CN111443058A - 一种近红外光谱快速检测精子浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种近红外光谱快速检测精子浓度的方法，包括以下步骤：试管收集精液样品，室温环境下精液自然液化；吸取已经液化的精液至经去静电和无菌处理的玻片上，而后放置检测装置中；将预热完成的光源与光谱仪通过一分三的光纤连接，其后将光纤角度固定放置检测装置中对玻片进行不同情况照射，设置光谱积分时间，光谱波段，获取精子的光谱数据。本发明利用不同照射情况的下的光谱数据，计算出精子吸光度，从而评估精子浓度情况，本发明可以有效的评估不同男性个体的生育力，明确个体精液质量变化情况，指导健康男性选择最佳的同房时机，提高妊娠可能性。
Description
技术领域
本发明属于精子浓度检测方法领域，具体涉及一种近红外光谱快速检测精子浓度的方法。
背景技术
近年来，不育是男科门诊常见疾病,目前认为不育不仅是个人问题,已逐渐成为全球性的公共社会问题,是许多国家生殖健康服务的重要内容之一。不孕不育夫妇中约20%的不育症完全是由男方原因引起,30%-40%是由男女双方原因引起,男方因素几乎占不育原因的一半。临床上，对于男性生育评估的首选常规检查为精液常规检查，精液常规检查主要是利用计算机辅助评估、分析精液中精子的浓度，活力，及形态等参数。
其中，每次射精时精子的总数和精子浓度均与妊娠的时间及妊娠率有关，可通过其预测受孕。此推论已为生殖率与精子总数之间关系的诸多资料所证明。每次射精时精液体积检测相对容易，因此，每次射精时精子的数量，常通过检测精液精子密度来推算（精子总数=精液体积*精液浓度）。所以简便而准确的测量每次射精时精子浓度对于评估男性生育力及预测妊娠可能性非常重要。
目前测量精子浓度的“金标准”方法为“Neubauer改良的血细胞计数器法”，需将精液与加入固定剂的稀释液混合，再用稀释后的精液充填血细胞计数器的计数池，通过人工计数的方式来计算每个计数池中精子数量，最终推算精液浓度。Neubauer改良的血细胞计数器法操作过程繁杂，实验误差较难控制，且其结果通过人工计数的方式获得，必须由有经验的检验者进行，难以在临床上大范围推广。
近红外光谱作为多种体液检测手段，已广泛用于生物医学及法医鉴定领域。该技术在中等光子能量下主要是非侵入性和非破坏性的，并且在体外和体内起作用在广泛的环境条件下。它提供了有关大分子（如DNA和蛋白质）的构象，组成和分子间相互作用的详细信息。精子细胞作为单配体细胞，其主要由核酸和蛋白质组成，基于核酸和蛋白质对光谱不同波长吸收率不同，可以初步检测精液中是否存在精子细胞，以及通过吸收光谱的峰值推算精液中精子细胞的数量。基于以上理论，本发明开展基于显微近红外的非标记的精液常规检查，对于临床上精子质量的客观评估和预测男性生育力具有十分重要的意义。
发明内容
本发明就是为了克服现有技术中存在的缺点而提出的，其目的是提供一种近红外光谱快速检测精子浓度的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种近红外光谱快速检测精子浓度的方法，包括以下步骤：
S1：使用经过去静电和无菌处理的容器收集精液样本，室温环境下静置，使精液自然液化；
S2：将液化的精液搅拌均匀并抽取精液，滴到去静电处理的特质载玻片口上，精液因虹吸被吸入玻片内，形成均匀的单层精液样本层；
S3：光源通电预热，将光纤接到光谱仪与光源上，光纤另一端接到检测装置的对应接口上，光谱仪连接PC机；
S4：光谱仪的积分区间范围设置在1000ms-5500ms；对于每个精液样本，均分别执行下面S5~S7的步骤；
S5：在一定环境因素的条件下，在样本承载台上放置空载玻片，旋转样本承载台对空载玻片进行特定角度照射，将反射光通过固定于检测装置出光口的光纤接收后，数据图谱将显示在PC机上，重复采集20组数据；
S6：在与S5相同的环境因素条件下，在样本承载台上放置带有样本的玻片，旋转样本承载台对样本精液进行特定角度照射，将反射光通过固定于检测装置出光口的光纤接收后，数据图谱将显示在PC机上，重复采集20组数据；
S7：在与S5相同的环境因素条件下，在样本承载台上放置带有样本的玻片，去掉光源的照射，旋转样本承载台对样本精液进行特定角度照射，将反射光通过固定于检测装置出光口的光纤接收后，数据图谱将显示在PC机上，重复采集20组数据；
S8：将步骤S5~S7采集到的三类数据分别记为IA，IB，IC，导入在PC机上的OceanView分析软件，从数据中减去背景数据获得该样本精液的近红外光谱数据；
S9：采用多组分分析的算法来去除其它杂质的吸光度影响，从而得到样本精液的吸光度图谱；
S10：根据正常的精液样本的吸光度来确定一个吸光度范围；将样本精液的吸光度与此范围的上下限数值做对比，判定其浓度是否在正常范围内。
进一步的，步骤S1中，室温静置10-30分钟。
进一步的，所述检测装置包括壳体，所述壳体包括基部和竖直部，所述基部和竖直部相互连通并形成倒T型结构；在所述竖直部内呈一定角度设置有进光通道、出光通道和观察通道，进光通道和出光通道分别位于观察通道的两侧，观察通道垂直于基部的底面；所述基部的底面向下凹陷形成弧形滑槽，弧形滑槽内嵌有样本承载台。
进一步的，所述样品承载台包括抽拉段和样品放置段，所述抽拉段为圆柱形，样品放置段为半圆柱形。
进一步的，所述样本承载台的样品放置段向下凹陷形成样本放置槽；旋转抽拉段改变样本放置槽与水平面的夹角。
进一步的，所述进光通道、出光通道和观察通道的末端汇聚于弧形滑槽的正上方。
进一步的，所述进光通道、出光通道和观察通道的末端与弧形滑槽的上表面形成一定间隔。
进一步的，所述进光通道、出光通道和观察通道在竖直部的上表面分别形成进光口、出光口和观察口。
进一步的，所述样本承载台的抽拉段设有多个防滑凸棱。
进一步的，在所述样品承载台的抽拉段和样品放置段之间还设有刻度盘；在所述弧形滑槽周围的基部表面上设有刻度线，刻度盘与刻度线的刻度相互对应。
进一步的，所述竖直部为圆弧形。
本发明的有益效果是：
本发明装置的设计及制作完全根据近红外光谱检测精子浓度方法的实际需要而完成。本发明装置固定了光谱发射器发射光源角度，光谱接收器接收光源角度以及方便精液样本载玻片的置入和取出，并通过预实验固定载玻片与光源发射器和接收器的相对位置。本发明装置保证了每次检测时光谱发射器、光谱接收器和精液样本之间的相对位置一定，排除不同操作人员操作的差异导致结果的差异；同时，不透光材质也可排除不同环境下操作环境光源对结果的影响，提高检测结果的可重复性和可靠性。本发明方法进一步推算出近红外光谱检测精子浓度相关计算公式，进而可以区别不同样本之间由精子数量及浓度导致的差异，并通过相关计算公式得到满足临床需要的检测结果，可有效的评估男性个体单次射精精子质量。本发明可快速、简便检测同一个体不同时间的精液质量结果可为男性个体生育力评估提供良好的数据支持。
附图说明
图1是本发明壳体的结构示意图；
图2是本发明的结构示意图；
图3是本发明壳体的剖面图；
图4是本发明中样品承载台的结构示意图；
图5是本发明不同精液样本的吸光度图。
其中：1.壳体； 2.基部；
3.竖直部； 4.滑槽；
5.进光通道； 6.出光通道；
7观察通道； 8.进光口；
9.出光口； 10.观察口；
11.样本承载台； 12.样本放置槽；
13.刻度线； 14.刻度盘。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明技术方案，下面结合说明书附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的近红外光谱快速检测精子浓度的方法的技术方案。
如图1-5所示，本发明的检测方法利用不同物质对近红外光的吸光度不同的原理，将液化好的精液滴至经过去静电与无菌处理的玻片上，在适当的温度保持精子原有的活力，然后利用接到光源与光谱仪的光纤在检测装置中对玻片进行等角度照射，将反射光波长与光强数据图谱在PC机上显示，由于精液中还有其它组分（主要是杂质）对测量数据有影响，将采集数据利用程序算法可以消除其余杂质的影响，得到比较理想精确的光谱图，将数据结果与患者实际信息进行比对，实现比较客观的评价，有效的提高了检测机构的生殖检测效率。
具体的检测方法如下：
（1）精液液化
用去静电和无菌处理后的试管收集精液样本，室温环境下静置10-30分钟，不得超过1个小时，使精液自然液化。
（2）精液样本的制备
利用移液枪将液化的精液搅拌均匀，抽取约1uL的精液，然后滴到去静电处理的特质载玻片口上（同时支持六个不同样本的测量），精液会因虹吸的原理被吸入玻片内，最终会形成均匀的单层精子细胞精液样本层。
（3）光源预热处理以及连接
将光源（Ocean Optics HL-2000-LL）放在实验台上固定，通电预热20分钟左右，将一分三光纤的耦合端接光源，测量端1接NIRQ512型号光谱仪，测量端2接USB2000+型号光谱仪，出光端接到检测装置固定，光谱仪接PC机上，固定光纤位置。
所述检测装置包括壳体1，所述壳体1包括基部2和竖直部3，所述基部2和竖直部3相互连通并形成倒T型结构。所述竖直部3设置为圆弧形。
本发明的外壳1由黑色不透光塑料采用3D打印技术制作而成，不透光材质的使用可避免自然光线干扰检测结果。
本发明在所述竖直部3内呈一定角度设置有进光通道5、出光通道6和观察通道7；进光通道5和出光通道6分别位于观察通道7的两侧，观察通道7垂直于基部2的底面。所述基部2的底面上形成弧形滑槽4，弧形滑槽4内嵌有样本承载台11。
所述进光通道5、出光通道6和观察通道7的末端汇聚于弧形滑槽4的正上方，且与弧形滑槽4的上表面形成一定间隔，方便精液样本载玻片的置入和取出，弧形滑槽4的设置起到固定精液样本载玻片与光源发射器和接收器相对位置的作用。
所述进光通道5、出光通道6和观察通道7在竖直部3的上表面分别形成进光口8、出光口9和观察口10。所述进光口8与光谱发射器相连，出光口9与光谱接收器相连，观察口10与内窥镜相连，从而固定光谱发射器发射光源角度和光谱接收器接收光源角度。
本发明所述样本承载台11形成抽拉段和样品放置段，所述抽拉段为圆柱形，样品放置段为半圆柱形；所述样本承载台11的样品放置段形成用于放置待观测载玻片的内凹的样本放置槽12，旋转抽拉段改变样本放置槽12与水平面的夹角。在所述样品承载台11的抽拉段和样品放置段之间还设有刻度盘14；在所述弧形滑槽4周围的基部2表面上设有刻度线13，刻度盘14与刻度线13的刻度相互对应。所述样本承载台11的抽拉段设有多个防滑凸棱，方便使用。
经过多次实验，本发明将出光通道6与法线之间形成的出射角设置为进光通道5与法线之间形成的入射角的1/2时，可获得良好的精子浓度检测结果。优选的，当入射角选取55°~65°、出射角选取25°~35°时，检测结果更佳。最佳的入射角和出射角确定后，记录刻度盘14与刻度线13之间的相对位置，再次进行测定时，将精液样本载玻片放入样本放置槽12内，再将样本承载台11放入弧形滑槽4内，旋转样本承载台11，找到最佳角度时刻度盘14与刻度线13相对位置进行测定即可。
（4）设置适当积分区间
由于不同角度的反射光谱强度一样，所以需要调节选定合适的时间积分区间以显示光谱图像，打开PC机上的OceanView分析软件，区间设置范围在1000ms-5500ms，根据实际情况选定。
（5）近红外光谱测量
将采集到的实际数据导到分析软件中进行处理将每个患者的测量数据分为三类，每类20组数据，第一类数据采集方法：在环境因素一定的条件下，玻片上不加样品，光源照射，采集20组数据；第二类数据采集方法：同样环境因素下，在玻片上加患者样品，加光源照射，采集20组数据；第三类数据采集方法：同样环境因素下，保留玻片样本，去掉光源照射，采集20组数据。
（6）去噪处理
由于在精液中除了有精子外还存在杂质，杂质对光谱能量也有一定的吸收，对分析具体精子浓度造成误差和干扰，得到的光谱信噪比比较低。因此，将三类数据导入软件进行处理，原理如：将三类数据分别记为IA IB IC，通过算法公式减掉背景光获得精液的整体吸光度。最后，采用多组分分析的算法去掉其他杂质（非精子）的吸光度影响，从而可以得到精子组分的吸光度图谱。
（7）样本精液的精子浓度计算
通过得出的样本精液吸光度图谱，运用吸光度与精液的精子浓度的换算公式，得出样本精液中精子的浓度。
本发明可以方便快速地检测精液中精子的浓度，相比其他现有的检测技术排除了客观因素，可以更加精准的分析得到精子浓度，增加了检测的可信度，针对患者精子浓度有了一个精确的评估。
实施例
采用本发明方法测定6名患者的精子浓度，具体测量方法步骤如下：
（1）精液液化
用经过去静电和无菌处理的容器收集好精液样本，接着在室温环境下静置30分钟左右使精液自然液化。
（2）精液样本的制备
利用10ul移液枪将液化的精液搅拌均匀，抽取约1uL的精液，然后滴到去静电处理的特质载玻片口上（同时支持六个不同样本的测量），精液会因虹吸的原理被吸入玻片内，最终会形成均匀的单层精子细胞精液样本层。
（3）光源预热处理及连接
将光源放在实验台上固定，通电预热20分钟左右，将一分三光纤的耦合端接光源，测量端1接NIRQ512型号光谱仪，测量端2接USB2000+型号光谱仪，出光端接到实验暗箱固定，光谱仪接到PC机上，固定光纤位置。
（4）近红外光谱测量
首先设置适当积分区间，需要调节选定合适的时间积分区间以显示光谱图像，打开PC机上的OceanView分析软件，区间设置范围在1000ms-5500ms（可选），根据实际情况选定。
将每个不同样本的测量数据分为三类，每一类测量20组数据。
第一类数据采集方法：在一定环境因素的条件下，将空载玻片放置到可于暗箱内滑动的托盘上，将托盘置入暗箱内，然后利用接到光源与光谱仪的光纤在实验暗箱中对空载玻片进行特定角度照射，将反射光通过固定于实验暗箱出光端的光纤（与入射光纤共用一根）接收后，数据图谱将显示在PC机上，重复采集20组数据。
第二类数据采集方法：同样环境因素下，接着将带有样本的玻片放置到可于暗箱内滑动的托盘上，将托盘置入暗箱内，然后利用接到光源与光谱仪的光纤，通过旋转样本承载台，改变载玻片与水平面夹角，即改变入射角，从而实现对样本精液进行特定角度照射，将反射光通过固定于实验暗箱出光端的光纤（与入射光纤共用一根）接收后，数据图谱将显示在PC机上，重复采集20组数据。
第三类数据采集方法：相同环境因素下，保留玻片样本并去掉光源的照射，然后旋转样本承载台对样本精液进行特定角度照射，将反射光通过固定于实验暗箱出光端的光纤（与入射光纤共用一根）接收后，数据图谱将显示在PC机上，重复采集20组数据。
（5）数据处理
精液中除了有精子外还存在杂质，杂质对光谱能量也有一定的吸收，对分析具体精子浓度造成误差和干扰。所以，将采集到的三类数据导入软件，进行去噪处理；使用差分法，如公式（1），减掉背景数据获得该样本精液的近红外光谱数据Dy(t)，其中，
为每组样本的最终测量光强，
为空白测量光强。
Dy(t)= 
- 
（1）
最后，采用多组分分析的算法，如公式（2），来去除其它杂质（非精子）的吸光度影响，从而可以得到样本精液的吸光度图谱，其中A为吸光度，T为透光率，I0为入射光强。
A=lgI0/Dy(t)=-lgT （2）
（6）样本精液的精子浓度计算
根据正常的精液样本的吸光度来确定一个吸光度范围；将样本精液的吸光度与此范围的上下限数值做对比，判定其浓度是否在正常范围内。
结果如图5所示，其中，图5的纵坐标表示近红外光的吸光度，横坐标表示入射光的波长，曲线是六名患者的精液样本在入射光波长为1000-1700nm范围内测定的吸光度图谱。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”等的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以通过具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种近红外光谱快速检测精子浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：使用经过去静电和无菌处理的容器收集精液样本，室温环境下静置，使精液自然液化；
S2：将液化的精液搅拌均匀并抽取精液，滴到去静电处理的特质载玻片口上，精液因虹吸被吸入玻片内，形成均匀的单层精液样本层；
S3：光源通电预热，将光纤接到光谱仪与光源上，光纤另一端接到检测装置的对应接口上，光谱仪连接PC机；
S4：光谱仪的积分区间范围设置在1000ms-5500ms；对于每个精液样本，均分别执行下面S5~S7的步骤；
S5：在一定环境因素的条件下，在样本承载台上放置空载玻片，旋转样本承载台对空载玻片进行特定角度照射，将反射光通过固定于检测装置出光口的光纤接收后，数据图谱将显示在PC机上，重复采集20组数据；
S6：在与S5相同的环境因素条件下，在样本承载台上放置带有样本的玻片，旋转样本承载台对样本精液进行特定角度照射，将反射光通过固定于检测装置出光口的光纤接收后，数据图谱将显示在PC机上，重复采集20组数据；
S7：在与S5相同的环境因素条件下，在样本承载台上放置带有样本的玻片，去掉光源的照射，旋转样本承载台对样本精液进行特定角度照射，将反射光通过固定于检测装置出光口的光纤接收后，数据图谱将显示在PC机上，重复采集20组数据；
S8：将步骤S5~S7采集到的三类数据分别记为IA，IB，IC，导入在PC机上的OceanView分析软件，从数据中减去背景数据获得该样本精液的近红外光谱数据；
S9：采用多组分分析的算法来去除其它杂质的吸光度影响，从而得到样本精液的吸光度图谱；
S10：根据正常的精液样本的吸光度来确定一个吸光度范围；将样本精液的吸光度与此范围的上下限数值做对比，判定其浓度是否在正常范围内。
2.根据权利要求1所述的一种近红外光谱快速检测精子浓度的方法，其特征在于，步骤S1中，室温静置10-30分钟。
3.根据权利要求1所述的一种近红外光谱快速检测精子浓度的方法，其特征在于，所述检测装置包括壳体（1），所述壳体（1）包括基部（2）和竖直部（3），所述基部（2）和竖直部（3）相互连通并形成倒T型结构；在所述竖直部（3）内呈一定角度设置有进光通道（5）、出光通道（6）和观察通道（7），进光通道（5）和出光通道（6）分别位于观察通道（7）的两侧，观察通道（7）垂直于基部（2）的底面；所述基部（2）的底面向下凹陷形成弧形滑槽（4），弧形滑槽（4）内嵌有样本承载台（11）。
4.根据权利要求3所述的一种近红外光谱快速检测精子浓度的方法，其特征在于：所述样品承载台（11）包括抽拉段和样品放置段，所述抽拉段为圆柱形，样品放置段为半圆柱形。
5.根据权利要求4所述的一种近红外光谱快速检测精子浓度的方法，其特征在于：所述样本承载台（11）的样品放置段向下凹陷形成样本放置槽（12）；旋转抽拉段改变样本放置槽（12）与水平面的夹角。
6.根据权利要求3或5所述的一种近红外光谱快速检测精子浓度的方法，其特征在于：所述进光通道（5）、出光通道（6）和观察通道（7）的末端汇聚于弧形滑槽（4）的正上方。
7.根据权利要求6所述的一种近红外光谱快速检测精子浓度的方法，其特征在于：所述进光通道（5）、出光通道（6）和观察通道（7）的末端与弧形滑槽（4）的上表面形成一定间隔。
8.根据权利要求3或5所述的一种近红外光谱快速检测精子浓度的方法，其特征在于：所述进光通道（5）、出光通道（6）和观察通道（7）在竖直部（3）的上表面分别形成进光口（8）、出光口（9）和观察口（10）。
9.根据权利要求4或5所述的一种近红外光谱快速检测精子浓度的方法，其特征在于：所述样本承载台（11）的抽拉段设有多个防滑凸棱。
10.根据权利要求4或5所述的一种近红外光谱快速检测精子浓度的方法，其特征在于：在所述样品承载台（11）的抽拉段和样品放置段之间还设有刻度盘（14）；在所述弧形滑槽（4）周围的基部（2）表面上设有刻度线（13），刻度盘（14）与刻度线（13）的刻度相互对应。
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|---|---|---|---|
| CN202010311484.7A CN111443058A (zh) | 2020-04-20 | 2020-04-20 | 一种近红外光谱快速检测精子浓度的方法 |
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| CN202010311484.7A CN111443058A (zh) | 2020-04-20 | 2020-04-20 | 一种近红外光谱快速检测精子浓度的方法 |
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| CN (1) | CN111443058A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109064469A (zh) * | 2018-10-31 | 2018-12-21 | 北京新网视信传媒科技有限公司 | 精子质量检测仪及精子质量检测系统 |
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2020
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Cited By (2)
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| CN109064469B (zh) * | 2018-10-31 | 2023-08-15 | 北京新网视信传媒科技有限公司 | 精子质量检测仪及精子质量检测系统 |
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