CN111448992A - 一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的培养基及方法 - Google Patents

一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的培养基及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111448992A
CN111448992A CN202010525159.0A CN202010525159A CN111448992A CN 111448992 A CN111448992 A CN 111448992A CN 202010525159 A CN202010525159 A CN 202010525159A CN 111448992 A CN111448992 A CN 111448992A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seeds
culture medium
brachypodium distachyon
culture
fpx
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010525159.0A
Other languages
English (en)
Inventor
王凯
余光润
王建勇
苗丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujian Agriculture and Forestry University
Original Assignee
Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fujian Agriculture and Forestry University filed Critical Fujian Agriculture and Forestry University
Publication of CN111448992A publication Critical patent/CN111448992A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的培养基及方法，本发明培养基是在MS基本培养基中添加Fipexide(FPX)和CuSO4，本发明利用外科手术刀对二穗短柄草种子进行切割处理，打破种子的休眠，并在FPX的协同作用得到二穗短柄草种子快速愈伤组织，诱导率高达98.3％，本发明可直接用于二穗短柄草种子愈伤组织诱导，缩短植物组织培养的时间，也为加速植物转基因育种奠定基础。

Description

一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的培养基及方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的培养基及方法。
背景技术
通过植物组织培养技术研究植物基因功能的有效途径。目前该技术在植物再生工作中得到广泛的应用，但对于如何缩短植物再生的时间研究还不深入，尤其是如何快速诱导良好的愈伤组织形成。
二穗短柄草作为世界上分布最广泛的C3植物，因其基因组小、生长周期短、体量小、适合遗传转化、实验室和田间操作等优势而被定义为新的模式植物。同时二穗短柄草和小麦同属早熟禾亚科，而该亚科植物种子具有明显的休眠现象，种子需要经历一定时间的休眠期以完成生理后熟过程。
二穗短柄草种子属于胚依赖型生理性休眠，快速诱导愈伤组织的关键是打破其胚依赖性。这一过程需要外界的物理刺激，并需要化学诱导剂的协同作用，促进愈伤组织形成。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的培养基及方法，能够快速打破二穗短柄草种子休眠的特性，缩短愈伤组织诱导时间，并用于植物再生和遗传转化研究。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的培养基，包括MS基本培养基、FPX、CuSO4。
所述FPX的浓度为45-100μM。
所述CuSO4的浓度为0.6mg/L。
所述45-100uM FPX的配制方法为：388.84mg溶于5mLDMSO溶液，搅拌溶解后，用蒸馏水补至10mL，得到100mMFPX母液，取450ul-1ml的100mM FPX母液加到1L培养基中得到45-100uM的FPX。
所述0.6mg/mL CuSO4的配制方法为：将50mg CuSO4·5H2O溶解到50mL的蒸馏水中，得到1mg/mL CuSO4，4℃黑暗保存，取600ul 1mg/mL CuSO4到1L的培养基中配制成终浓度为0.6mg/L的CuSO4。
6.25％次氯酸钠溶液的配制方法：吸取12.5mL次氯酸钠溶于180mL蒸馏水中，用蒸馏水补至200ml。
1M KOH的配制方法：5.6g KOH固体溶于100mL去离子水中，得到1M KOH溶液。
所述培养基的配制方法：4.43g MS粉末和30g蔗糖溶于1L去离子水，添加3gPhytagel，搅拌均匀，用1M KOH调整pH为5.8；121℃高压灭菌15min；灭菌完成后，取出培养基，待培养基冷却后，添加45-100uM FPX，摇匀后，无菌条件下分装培养基至培养皿中，每个培养皿25ml培养基，培养基凝固后，封口膜包裹培养皿，4℃黑暗保存。
一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的方法，包括如下步骤：
(1)超净工作台中，用镊子去除二穗短柄草种子上的外稃，置于50mL离心管中，用20mL 75％乙醇将种子表面灭菌30s，无菌去离子水冲洗三次，再加入20mL的6.25％次氯酸钠溶液，上下颠倒混匀，消毒15分钟，用无菌去离子水冲洗3-6次，得到灭菌后的种子；
(2)将灭菌后的种子用外科手术刀切割，切除部分胚乳，保留切割后含胚的部分，将切割后的种子置于无菌滤纸上吸去表面水分；
(3)将吸干表面水分的种子放置到培养基上，胚朝上，培养皿置于黑暗条件下培养，培养三天后即出现愈伤组织。
步骤(3)中，所述培养条件为温度26-30℃，湿度50％-70％。
本发明具有有益效果：本发明利用外科手术刀切割二穗短柄草种子，打破谷类作物种子休眠，并通过Fipexide新型化学诱导剂，快速诱导谷类作物种子愈伤组织的形成，至少提前7天诱导二穗短柄草种子形成愈伤组织；本发明为打破种子休眠促进愈伤组织形成的研究积累了宝贵材料，有利于种子休眠机制和二穗短柄草转基因育种工作的研究。
附图说明
图1为二穗短柄草种子的切割示意图；其中a为切割处理操作图，b为切割后示意图；
图2为切割种子和未切割种子的愈伤组织诱导结果图；其中对照组采用未切割种子、MS培养基；处理组采用切割后的种子、MS基本培养基+FPX+CuSO4。
具体实施方式
本发明所用试剂耗材：
75％酒精(国药集团化学试剂有限公司，货号8017696)
次氯酸钠(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号A501944)
滤纸(杭州特种纸业有限公司，中速9cm)
外科手术刀片(上海医疗器械有限公司手术器械厂，货号J0B080)
MS培养基(Phyto Technology，货号M519)
Fipexide(MEC,货号HY-B1124)
CuSO4·5H2O(国药集团化学试剂有限公司，货号10008216)
植物凝胶Phytagel(Sigma,P8169)
蔗糖(北京索莱宝科技有限公司，货号S8270)
氢氧化钾KOH(国药集团化学试剂有限公司，货号10017008)
盐酸HCl(国药集团化学试剂有限公司，货号10011018)
pH酸度测定仪(安莱立思仪器科技(上海)有限公司，货号pH400)
BIOFIL培养皿(广州洁特生物过滤股份有限公司，货号TCD000090)
下面将结合本发明中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1：
一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的培养基，包括MS基本培养基+100uMFPX+0.6mg/L CuSO4。Fipexide(FPX)是一种新型的化学诱导剂。
所述100uM FPX的配制方法为：388.84mg溶于5mL DMSO溶液，搅拌溶解后，用蒸馏水补至10mL，得到100mM FPX母液，取1ml的100mM FPX母液加到1L培养基中得到45-100uM的FPX。
所述0.6mg/mL CuSO4的配制方法为：将50mg CuSO4·5H2O溶解到50mL的蒸馏水中，得到1mg/mL CuSO4，4℃黑暗保存，取600ul 1mg/mL CuSO4到1L的培养基中配制成终浓度为0.6mg/L的CuSO4。
6.25％次氯酸钠溶液的配制方法：吸取12.5mL次氯酸钠溶于180mL蒸馏水中，用蒸馏水补至200ml。
1M KOH的配制方法：5.6g KOH固体溶于100mL去离子水中，得到1M KOH溶液。
所述培养基的配制方法：4.43g MS粉末和30g蔗糖溶于1L去离子水，添加3gPhytagel，搅拌均匀，用1M KOH调整pH为5.8；121℃高压灭菌15min；灭菌完成后，取出培养基，待培养基冷却后，添加45-100uM FPX，摇匀后，无菌条件下分装培养基至培养皿中，每个培养皿25ml培养基，培养基凝固后，封口膜包裹培养皿，4℃黑暗保存。
一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的方法，包括如下步骤：
(1)超净工作台中，用镊子去除二穗短柄草种子上的外稃，置于50mL离心管中，用20mL 75％乙醇将种子表面灭菌30s，无菌去离子水冲洗三次，再加入20mL的6.25％次氯酸钠溶液，上下颠倒混匀，消毒15分钟，用无菌去离子水冲洗3-6次，得到灭菌后的种子；
(2)如图1所示，将灭菌后的种子用外科手术刀切割，切除部分胚乳，保留切割后含胚的部分，将切割后的种子置于无菌滤纸上吸去表面水分；
(3)将吸干表面水分的种子放置到培养基上，胚朝上，培养皿置于黑暗条件下培养，培养三天后即出现愈伤组织。
步骤(3)中，所述培养条件为温度26-30℃，湿度50％-70％。
从图2中可以看到，本发明切割过的短柄草种子在转到愈伤诱导培养基三天后就开始出现小的愈伤组织，而对照组中未切割的种子要到15天时才会出现少量的愈伤组织，表明本发明可以促进短柄草愈伤组织的形成。
由于短柄草属于早熟禾亚科，与小麦近缘，其种子具有明显的休眠特性，不仅会影响作物的产量和品质，也会影响种子作为外植体的生理状态，进而影响愈伤组织的诱导。本发明利用外科手术刀对短柄草种子进行切割处理，在含有FPX的愈伤组织诱导培养基上可显著促进愈伤组织形成，证明了该方法是有效的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (8)

1.一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的培养基，其特征在于，包括MS基本培养基、FPX、CuSO4。
2.如权利要求1所述的一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的培养基，其特征在于，所述FPX的浓度为45-100uM。
3.如权利要求1所述的一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的培养基，其特征在于，所述CuSO4的浓度为0.6mg/L。
4.如权利要求1所述的一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的培养基，其特征在于，所述45-100uM FPX的配制方法为：388.84mg溶于5mL DMSO溶液，搅拌溶解后，用蒸馏水补至10mL，得到100mM FPX母液，取450ul-1ml的100mM FPX母液加到1L培养基中得到45-100uM的FPX。
5.如权利要求1所述的一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的培养基，其特征在于，所述0.6mg/mL CuSO4的配制方法为：将50mg CuSO4·5H2O溶解到50mL的蒸馏水中，得到1mg/mL CuSO4，4℃黑暗保存，取600ul 1mg/mL CuSO4到1L的培养基中配制成终浓度为0.6mg/L的CuSO4。
6.如权利要求1所述的一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的培养基，其特征在于，所述培养基的配制方法：4.43g MS粉末和30g蔗糖溶于1L去离子水，添加3gPhytagel，搅拌均匀，用1M KOH调整pH为5.8；121℃高压灭菌15min；灭菌完成后，取出培养基，待培养基冷却后，添加45-100uM FPX，摇匀后，无菌条件下分装培养基至培养皿中，每个培养皿25ml培养基，培养基凝固后，封口膜包裹培养皿，4℃黑暗保存。
7.一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)超净工作台中，用镊子去除二穗短柄草种子上的外稃，置于50mL离心管中，用20mL75％乙醇将种子表面灭菌30s，无菌去离子水冲洗三次，再加入20mL的6.25％次氯酸钠溶液，上下颠倒混匀，消毒15分钟，用无菌去离子水冲洗3-6次，得到灭菌后的种子；
(2)将灭菌后的种子用外科手术刀切割，切除部分胚乳，保留切割后含胚的部分，将切割后的种子置于无菌滤纸上吸去表面水分；
(3)将吸干表面水分的种子放置到培养基上，胚朝上，培养皿置于黑暗条件下培养，培养三天后即出现愈伤组织。
8.如权利要求1所述的一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述培养条件为温度26-30℃，湿度50％-70％。
CN202010525159.0A 2019-10-30 2020-06-10 一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的培养基及方法 Pending CN111448992A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911043282 2019-10-30
CN2019110432822 2019-10-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111448992A true CN111448992A (zh) 2020-07-28

Family

ID=71670839

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010525159.0A Pending CN111448992A (zh) 2019-10-30 2020-06-10 一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的培养基及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111448992A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113170732A (zh) * 2021-05-31 2021-07-27 上海应用技术大学 一种通过诱导成熟胚获得萱草愈伤组织的培养基及方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103320377A (zh) * 2012-03-22 2013-09-25 中国科学院植物研究所 一种用于培育转基因植物的培养基
US20160090602A1 (en) * 2014-09-25 2016-03-31 Benson Hill Biosystems, Inc. Methods for plant transformation
US20170105414A1 (en) * 2014-06-06 2017-04-20 Riken Agent for inducing callus and method for inducing callus

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103320377A (zh) * 2012-03-22 2013-09-25 中国科学院植物研究所 一种用于培育转基因植物的培养基
US20170105414A1 (en) * 2014-06-06 2017-04-20 Riken Agent for inducing callus and method for inducing callus
US20160090602A1 (en) * 2014-09-25 2016-03-31 Benson Hill Biosystems, Inc. Methods for plant transformation

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TAKESHI NAKANO等: ""FPX is a Novel Chemical Inducer That Promotes Callus Formation and Shoot Regeneration in Plants"", 《PLANT CELL PHYSIOL》 *
严俊等: ""切割种子对二穗短柄草种子休眠及萌发的影响"", 《种子》 *
胡文祥: ""二穗短柄草成熟胚组织培养体系建立及农杆菌转化研究"", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 基础科学辑》 *
苗丽: ""二穗短柄草遗传转化体系的优化及着丝粒区域基因的编辑"", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 基础科学辑》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113170732A (zh) * 2021-05-31 2021-07-27 上海应用技术大学 一种通过诱导成熟胚获得萱草愈伤组织的培养基及方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106069790B (zh) 一种黑果腺肋花楸开放式组织培养快速育苗方法
CN102283125B (zh) 一种高效的烟草花粉离体液体培养的方法
CN111448992A (zh) 一种快速诱导二穗短柄草种子产生愈伤组织的培养基及方法
CN104663439B (zh) 一种伊乐藻组织培养与快速繁殖方法
CN105493683B (zh) 一种金线莲种子采收后的处理方法
CN107306796B (zh) 一种烟草玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的方法
CN106857252A (zh) 二氧化氯消毒培养基用于马铃薯幼苗快速繁殖或试管薯诱导的方法
CN104012210A (zh) 银杏种子催芽方法
CN106171997B (zh) 一种同时去除植物组织培养时外植体表面和内生菌的方法
CN104920218A (zh) 地皮消的繁殖方法
CN107410019A (zh) 一种采用分级培养基进行甘薯组织培养的方法
CN110106137B (zh) 一种辣木叶肉原生质体及其制备方法
CN104126509B (zh) 明日叶茎段组织培养快繁技术
CN114521489A (zh) 一种秋水仙素变温诱导柳树染色体加倍的方法
CN106718887A (zh) 一种快速脱除马铃薯病毒的方法
CN106665358A (zh) 一种桔梗叶片的快速诱芽及组培繁殖方法
CN109315292A (zh) 一种利用浅层液体培养法快速繁殖甘薯外植体的方法
CN104663456A (zh) 铁皮石斛破损蒴果种子瓶播组培方法
CN108617561A (zh) 一种提高马氏珠母贝植核贝留核率和优质珠率的方法
CN109832193B (zh) 鹅观草成熟胚愈伤组织诱导和再生的培养方法
CN104429944B (zh) 一种批量制备无菌油棕种胚样品的方法
CN109329027B (zh) 一种甘薯的高效繁殖方法
CN104082147A (zh) 细柱五加的离体快速繁殖方法
CN104429963B (zh) 一种马蔺游离花粉培养方法
CN110393154B (zh) 一种鲜食型甘薯脱毒组培苗培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200728

RJ01 Rejection of invention patent application after publication