CN1114616C - 一种诱导植物过敏性反应的激发子、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明水稻黄单胞菌诱导植物过敏性反应和抗病性的激发子、制备方法及其应用，属于生物技术领域。利用超声波破碎细胞，从水稻黄单胞菌菌体中提取到一种能够诱导植物过敏性反应和抗病性的蛋白类激发子，并通过等电聚焦及柱层析技术对其进行纯化。该激发子可用于多种植物病害的生物防治，对害虫有驱避作用，并具有促进植物生长和增加作物产量的作用。浸种、蘸根或喷雾使用。使用浓度为10-100μg/mL，使用1-4次。防治效果60%以上，增产效果为10%以上。
Description
本发明一种诱导植物过敏性反应的激发子及其用法，属于生物技术研究领域。专用于从水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)中制备一种蛋白类激发子，用于防治植物病虫害，并提高作物产量。
激发子(elicitor)是能诱导植物产生防卫反应的一类物质，这类物质有蛋白、寡聚糖、糖蛋白等类型。激发子有生物来源和非生物来源两种类型，其中生物来源包括植物病原真菌(如Phytophthora infestants、Phytophthora sojae)、植物病原细菌和植物细胞壁等。
植物病原细菌是一种重要的激发子生物来源。植物病原细菌在非寄主植物上引起的过敏性反应是植物的一种防卫反应，具体表现为接种区植物细胞的快速死亡，形成局部枯斑，从而阻止病原菌进一步扩展并杀死病原菌。已经报道：梨火疫病菌(Erwinia amylovora)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)和棒形杆菌(Clavibacter michiganeasis)能产生蛋白类激发子。由hrp基因编码的harpin也属于蛋白类激发子。但到目前为止，未有文献和专利报道从水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)中分离出激发子。
本发明的目的是提供一种能诱导植物过敏性反应的激发子及其用法，提取一种能够激发烟草过敏性反应的活性物质，并对其进行纯化，用于防治植物病虫害，并能提高作物产量。
本发明所提供的植物过敏性反应激发子，其特征在于，激发子来源于水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)，属蛋白类，分子量为10kD～100kD，等电点为4.0～7.0，甘氨酸含量为15～30％(摩尔百分比)，谷氨酸含量为10～25％(摩尔百分比)，激发烟草过敏性反应的浓度为3～10μg/ml，其制备方法包括：
1.激发子的提取：
菌体在NB培养基中液体培养，离心收集菌体，滤液经冻干浓缩20～50倍；沉淀菌体重悬于原培养液1/5～1/20体积的磷酸缓冲液(pH6.5)，加蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟，浓度为0.5～2mM；菌悬液经超声波破碎，离心去除菌残体，上清沸水浴5～20分钟，然后再经30,000～200,000g超速离心30～120分钟，上清经20～80％饱和度硫酸铵沉淀，沉淀经透析后得到激发子粗提蛋白；
2.激发子的纯化：
激发子粗提蛋白通过制备式等电点聚焦初步纯化，再通过强阴离子交换层析，平衡液为5mM磷酸缓冲液(pH6.5)，0～2M NaCl梯度洗脱，收集活性蛋白，透析后冻干浓缩制成纯品。某些激发子需通过分子筛进一步纯化，平衡液和淋洗液均为5mM磷酸缓冲液(pH6.5，含0.15M NaCl)，收集活性蛋白，透析后冻干浓缩制成纯品。
上述诱导植物过敏性反应激发子的使用方法为，将浓度为10～100μg/ml的激发子浸种、蘸根或喷雾使用1～4次，用于防治小麦纹枯病、白粉病、赤霉病、蚜虫、棉苗立枯病、炭疽病、植物细菌性青枯病、水稻细菌病害、蔬菜病毒病、辣椒和草莓灰霉病、烟草病毒病、油菜菌核病等，对上述植物能促进生长和增加产量。
本发明所提供的植物过敏性反应激发子来源于水稻黄单胞菌，属蛋白类，分子量为10kD～100kD，等电点为4.0～7.0，甘氨酸含量为15～30％(摩尔百分比)，谷氨酸含量为1 0～25％(摩尔百分比)。该激发子与E.amylovora的HarpinEa在生理生化特性方面有许多相似之处，在烟草上引起典型的过敏性反应；热稳定且对蛋白酶敏感。本发明所提供的水稻黄单胞菌来源的激发子比Erwinia amylovora、Pseudomonas syringae来源的Harpin类蛋白激发子具有更强的生物活性，引起烟草过敏性反应的浓度更低，它们引起烟草过敏性反应的浓度分别为3～10μg/ml、40～60μg/ml和100～200μg/ml。
本发明的激发子可用于植物病虫害的生物防治，防治对象包括：小麦纹枯病、白粉病、赤霉病、蚜虫、棉苗立枯病、炭疽病、植物细菌性青枯病，水稻细菌病害，蔬菜病毒病，草莓灰霉病，烟草病毒病，细菌菌核病等，防治效果为60～95％。还可用于提高作物产量，增产效果为10～100％。使用浓度为10～100μg/ml，浸种、蘸根或喷雾使用。使用1～4次。
实施例1：
从水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)JXOIII菌株(公知公用，见文献：何晨阳，饶军华，王金生.1994.南京农业大学学报(增)，17：13-16)中制备的激发子属蛋白类，分子量为13kD，等电点为4.5，甘氨酸含量为22％(摩尔百分比)，谷氨酸含量为16％(摩尔百分比)，缺乏半胱氨酸与色氨酸。该激发子与E.amylovora的HarpinEa在生理生化特性方面有许多相似之处，在烟草上引起典型的过敏性反应；均富含甘氨酸、热稳定且对蛋白酶敏感。与E.amylovora提取的HarpinEa不同的是，HarpinEa分子量为44kD，等电点为4.2。该激发子比Erwinia amylovora、Pseudomonas syringae来源的Harpin类蛋白激发子具有更强的生物活性，引起烟草过敏性反应的浓度更低，它们引起烟草过敏性反应的浓度分别为10μg/ml、40～60μg/ml和100～200μg/ml。
从水稻白叶枯病菌JXOIII菌株中制备激发子，制法包括：
1.激发子的提取：
JXOIII在NB培养基中液体培养，离心收集菌体，滤液经冻干浓缩30倍；沉淀菌体重悬于原培养液1/10体积的磷酸缓冲液(pH6.5)，加蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟，浓度为1mM；菌悬液经超声波破碎(40％输出功率，20分钟)，离心去除菌残体，上清沸水浴15分钟，然后再经80,000g超速离心60分钟，上清经30％饱和度硫酸铵沉淀，沉淀经透析后得到激发子粗提蛋白。
2.激发子的纯化
激发子粗提蛋白通过制备式等电聚焦(RotoforTM，Bio-Rad)初步纯化，阳极缓冲液为0.1mol/LH3PO4，阴极缓冲液为0.1mol/LNaOH。样品中加两性电解质Ampholine(pH3.5～10)，浓度为2％，电泳时间为4.5小时。聚焦后收集活性蛋白组份，再通过Q-Sepharose F.F.(XK26/7)离子交换层析(FPLC System，Pharmacia)，平衡液为5mM磷酸缓冲液(pH6.5)，0～2M NaCl梯度洗脱，洗脱浓度为0.66M的收集液透析后浓缩得到纯化蛋白。
该提纯的激发子在多种作物上具有防病增产作用(表一)。
实施例2：
从水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)RS-105(公知公用，见文献：姬广海等，1999。水稻上三种条斑病细菌DNA的多态性初析。植物病理学报29(2)：120-125)中制备的激发子属蛋白类，分子量为65kD，等电点为6.5，富含甘氨酸和谷氨酸，甘氨酸含量为25％(摩尔百分比)，谷氨酸含量为17％(摩尔百分比)。该激发子与E.amylovora的HarpinEa在生理生化特性方面有许多相似之处，在烟草上引起典型的过敏性反应；热稳定且对蛋白酶敏感。与E.amylovora提取的HarpinEa不同的是，HarpinEa分子量为44kD，等电点为4.2。该激发子比Erwinia amylovora、Pseudomonas syringae来源的Harpin类蛋白激发子具有更强的生物活性，引起烟草过敏性反应的浓度更低，它们引起烟草过敏性反应的浓度分别为3μg/ml、40～60μg/ml和100～200μg/ml。
从水稻细条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)菌株RS-105中制备激发子，制法包括：
1.激发子的提取：
RS-105在NB培养基培养，离心收集菌体，滤液经冻干浓缩50倍；沉淀菌体重悬于原培养液1/8体积的磷酸缓冲液(pH6.5)，加蛋白酶抑制剂苯甲磺酰氟，浓度为1mM；菌悬液超声波破碎(40％输出功率，20分钟)，离心去除菌残体，上清沸水浴10分钟，然后再经100,000g超速离心45分钟，上清经60％饱和度硫酸铵沉淀，沉淀经透析后得到激发子粗提蛋白。
2.激发子的纯化
激发子粗提蛋白通过制备式等电聚焦(RotoforTM，Bio-Rad)初步纯化，阳极缓冲液为0.1mol/LH3PO4，阴极缓冲液为0.1mol/LNaOH。样品中加两性电解质Ampholine(pH3.5～10)，浓度为2％，电泳时间为5小时。聚焦后收集活性蛋白组份，再通过Q-Sepharose F.F.(XK26/7)离子交换层析(FPLC System，Pharmacia)，平衡液为5mM磷酸缓冲液(pH6.5)，0～2M NaCl梯度洗脱，收集活性组份，通过Sephadex G75(XK16/65)分子筛(FPLC System，Pharmacia)，平衡液和淋洗液均为5mM磷酸缓冲液(pH6.5，含0.15M NaCl)，收集活性蛋白，透析后冻干浓缩制成纯品。
该提纯的激发子在多种作物上具有防病增产作用(表二)。
表一水稻白叶枯病菌JXOIII蛋白类激发子对作物病虫防治作用及增产作用
作物 使用方法 防治对象 防治效果 增产效果
水稻 蘸根及后期喷雾2次，使用浓度为30μg/ml 白叶枯病 60％ 11％
浸种和后期喷雾2次，使用浓度为40μg/ml 纹枯病 67％ 15％
喷雾3次，使用浓度为30μg/ml 白粉病 85％ 18％小麦
喷雾3次，使用浓度为30μg/ml 赤霉病 87％ 18％
喷雾3次，使用浓度为30μg/ml 粘虫 85％ 18％
喷雾1次，使用浓度为100μg/ml 炭疽病 71％ 11％棉花
喷雾1次，使用浓度为100μg/ml 立枯病 70％ 12％
喷雾3次，使用浓度为60μg/ml 病毒病 89％ 42％
喷雾3次，使用浓度为60μg/ml 晚疫病 82％ 42％番茄
喷雾3次，使用浓度为60μg/ml 叶霉病 66％ 42％
蘸根及后期喷雾2次，使用浓度为60μg/ml 青枯病 72％ 35％辣椒 喷雾4次，使用浓度为30μg/ml 病毒病 90％ 100％烟草 喷雾3次，使用浓度为60μg/ml 病毒病 67％ 11％草莓 喷雾3次，使用浓度为30μg/ml 灰霉病 65％ 20％油菜 喷雾3次，使用浓度为30g/ml 菌核病 67％ 15％
表二水稻细菌性条斑病菌RS-05蛋白类激发子对作物病虫防治作用及增产作用作物 使用方法 防治对象 防治效果 增产效果水稻 蘸根及后期喷雾2次，使用浓度为25μg/ml 白叶枯病 65％ 15％
浸种和后期喷雾2次，使用浓度为25μg/ml 纹枯病 68％ 18％
喷雾3次，使用浓度为20μg/ml 白粉病88％ 20％小麦
喷雾3次，使用浓度为20μg/ml 赤霉病 84％ 23％
喷雾3次，使用浓度为20μg/ml 粘虫 87％ 21％
喷雾1次，使用浓度为80μg/ml 炭疽病 75％ 15％棉花
喷雾1次，使用浓度为80μg/ml 立枯病 76％ 13％
喷雾3次，使用浓度为60μg/ml 病毒病 92％ 40％
喷雾3次，使用浓度为60μg/ml 晚疫病 85％ 40％番茄
喷雾3次，使用浓度为60μg/ml 叶霉病 70％ 40％
蘸根及后期喷雾2次，使用浓度为60μg/ml 青枯病 75％ 40％辣椒 喷雾4次，使用浓度为30μg/ml 病毒病 95％ 100％烟草 喷雾3次，使用浓度为60μg/ml 病毒病 71％ 12％草莓 喷雾3次，使用浓度为30μg/ml 灰霉病 70％ 25％油菜 喷雾3次，使用浓度为30μg/ml 菌核病 72％ 16％
Claims (2)
1.一种诱导植物过敏性反应的激发子，其特征在于：激发子来源于水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)，属蛋白类，分子量为10kD～100kD，等电点为4.0～7.0，甘氨酸含量为15～30％(摩尔百分比)，谷氨酸含量为10～25％(摩尔百分比)激发烟草过敏性反应的浓度为3～10μg/ml，其制备方法包括：
1.1)激发子的提取：
菌体在NB培养基中液体培养，离心收集菌体，滤液经冻干浓缩20～50倍；沉淀菌体重悬于原培养液1/5～1/20体积的磷酸缓冲液(pH6.5)，加蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟，浓度为0.5～2mM；菌悬液经超声波破碎，离心去除菌残体，上清沸水浴5～20分钟，然后再经30,000～200,000g超速离心30～120分钟，上清经20～80％饱和度硫酸铵沉淀，沉淀经透析后得到激发子粗提蛋白；
1.2)激发子的纯化：
激发子粗提蛋白通过制备式等电点聚焦初步纯化，再通过强阴离子交换层析，平衡液为5mM磷酸缓冲液(pH6.5)，0～2M NaCl梯度洗脱，在0.66M NaCl收集活性组份，再通过Sephadex G75分子筛纯化，透析后冻干浓缩制成纯品。
2.权利要求1所述诱导植物过敏性反应激发子的使用方法为，将浓度为10～100μg/ml的激发子浸种、蘸根或喷雾使用1～4次，用于防治小麦纹枯病、白粉病、赤霉病、蚜虫，棉苗立枯病、炭疽病、植物细菌性青枯病、水稻细菌病害、蔬菜病毒病、辣椒和草莓灰霉病、烟草病毒病、油菜菌核病。
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