mutação no éxon 18E709K e E709A) ao mesmo tempo.

[0069] O agente antitumoral da presente invenção compreende, como ingrediente ativo, (S)-N-(4-amino-6-metil- 5-(quinolin-3-il)-8,9-di-hidropirimido[5,4-b]indolizin-8- il)acrilamida (Composto (A)) ou um sal do mesmo. O composto (A) é representado pela seguinte fórmula química.

[0070] O método para produzir o composto da presente invenção é explicado abaixo.

[0071] O composto A da presente invenção pode ser produzido, por exemplo, através do método de produção divulgado em WO2015/025936A1, os métodos descritos nos Exemplos e similares. No entanto, o método de produção do composto da presente invenção não está limitado a estes exemplos de reação.

[0072] Quando o composto A da presente invenção tem isômeros, tais como, isômeros ópticos, estereoisômeros e tautômeros, qualquer um dos isômeros e misturas dos mesmos são incluídos no escopo do composto da presente invenção, a menos que especificado de outra forma. Por exemplo, quando o Composto A da presente invenção tem isômeros ópticos, misturas racêmicas e os isômeros ópticos separados de uma mistura racêmica também são incluídos no escopo do composto da presente invenção, a menos que especificado de outra forma.

[0073] Os sais do Composto A referem-se a quaisquer sais farmaceuticamente aceitáveis; exemplos incluem sais de adição de base e sais de adição de ácido.

[0074] Exemplos de sais de adição de base incluem sais de metais alcalinos, tais como sais de sódio e sais de potássio; sais de metais alcalino-terrosos, tais como, sais de cálcio e sais de magnésio; sais de amônio; e sais de amina orgânica, tais como, sais de trimetilamina, sais de trietilamina, sais de diciclo-hexilamina, sais de etanolamina, sais de dietanolamina, sais de trietanolamina, sais de procaína e sais de N,N’-dibenziletilenodiamina.

[0075] Exemplos de sais de adição de ácido incluem sais de ácido inorgânico, tais como, cloridratos, sulfatos, nitratos, fosfatos e percloratos; sais de ácidos orgânicos, tais como, acetatos, formiatos, maleatos, fumaratos, tartaratos, citratos, ascorbatos e trifluoroacetatos; e sulfonatos, tais como, metanossulfonatos, isionionatos, benzenossulfonatos e p-toluenossulfonatos.

[0076] O composto da presente invenção e sais do mesmo, também incluem pró-fármacos. Um pró-fármaco refere-se a um composto que pode ser convertido no composto da presente invenção ou em um sal do mesmo através de uma reação com uma enzima, ácido gástrico ou similar, sob condições fisiológicas in vivo, isto é, um composto que pode ser convertido no composto da presente invenção ou um sal do mesmo por oxidação enzimática, redução, hidrólise ou semelhantes; ou um composto que pode ser convertido no composto da presente invenção ou um sal do mesmo por hidrólise ou semelhantes com ácido gástrico ou semelhantes.

Além disso, o pró-fármaco pode ser compostos que podem ser convertidos no composto da presente invenção ou um sal do mesmo sob condições fisiológicas, tais como os descritos em “Iyakuhin no Kaihatsu [Development of Pharmaceuticals],” vol. 7, Molecular Design, publicado em 1990 por Hirokawa Shoten Co., págs. 163-198. Descrição das Doenças

[0077] Exemplos específicos de tumores direcionados na presente invenção incluem, mas não são particularmente limitados a, câncer de cabeça e pescoço, câncer gastrointestinal (câncer de esôfago, câncer de estômago, câncer duodenal, câncer de fígado, câncer biliar (por exemplo, câncer de vesícula biliar e ducto biliar), câncer de pâncreas, câncer colorretal (por exemplo, câncer de cólon e câncer retal), etc.), câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de células pequenas e mesotelioma), câncer de mama, câncer genital (câncer de ovário, câncer uterino (por exemplo, câncer cervical e câncer endometrial) etc.), câncer urológico (por exemplo, câncer renal, câncer de bexiga, câncer de próstata e tumor testicular), tumor hematopoiético (por exemplo, leucemia, linfoma maligno e mieloma múltiplo), osteossarcoma, sarcoma de tecidos moles, câncer de pele, tumor cerebral e similares. Exemplos preferidos incluem câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço, tumor cerebral, câncer uterino, câncer de órgãos digestivos, tumor hematopoiético ou câncer de pele. O câncer de pulmão é particularmente preferível.

[0078] Quando o Composto A ou um sal do mesmo é usado como agente farmacêutico, pode ser adicionado um carreador farmacêutico, se necessário, formando assim uma forma de dosagem adequada de acordo com fins de prevenção e tratamento. Exemplos da forma de dosagem incluem preparações orais, injeções, supositórios, pomadas, adesivos e similares. Preparações orais são preferíveis. Tais formas de dosagem podem ser formadas por métodos convencionalmente conhecidos pelas pessoas habilitadas na técnica.

[0079] Em uma modalidade, o agente antitumoral da presente invenção é provido como uma composição farmacêutica compreendendo o Composto A ou um sal do mesmo, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0080] Como carreador farmaceuticamente aceitável, vários materiais carreadores orgânicos ou inorgânicos convencionais usados como materiais de preparação podem ser combinados como excipiente, aglutinante, desintegrante, lubrificante ou colorante em preparações sólidas; ou como solvente, agente solubilizante, agente de suspensão, agente isotonizante, tampão ou agente calmante em preparações líquidas. Além disso, aditivos de preparação farmacêutica, tais como, antissépticos, antioxidantes, colorantes, adoçantes e estabilizadores, também podem ser usados, se necessário.

[0081] Preparações sólidas orais são preparadas como a seguir. Depois de um excipiente ser adicionado opcionalmente com um excipiente, aglutinante, desintegrante, lubrificante, colorante, mascarador de sabor ou agente aromatizante, etc., ao composto da presente invenção, a mistura resultante é formulada em comprimidos, comprimidos revestidos, grânulos, pós, cápsulas ou similares por métodos comuns.

[0082] Exemplos de excipientes incluem lactose,

sacarose, D-manitol, glicose, amido, carbonato de cálcio, caulim, celulose microcristalina e ácido silícico anidrido. Exemplos de aglutinantes incluem água, etanol, 1-propanol, 2-propanol, xarope simples, glicose líquida, α-amido líquido, gelatina líquida, D-manitol, carboximetil celulose, hidroxipropil celulose, hidroxipropil amido, metil celulose, etil celulose, goma-laca, fosfato de cálcio, polivinilpirrolidona e similares. Exemplos de desintegradores incluem amido seco, alginato de sódio, ágar em pó, hidrogenocarbonato de sódio, carbonato de cálcio, laurilssulfato de sódio, monoglicerídeo de ácido esteárico, lactose e similares. Exemplos de lubrificantes incluem talco purificado, estearato de sódio, estearato de magnésio, bórax, polietilenoglicol e similares. Exemplos de colorantes incluem óxido de titânio, óxido de ferro e similares. Exemplos de agentes mascaradores de sabor ou aromatizantes incluem sacarose, casca de laranja amarga, ácido cítrico, ácido tartárico e similares.

[0083] Quando uma preparação líquida para administração oral é preparada, um agente mascarador de sabor, um tampão, um estabilizador, um agente aromatizante e similares podem ser adicionados ao composto da presente invenção; e a mistura resultante pode ser formulada em uma preparação líquida oral, xarope, elixir, etc., de acordo com um método comum.

[0084] Quando um agente de injeção é preparado, um regulador de pH, um tampão, um estabilizador, um agente isotonizante, um anestésico local e similares, podem ser adicionados ao composto da presente invenção; e a mistura pode ser formulada em uma injeção subcutânea, intramuscular ou intravenosa, de acordo com um método comum.

[0085] Exemplos do ajustador de pH e do tampão usados nesse documento incluem citrato de sódio, acetato de sódio e fosfato de sódio. Exemplos do estabilizador incluem pirossulfito de sódio, EDTA, ácido tioglicólico e ácido tiolático. Exemplos do anestésico local incluem cloridrato de procaína e cloridrato de lidocaína. Exemplos do agente de tonicidade incluem cloreto de sódio, glicose, D-manitol e glicerol.

[0086] Quando um supositório é preparado, carreadores farmaceuticamente aceitáveis conhecidos no campo relacionado, tais como, polietileno glicol, lanolina, manteiga de cacau e triglicerídeo de ácidos graxos; e conforme necessário, tensoativos, tal como Tween 80 (marca comercial), podem ser adicionados ao Composto A, e a mistura resultante pode ser formulada em um supositório de acordo com um método comum.

[0087] Quando uma pomada é preparada, uma base, um estabilizador, um agente umectante, um conservante e similares comumente usados, podem ser combinados no Composto A, conforme necessário; e a mistura obtida é misturada e formulada em uma pomada de acordo com um método comum.

[0088] Exemplos da base incluem parafina líquida, petrolato branco, cera de abelha branca, álcool octil dodecílico e parafina.

[0089] Exemplos do conservante incluem paraoxibenzoato de metila, paraoxibenzoato de etila e paraoxibenzoato de propila.

[0090] Quando um adesivo é preparado, a pomada, o creme, o gel, a pasta ou similares descritos acima, podem ser aplicados a um substrato comum de acordo com um método comum.

[0091] Exemplos de substratos incluem tecidos tecidos ou tecidos não tecidos compreendendo algodão, fibras descontínuas ou fibras químicas; e também podem ser usados filmes ou folhas de espuma de cloreto de vinila macio, polietileno, poliuretano, etc.

[0092] A quantidade de Composto A a ser incorporada em cada uma dessas formas unitárias de dosagem depende da condição do paciente ao qual o composto é administrado, a forma de dosagem do mesmo, etc. Em geral, no caso de um agente oral, a quantidade do composto é, de preferência, 0,05 a 1000 mg por forma de dosagem unitária. No caso de uma injeção, a quantidade do composto é, de preferência, de 0,01 a 500 mg por forma de dosagem unitária; e no caso de um supositório, a quantidade do composto é, de preferência, 1 a 1000 mg por forma de dosagem unitária.

[0093] Além disso, a dose diária do medicamento nessa forma de dosagem depende da condição, do peso corporal, da idade, do sexo, etc. do paciente e não pode ser generalizada ou limitada. Usualmente, a dose diária para um adulto (peso corporal: 50 kg) do Composto A pode geralmente ser de 0,05 a 5000 mg e, de preferência, de 0,1 a 1000 mg; e é de preferência administrado em uma dose, ou em duas a três doses divididas, por dia.

[0094] A presente invenção também provê um método para o tratamento de um paciente com tumor maligno, compreendendo a etapa de administração do Composto A ou um sal do mesmo a um paciente com tumor maligno que expressa EGFR tendo mutação no éxon 18 e/ou no éxon 21.

[0095] A presente invenção também provê o Composto A ou um sal do mesmo para o tratamento de um paciente com tumor maligno que expressa EGFR tendo mutação no éxon 18 e/ou no éxon 21.

[0096] A presente invenção também provê uso do Composto A ou um sal do mesmo para o tratamento de um paciente com tumor maligno que expressa EGFR tendo mutação no éxon 18 e/ou no éxon 21.

[0097] A presente invenção também provê o uso do Composto A ou um sal do mesmo para a produção de um agente farmacêutico para o tratamento de um paciente com tumor maligno que expressa EGFR tendo mutação no éxon 18 e/ou no éxon 21.

[0098] A presente invenção também provê uma composição farmacêutica para o tratamento de um paciente com tumor maligno que expressa EGFR tendo mutação no éxon 18 e/ou éxon 21, a composição farmacêutica compreendendo o Composto A ou um sal do mesmo, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0099] A presente invenção também provê um método para prever efeitos terapêuticos da quimioterapia usando um agente antitumoral compreendendo, como ingrediente ativo, o Composto A ou um sal do mesmo em um paciente com tumor maligno, o método compreendendo as etapas (1) e (2) abaixo: (1) uma etapa de detecção da presença ou ausência de mutação do gene EGFR contida em uma amostra biológica obtida do paciente; e (2) uma etapa de prever que a quimioterapia tem alta probabilidade de exibir efeitos terapêuticos suficientes para o paciente quando nos resultados da detecção na etapa (1) verificou-se que o gene EGFR tem mutação no éxon 18 e/ou no éxon 21.

[00100] A presente invenção também provê um método para o tratamento de um paciente com tumor maligno, compreendendo as etapas (1) a (3) abaixo: (1) uma etapa de detecção da presença ou ausência de mutação do gene EGFR contida em uma amostra biológica obtida do paciente; e (2) uma etapa de prever que a quimioterapia usando um agente antitumoral compreendendo, como ingrediente ativo, (S)-N-(4-amino-6-metil-5-(quinolin-3-il)-8,9-di- hidropirimido[5,4-b]indolizin-8-il)acrilamida ou um sal do mesmo é altamente provável que apresente efeitos terapêuticos suficientes em relação ao paciente quando nos resultados da detecção na etapa (1) verificou-se que o gene EGFR tem a mutação no éxon 18 e/ou no éxon 21; e (3) uma etapa de administração de (S)-N-(4-amino-6- metil-5-(quinolin-3-il)-8,9-di-hidropirimido[5,4- b]indolizin-8-il)acrilamida ou um sal do mesmo a um paciente com tumor maligno que foi altamente provável que respondesse suficientemente à quimioterapia usando um agente antitumoral compreendendo, tal como ingrediente ativo, (S)-N-(4-amino- 6-metil-5-(quinolin-3-il)-8,9-di-hidropirimido[5,4- b]indolizin-8-il)acrilamida ou um sal do mesmo, na etapa (2).

[00101] A sequência base do gene EGFR é publicamente conhecida. O número de acesso do Banco de Genes da sequência base de cDNA é NM_005228.4.

[00102] Os “efeitos terapêuticos” podem ser avaliados por efeitos de encolhimento do tumor, efeitos de supressão de recaídas, efeitos de prolongamento da vida e similares. Os efeitos supressores de recaídas podem ser mostrados como o grau da extensão do período sem recaídas ou o grau de melhora na taxa de recaídas; e os efeitos de prolongamento da vida podem ser mostrados como o grau de todo o tempo de sobrevivência ou o grau da extensão da média da sobrevida livre de progressão, ou similares. Os “efeitos terapêuticos suficientes” da quimioterapia usando um agente antitumoral compreendendo, tal como ingrediente ativo, o Composto A ou um sal do mesmo significa, por exemplo, que efeitos terapêuticos superiores são obtidos pela administração do agente antitumoral compreendendo, como um ingrediente ativo, Composto A ou um sal do mesmo, tal como extensão do tempo de sobrevivência, supressão de recaída e similares, em comparação com a não administração. Exemplos

[00103] O seguinte descreve a presente invenção em mais detalhes com referência aos seguintes Exemplos de Teste. No entanto, a presente invenção não está limitada a estes exemplos (Exemplos de Teste). Exemplo de teste 1: Teste de Eficácia de Fármacos In Vitro Resultados de Avaliação da Fosforilação Intracelular no Sistema de Expressão Forçado de EGFR mutante Usando Células HEK293 (atividade inibitória)

[00104] A atividade inibitória alvo intracelular de compostos foi avaliada com base no seguinte como um índice: fosforilação intracelular de EGFR em um sistema de expressão forçado de EGFR mutante usando células HEK293 Jump-In (marca comercial) Grip (marca comercial) (Thermo Fisher Scientific Inc.) (que podem ser doravante referidos como “células HEK293”).

[00105] As células HEK293 foram mantidas em D-MEM com

GlutaMAX (marca comercial)-I (alto teor de glicose) (Thermo Fisher Scientific Inc.) que continha FBS a 10% dialisado e 100 U/mL de penicilina/100 μg/mL de estreptomicina (Thermo Fisher Scientific Inc .); e um vetor pA de CMV R4 DEST pJTI no qual um gene EGFR humano (G719A, G719S, G719C, E709K, E709A, L861Q, G719A + T790M ou L861Q + T790M; o símbolo “+” indica que as duas mutações estão contidas) codificado foi introduzido nas células HEK293, juntamente com Opti-MEM (marca comercial) I (Thermo Fisher Scientific Inc.), usando um reagente de transfecção ViaFect (marca comercial) (Promega Corporation).

[00106] As células HEK293 que expressam EGFR humano mutante foram semeadas em cada poço de uma microplaca de fundo plano de 384 poços, de modo que a contagem de células por poço fosse 10.000, e incubadas em uma incubadora contendo gás CO2 a 5% a 37°C por 1 dia. O composto A, erlotinibe, afatinibe e osimertinibe (cada um de erlotinibe, afatinibe e osimertinibe pode ser daqui em diante referidos como “composto comparativo”) foram dissolvidos individualmente em DMSO e diluídos com DMSO ou o meio usado para suspender as células. As soluções foram então adicionadas individualmente a cada poço da placa de cultura das células, e as células foram incubadas em uma incubadora contendo gás CO2 a 5% a 37°C por 6 horas. Após a incubação, as células foram imobilizadas usando formalina tamponada neutra a 20% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e bloqueadas por um tampão de bloqueio Odyssey (marca comercial) (PBS) (M&S TechnoSystems Inc.). As células foram então reagidas com um anticorpo primário (Anticorpo Monoclonal para EGFR (R19/48MIX) # AHR5062) (Thermo Fisher Scientific Inc.) que foi diluído com um tampão de bloqueio (PBS) Odyssey (marca comercial) para 1/200 e um Anticorpo para Receptor Phospho- EGFR (Tyr1068) #2234L (CST)), seguido de sujeição das células à permeação a 4°C durante a noite. No dia seguinte, as células reagiram com um anticorpo secundário (IRDye 800CW Goat aRabbit #926-32211 e IRDye 680RD Goat aMouse #926-68070 (M&S TechnoSystems Inc.)) diluído com um tampão de bloqueio Odyssey (marca comercial) (PBS) para 1/800 e submetido à permeação em temperatura ambiente por 1 hora. A intensidade da fluorescência (que pode ser doravante denominada “IF”) foi detectada com um Sistema de Formação de Imagem por Infravermelho Odyssey (LI-COR Bioscience) a um comprimento de onda de fluorescência de 800 nm e 700 nm.

[00107] O valor obtido deduzindo o IF de um poço sem as células do IF detectadas em um comprimento de onda de fluorescência de 800 nm ou 700 nm é referido como IF (800, EGFR)-em Branco (para 800 nm) e IF (700, p-EGFR)- em Branco (para 700 nm). O valor obtido pela divisão do IF (700, p- EGFR)-em Branco de cada poço pelo IF (800, EGFR)-em Branco foi determinado como IF (p-EGFR/EGFR). A taxa inibitória do EGFR fosforilado foi calculada usando a fórmula a seguir para determinar a concentração dos compostos de teste na qual o EGFR fosforilado foi inibido em 50% (IC50 (μM)). A tabela 1 ilustra os resultados. Taxa de EGFR fosforilado (%) = T/C × 100 T: IF (p-EGFR/EGFR) de um poço ao qual um composto de teste foi adicionado. C: IF (p-EGFR/EGFR) de um poço ao qual um composto de teste não foi adicionado.

[00108] Como é evidente na Tabela 1, o composto A exibiu alta atividade inibitória contra a fosforilação intracelular do EGFR mutante no éxon 18 ou no éxon 21; e a atividade foi maior que a do erlotinibe ou osimertinibe e foi equivalente à do afatinibe. A atividade inibitória do composto A contra o EGFR mutante no éxon 18 ou no éxon 21 foi maior que a do afatinibe na presença da mutação T790M, que é uma mutação resistente adquirida. Tabela 1 Composto A Osimertinibe Afatinibe Erlotinibe da Presente Invenção G719A 20,5 237,0 20,0 >1000 G719S 22,7 251,9 16,9 539,7 G719C 9,3 102,0 15,3 98,3 E709K 86,0 424,2 14,0 451,4 E709A 103,5 548,9 19,2 478,1 L861Q 40,5 143,1 24,7 608,1 G719A+ 31,3 132,1 110,2 >1000 T790M L861Q+ 81,8 132,4 177,6 >1000 T790M Exemplo de Teste 2 Avaliação do Efeito Inibitório do Crescimento Celular contra Linhagens de Células que Expressam EGFR do Tipo Selvagem e EGFR Mutante (In Vitro)

[00109] A atividade inibitória de compostos contra EGFR do tipo selvagem e EGFR mutante foi avaliada usando células Ba/F3, que são a linha celular precursora de linfócitos B de camundongo na qual um gene EGFR humano foi introduzido. As células Ba/F3 foram mantidas em meio RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific Inc.) contendo soro fetal bovino a 10% (FBS), 100 U/mL de penicilina/100 μg/mL de estreptomicina (Thermo Fisher Scientific Inc.), e 1 ng/mL de interleucina-3 de camundongo (mIL-3) (CST). Um vetor PB-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro ou vetor PB-CMV-MCS-EF1-RFP+Puro no qual um gene EGFR humano (tipo selvagem (WT), G719A ou L861Q) foi introduzido nas células, juntamente com um vetor de expressão Super PiggyBac Transposase, por eletroporação usando um Kit Nucleofector de Linha de Células V da Amaxa (marca comercial), seguido de seleção usando puromicina (SIGMA). As células Ba/F3 que expressam EGFR de tipo selvagem (que podem ser doravante denominadas “Ba/F3-EGFR_WT”) exibiram um crescimento independente de mIL-3 na presença de 50 ng/mL de EGF (R&D Systems); e células Ba/F3 que expressam EGFR mutante ativo no éxon 18 ou no éxon 21 (que podem ser doravante referidos como “Ba/F3-EGFR G719A” e “Ba/F3-EGFR L861Q”) exibiram um crescimento independente de mIL-3 no ausência de EGF.

[00110] Para avaliar um efeito Inibitório do crescimento celular, as células Ba/F3-EGFR_WT foram colocadas em suspensão em um meio RPMI-1640 contendo FBS a 10%, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina e 50 ng/mL de EGF; e a suspensão de células foi semeada em cada poço de uma microplaca de fundo plano de 96 poços, de modo que a contagem de células por poço fosse de 30.000. As células Ba/F3-EGFR G719A e as células Ba/F3-EGFR L861Q foram colocadas em suspensão nos respectivos meios RPMI-1640 contendo FBS a 10%, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina; e as suspensões celulares foram semeadas individualmente em cada poço de uma microplaca de fundo plano de 96 poços, de modo que a contagem de células por poço fosse de 15.000. Posteriormente, o composto A, gefitinibe, erlotinibe, afatinibe e osimertinibe (gefitinibe, erlotinibe, afatinibe e osimertinibe podem ser daqui em diante referidos como “composto comparativo”) foram dissolvidos individualmente em DMSO, e diluídos com DMSO ou o meio usado para colocar as células em suspensão. As soluções foram então adicionadas a cada poço da placa de cultura das células, e as células foram incubadas em uma incubadora contendo 5% gás CO2 a 37°C por 3 dias. A contagem de células após a incubação foi medida por um Ensaio de Viabilidade Celular Luminescente CellTiter-Glo (marca comercial) (Promega Corporation) de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. A taxa de crescimento foi calculada usando a seguinte fórmula para determinar a concentração de cada composto de teste para inibição de 50% (IC50 (μM)). T: Taxa de Crescimento (%) = T/C × 100 T: a intensidade de luminescência de um poço ao qual foi adicionado um composto de teste. C: a intensidade de luminescência de um poço ao qual não foi adicionado um composto de teste.

[00111] A razão IC50 entre EGFR do tipo selvagem e EGFR mutante G719A, ou entre EGFR do tipo selvagem e EGFR mutante L861Q foi determinada usando a fórmula a seguir. A tabela 2 ilustra os resultados. Razão IC50 = IC50 (WT)/IC50 (G719A ou L861Q)

[00112] Como é evidente na Tabela 2, o composto A exibiu atividade inibitória seletiva contra a mutação G719A e a mutação L861Q. Tabela 2 IC50 (nM) Razão IC50 WT G719A L861Q WT/G719A WT/L861Q Composto A 597,3 9,0 19,0 66,4 31,4 da Presente Invenção Osimertinibe 378,7 209,0 47,0 1,8 8,1

Afatinibe 17,7 3,3 2,3 5,3 7,6 Erlotinibe 778,3 336,3 353,0 2,3 2,2 Exemplo de teste 3: Teste de Eficácia de Fármacos In Vivo Avaliação do Efeito Antitumoral no Modelo de Camundongo Transplantado Subcutaneamente com A Linha Celular Que Expressa o EGFR Mutante G719A

[00113] A avaliação em modelos de camundongo transplantados subcutaneamente com a linha de células que expressam EGFR mutante G719A foi realizada usando células NIH-3T3, que são a linha de células de fibroblastos de camundongos na qual um gene de EGFR humano foi introduzido. As células NIH-3T3 foram mantidas em um meio D-MEM (alto teor de glicose) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) contendo soro de bezerro recém-nascido a 10% (NBCS), 1.500 mg/L de hidrogenocarbonato de sódio e 100 U/mL de penicilina/100 µg/mL de estreptomicina (Thermo Fisher Scientific Inc.); e um vetor PB-CMV-MCS-EF1-RFP Puro no qual um gene EGFR humano (G719A) foi codificado foi introduzido nas células, juntamente com um vetor de expressão Super PiggyBac Transposase, por eletroporação usando um Kit Nucleofector de linha celular R da Amaxa (marca comercial), seguido de seleção usando puromicina (SIGMA). As células NIH-3T3 que expressam EGFR mutante no éxon 18 (que pode ser doravante referido como “NIH3T3-EGFR G719A”) exibiram crescimento na ausência de EGF sob condições de NBCS a 1%.

[00114] Na avaliação usando modelos de camundongo transplantados subcutaneamente com a linha de células que expressam EGFR mutante G719A, camundongos nus foram transplantados subcutaneamente com células NIH3T3-EGFR G719A nas quais um EGFR humano mutante foi introduzido. No ponto em que o volume do tumor enxertado nos camundongos cresceu para cerca de 100 a 200 mm3, os camundongos foram alocados em grupos, 5 ou 6 camundongos para cada grupo, por randomização estratificada, de modo que o volume médio do tumor entre os grupos era uniforme. Os camundongos foram então administrados por via oral o composto A, afatinibe ou osimertinibe uma vez por dia durante 14 dias consecutivos.

[00115] A dose de afatinibe foi de 20 mg/kg/dia, que é a dose máxima tolerada (a dose máxima na qual a perda de peso durante um período de dosagem é menor que 20%), por 14 dias, o período de dosagem deste teste. A dose de osimertinibe foi de 25 mg/kg/dia, que é uma dose clinicamente eficaz. Para o composto A, foram estabelecidos três tipos de doses: 200 mg/kg/dia (dose máxima tolerada), 100 mg/kg/dia e 50 mg/kg/dia. A dose máxima tolerada foi determinada de acordo com as “Diretrizes que Envolvem Propostas Experimentais de Neoplasia em Camundongos e Ratos” do Instituto Nacional do Câncer (INC), de uma perspectiva humanitária.

[00116] Para comparar as alterações no crescimento do tumor ao longo do tempo devido à administração dos compostos de teste individuais, o volume do tumor (que pode ser daqui em diante referido como “VT”) foi usado como um índice. Para um índice de toxicidade, o peso corporal foi medido ao longo do tempo, e a alteração do peso corporal (a seguir denominada “BWC (%)”), a partir do dia em que os camundongos foram divididos em grupos, foi calculada de acordo com a seguinte fórmula. BWC (%) = (o peso corporal medido no dia da medição do peso corporal)/(o peso corporal no dia em que os camundongos foram divididos em grupos)

[00117] Quando a diferença no VT média entre o grupo de controle e o grupo administrado com um composto de teste no dia final da avaliação foi estatisticamente significante (teste de Dunnett, p<0,05), e o valor do tratamento/controle (T/C) calculado usando a fórmula seguinte era menor que 100, o composto de teste foi determinado como sendo eficaz. Tal caso é indicado pelo símbolo “*” nas figuras. T/C (%) = (o VT médio do grupo administrado com um composto de teste)/(o VT médio do grupo DE controle) × 100

[00118] Como é evidente a partir dos resultados ilustrados na Fig. 1, o composto A da presente invenção exibiu um efeito antitumoral notável na linha de células que expressam EGFR mutante G719A transplantadas subcutaneamente em camundongos nus, acompanhada de regressão tumoral. O efeito também foi maior que o do afatinibe ou osimertinibe. Os camundongos não apresentaram sintomas, como perda grave de peso, como ilustrado na Fig. 2, fezes anormais ou pele anormal. Exemplo de teste 4: Teste de Eficácia de Fármacos In Vitro Avaliação do Efeito Inibitório do Crescimento Celular na Linha de Células que Expressam EGFR Mutante T790M (In Vitro)

[00119] A atividade inibitória de um composto no EGFR mutante T790M foi avaliada usando células Ba/F3, que são a linha celular precursora de linfócitos B de camundongo na qual um gene EGFR humano foi introduzido. As células Ba/F3 foram mantidas em meio RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific Inc.) contendo soro fetal bovino a 10% (FBS), 100 U/mL de penicilina/100 μg/mL de estreptomicina (Thermo Fisher Scientific Inc.) e 1 ng/mL de interleucina-3 de camundongo

(mIL-3) (CST); e um vetor PB-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro ou vetor PB-CMV-MCS-EF1-RFP+Puro no qual um gene EGFR humano (tipo selvagem (WT), G719A+T790M ou L861Q+T790M) foi codificado foi introduzido nas células, juntamente com um vetor de expressão Super PiggyBac Transposase, por eletroporação usando um Kit Nucleofector de Linha Celular V da Amaxa (marca comercial), seguido de seleção usando puromicina (SIGMA). As células Ba/F3 que expressam EGFR mutante G719A+T790M ou EGFR mutante L861Q+T790M (que podem ser doravante denominadas “Ba/F3-EGFR G719A + T790M” e “Ba/F3-EGFR L861Q + T790M”) exibiram Crescimento independente de mIL-3 na ausência de EGF.

[00120] Para avaliar um efeito Inibitório do crescimento celular, as células Ba/F3-EGFR G719A+T790M e as células Ba/F3-EGFR L861Q+T790M foram colocadas em suspensão individualmente em um meio RPMI-1640 contendo FBS a 10%, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina; e as suspensões celulares foram semeadas individualmente em cada poço de uma microplaca de fundo plano de 96 poços, de modo que a contagem de células por poço fosse de 15.000. Subsequentemente, o composto A, gefitinibe, erlotinibe, afatinibe e osimertinibe (gefitinibe, erlotinibe, afatinibe e osimertinibe podem ser daqui em diante referidos como “composto comparativo”) foram dissolvidos individualmente em DMSO, e diluídos com DMSO ou o meio usado para colocar em suspensão as células. Estas soluções foram então adicionadas a cada poço da placa de cultura das células, e incubadas em uma incubadora contendo gás CO2 a 5% a 37°C por 3 dias. A contagem de células após a incubação foi medida usando um Ensaio de Viabilidade Celular Luminescente CellTiter-Glo

(marca comercial) (Promega Corporation), de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. A taxa de crescimento foi calculada usando a seguinte fórmula para determinar a concentração de cada composto de teste para inibição de 50% (IC50 (μM)). Taxa de crescimento (%) = T/C × 100 T: a intensidade de luminescência de um poço ao qual foi adicionado um composto de teste. C: a intensidade de luminescência de um poço ao qual o composto de teste não foi adicionado.

[00121] Adicionalmente, a razão IC50 entre EGFR do tipo selvagem e EGFR mutante G719A+T790M, ou entre EGFR do tipo selvagem e EGFR mutante L861Q+T790M foi calculada usando a fórmula a seguir. A tabela 3 ilustra os resultados. Relação IC50 = IC50 (WT)/IC50 (G719A+T790M ou L861Q+T790M)

[00122] Como é evidente na Tabela 3, o composto A exibiu atividade inibitória seletiva contra a mutação G719A+T790M e a mutação L861Q+T790M. Tabela 3 IC50 (nM) Razão IC50 G719A+T790M L861Q+T790M WT/ WT/ G719A+T790M L861Q+T790M Composto A da 15,8 37,5 37,9 15,9 Presente Invenção Osimertinibe 89,4 36,4 4,2 10,4 Afatinibe 68,2 168,7 0,3 0,1 Erlotinibe 8030,0 6424,2 0,1 0,1 Exemplo de teste 5: Teste de eficácia de fármacos In Vivo Avaliação do Efeito Antitumoral no Modelo de Camundongo Transplantado Subcutaneamente com a Linha Celular que expressa EGFR mutante G719A+T790M

[00123] A avaliação dos modelos de camundongo transplantados subcutaneamente com a linha celular que expressa EGFR mutante G719A+T790M foi realizada usando células NIH-3T3, que são a linha celular de fibroblasto de camundongo na qual um gene EGFR humano foi introduzido. As células NIH-3T3 foram mantidas em um meio D-MEM (alto teor de glicose) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) contendo soro de bezerro recém-nascido a 10% (NBCS), 1.500 mg/L de hidrogenocarbonato de sódio e 100 U/mL de penicilina/100 µg/mL de estreptomicina (Thermo Fisher Scientific Inc.); e um vetor PB-CMV-MCS-EF1-RFP+Puro no qual um gene EGFR humano (G719A+T790M) foi codificado foi introduzido nas células, juntamente com um vetor de expressão Super PiggyBac Transposase, por eletroporação usando um Kit do Nucleofector de Linha Celular R da Amaxa (marca comercial), seguido de seleção usando puromicina (SIGMA). As células NIH-3T3 que expressam EGFR mutante do éxon 18 (que podem ser doravante denominadas “NIH3T3-EGFR G719A+T790M”) exibiram crescimento na ausência de EGF sob condições de NBCS a 1%.

[00124] Na avaliação usando modelos de camundongo transplantados subcutaneamente com a linha de células que expressam EGFR mutante G719A+T790M, camundongos nus foram transplantados subcutaneamente com células NIH3T3-EGFR G719A+T790M nas quais o EGFR humano mutante foi introduzido. No ponto em que o volume do tumor enxertado nos camundongos cresceu para cerca de 100 a 300 mm3, os camundongos foram alocados em grupos, 5 camundongos para cada grupo, por randomização estratificada, de modo que o volume médio do tumor entre os grupos fosse uniforme. Os camundongos foram então administrados por via oral com o composto A da presente invenção ou o afatinibe uma vez por dia em dias consecutivos.

[00125] A dose de afatinibe foi de 20 mg/kg/dia, que é a dose máxima tolerada (a dose máxima na qual a perda de peso durante um período de dosagem é menor que 20%), por 14 dias, o período de dosagem deste teste. Para o composto A da presente invenção, foram estabelecidos três tipos de doses: 200 mg/kg/dia (dose máxima tolerada), 100 mg/kg/dia e 50 mg/kg/dia. A dose máxima tolerada foi determinada de acordo com as “Diretrizes que envolvem Propostas Experimentais de Neoplasia em Camundongos e Ratos” do Instituto Nacional do Câncer (INC), de uma perspectiva humanitária.

[00126] Para comparar as alterações no crescimento do tumor ao longo do tempo devido à administração dos compostos de teste individuais, o volume do tumor (que pode ser daqui em diante referido como “VT”) foi usado como um índice. A Figura 3 ilustra as mudanças no VT ao longo do tempo. Para um índice de toxicidade, o peso corporal foi medido ao longo do tempo, e a alteração do peso corporal (a seguir denominada “BWC (%)”), a partir do dia em que os camundongos foram divididos em grupos, foi calculada de acordo com a seguinte fórmula. A Fig. 4 ilustra mudanças no peso corporal ao longo do tempo. BWC (%) = (o peso corporal medido no dia da medição do peso corporal)/(o peso corporal no dia em que os camundongos foram divididos em grupos)

[00127] O teste de Dunnett foi realizado usando o VT médio no dia final da avaliação como um índice. Quando a diferença no VT médio entre o grupo de controle e o grupo administrado com um composto de teste foi estatisticamente significante (p<0,05), e o valor do tratamento/controle

(T/C) calculado usando a fórmula a seguir foi menor que 100, o composto de teste foi determinado como sendo eficaz. Tal caso é indicado pelo símbolo “*” na Fig. 3 e na Tabela 4 (*: p<0,05, **:p<0,01, ***: p<0,001). Adicionalmente, quando a diferença no VT médio entre o grupo administrado com o composto A da presente invenção e o grupo administrado com afatinibe foi estatisticamente significativa (p<0,05), e o valor T/C do grupo administrado com o composto A do presente invenção foi menor que o valor T/C do grupo administrado com afatinibe, determinou-se que o composto A tinha um efeito antitumoral maior que o afatinibe. Tal caso é indicado pelo símbolo “#” na Fig. 3 e na Tabela 4 (#: p<0,05, ##: p<0,01, ###: p<0,001). T/C (%) = (o VT médio do grupo administrado com um composto de teste)/(o VT médio do grupo de controle) × 100

[00128] Como é evidente a partir dos resultados ilustrados na Fig. 3, o composto A da presente invenção exibiu um efeito antitumoral significativo na linha celular que expressa EGFR mutante G719A+T790M transplantada subcutaneamente em camundongos nus. Adicionalmente, como mostrado na Tabela 4, o efeito foi maior que o do afatinibe, sem sintomas, tais como, perda de peso grave (como ilustrado na Fig. 4), fezes anormais ou pele anormal em camundongos. Tabela 4 Composto Dose T/C (%) valor p vs (mg/kg) Controle Afatinibe Controle - 100,0 - - Composto A 50 47,7 *** N.S. da Presente Invenção Composto A 100 36,4 *** ##

da Presente Invenção Composto A 200 28,0 *** ### da Presente Invenção Afatinibe 20 57,4 *** -

N.S.: Nenhuma diferença significativa ***: p<0,001 (teste de Dunnett x Grupo de Controle) ##: p<0,01 (teste de Dunnett vs Grupo de Afatinibe) ###: p<0,001 (teste de Dunnett vs Grupo de Afatinibe)

Claims (32)

REIVINDICAÇÕES

1. Agente antitumoral, caracterizado pelo fato de ser para tratamento de um paciente com tumor maligno que expressa EGFR tendo pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste na mutação G719X no éxon 18, mutação E709X no éxon 18 e mutação L861X no éxon 21, em que X representa um resíduo de aminoácido arbitrário, o agente antitumoral compreendendo (S)-N-(4-amino-6-metil-5-(quinolin-3-il)-8,9-di- hidropirimido[5,4-b]indolizin-8-il)acrilamida ou um sal do mesmo.

2. Agente antitumoral, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mutação no éxon 18 é pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste em G719A, G719S, G719C, E709K e E709A.

3. Agente antitumoral, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a mutação no éxon 21 é L861Q.

4. Agente antitumoral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o EGFR tem adicionalmente uma mutação T790M.

5. Método para tratar um paciente com tumor maligno, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de administração de (S)-N-(4-amino-6-metil-5-(quinolin-3-il)- 8,9-di-hidropirimido[5,4-b]indolizin-8-il)acrilamida ou um sal do mesmo a um paciente com tumor maligno que expressa EGFR tendo pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste na mutação G719X no éxon 18, mutação E709X no éxon 18 e mutação L861X no éxon 21, em que X representa um resíduo de aminoácido arbitrário.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a mutação no éxon 18 é pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste em G719A, G719S, G719C, E709K e E709A.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a mutação no éxon 21 é L861Q.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de que o EGFR tem adicionalmente uma mutação T790M.

9. (S)-N-(4-amino-6-metil-5-(quinolin-3-il)-8,9-di- hidropirimido[5,4-b]indolizin-8-il)acrilamida ou um sal do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para tratamento um paciente com tumor maligno que expressa EGFR tendo pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste na mutação G719X no éxon 18, mutação E709X no éxon 18 e mutação L861X no éxon 21, em que X representa um resíduo de aminoácido arbitrário.

10. (S)-N-(4-amino-6-metil-5-(quinolin-3-il)-8,9-di- hidropirimido[5,4-b]indolizin-8-il)acrilamida ou um sal do mesmo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a mutação no éxon 18 é pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste em G719A, G719S, G719C, E709K e E709A.

11. (S)-N-(4-amino-6-metil-5-(quinolin-3-il)-8,9-di- hidropirimido[5,4-b]indolizin-8-il)acrilamida ou um sal do mesmo, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que a mutação no éxon 21 é L861Q.

12. (S)-N-(4-amino-6-metil-5-(quinolin-3-il)-8,9-di- hidropirimido[5,4-b]indolizin-8-il)acrilamida ou um sal do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que o EGFR tem adicionalmente uma mutação T790M.

13. Uso de (S)-N-(4-amino-6-metil-5-(quinolin-3-il)- 8,9-di-hidropirimido[5,4-b]indolizin-8-il)acrilamida ou de um sal do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para tratar um paciente com tumor maligno que expressa EGFR tendo pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste na mutação G719X no éxon 18, mutação E709X no éxon 18 e mutação L861X no éxon 21, em que X representa um resíduo de aminoácido arbitrário.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a mutação no éxon 18 é pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste em G719A, G719S, G719C, E709K e E709A.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a mutação no éxon 21 é L861Q.

16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que o EGFR tem adicionalmente a mutação T790M.

17. Uso de (S)-N-(4-amino-6-metil-5-(quinolin-3-il)- 8,9-di-hidropirimido[5,4-b]indolizin-8-il)acrilamida ou um sal do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para a produção de um agente farmacêutico para o tratamento de um paciente com tumor maligno que expressa EGFR tendo pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste na mutação G719X no éxon 18, mutação E709X no éxon 18 e mutação L861X no éxon 21, em que X representa um resíduo de aminoácido arbitrário.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a mutação no éxon 18 é pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste em G719A, G719S, G719C, E709K e E709A.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que a mutação do éxon 21 é L861Q.

20. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que o EGFR tem adicionalmente a mutação T790M.

21. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende (S)-N-(4-amino-6-metil-5-(quinolin-3-il)- 8,9-di-hidropirimido[5,4-b]indolizin-8-il)acrilamida ou um sal do mesmo e um carreador farmaceuticamente aceitável, para o tratamento de um paciente com tumor maligno que expressa EGFR tendo pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste na mutação G719X no éxon 18, mutação E709X no éxon 18 e mutação L861X no éxon 21, em que X representa um resíduo de aminoácido arbitrário.

22. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a mutação no éxon 18 é pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste em G719A, G719S, G719C, E709K e E709A.

23. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizada pelo fato de que a mutação no éxon 21 é L861Q.

24. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizada pelo fato de que o EGFR tem adicionalmente uma mutação T790M.

25. Método para prever efeitos terapêuticos da quimioterapia usando um agente antitumoral compreendendo, como ingrediente ativo, (S)-N-(4-amino-6-metil-5-(quinolin- 3-il)-8,9-di-hidropirimido[5,4-b]indolizin-8-il)acrilamida ou um sal do mesmo em um paciente com tumor maligno, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas (1) e

(2) abaixo: (1) uma etapa de detecção da presença ou ausência de mutação do gene EGFR contida em uma amostra biológica obtida do paciente; e (2) uma etapa de prever que a quimioterapia tem alta probabilidade de exibir efeitos terapêuticos suficientes em relação ao paciente quando nos resultados da detecção na etapa (1) verificou-se que o gene EGFR tem pelo menos uma mutação selecionada no grupo que consiste em mutação G719X no éxon 18, mutação E709X no éxon 18 e mutação L861X no éxon 21, em que X representa um resíduo de aminoácido arbitrário.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a mutação no éxon 18 é pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste em G719A, G719S, G719C, E709K e E709A.

27. Método, de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que a mutação no éxon 21 é L861Q.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, caracterizado pelo fato de que o EGFR tem adicionalmente uma mutação T790M.

29. Método para tratar um paciente com tumor maligno, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas (1) a (3) abaixo: (1) uma etapa de detecção da presença ou ausência de mutação do gene EGFR contida em uma amostra biológica obtida do paciente; (2) uma etapa de prever que a quimioterapia usando um agente antitumoral compreendendo, como ingrediente ativo, (S)-N-(4-amino-6-metil-5-(quinolin-3-il)-8,9-di- hidropirimido[5,4-b]indolizin-8-il)acrilamida ou um sal do mesmo é altamente provável que apresente efeitos terapêuticos suficientes em relação ao paciente quando nos resultados da detecção na etapa (1) verificou-se que o gene EGFR tem pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste na mutação G719X no éxon 18, mutação E709X no éxon 18 e mutação L861X no éxon 21, em que X representa um resíduo de aminoácido arbitrário; e (3) uma etapa de administração de (S)-N-(4-amino-6- metil-5-(quinolin-3-il)-8,9-di-hidropirimido[5,4- b]indolizin-8-il)acrilamida ou um sal do mesmo a um paciente com tumor maligno que era altamente provável que respondesse suficientemente à quimioterapia usando um agente antitumoral compreendendo, como um ingrediente ativo, (S)-N-(4-amino-6- metil-5-(quinolin-3-il)-8,9-di-hidropirimido[5,4- b]indolizin-8-il)acrilamida ou um sal do mesmo, na etapa (2).

30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a mutação no éxon 18 é pelo menos uma mutação selecionada do grupo que consiste em G719A, G719S, G719C, E709K e E709A.

31. Método, de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizado pelo fato de que a mutação no éxon 21 é L861Q.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, caracterizado pelo fato de que o EGFR tem adicionalmente uma mutação T790M.