CN111440794A - 黄瓜新基因在提高光合作用、促进植株生长和自毒作用抗性中的应用 - Google Patents

黄瓜新基因在提高光合作用、促进植株生长和自毒作用抗性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学和基因工程领域，涉及一个在提高植物光合作用、促进黄瓜植株生长和抗连作障碍中发挥重要调控作用的新基因CsAt5g16610/MTG13_5。从黄瓜中克隆At5g16610的同源基因CsAt5g16610/MTG13_5(Csa5G426400.1)，利用建立的TRV‑VIGS体系沉默CsAt5g16610/MTG13_5基因获得黄瓜抗自毒作用植株的方法，及沉默CsAt5g16610/MTG13_5基因提高植物光合作用、抑制根系对CA的吸收及向上运输、维持细胞结构的稳定性及保持细胞活力、促进黄瓜植株生长、增强黄瓜抗自毒作用能力的可能调控机理，为创制黄瓜抗自毒作用的新种质提供理论依据和基因资源。

Description

黄瓜新基因在提高光合作用、促进植株生长和自毒作用抗性 中的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及At5g16610基因在提高黄瓜光合作用、促进黄瓜生长，以及缓解黄瓜自毒作用毒害中的应用。
背景技术
黄瓜是一种广泛栽培的蔬菜作物，也是一种具有经济价值的模式蔬菜作物。然而黄瓜不耐连作，连作后产量和品质严重下降。作物连作障碍与自毒物质的自毒作用密切相关(Yu and Matsui,1997；Yu et al.,2000and 2003)。由植物产生的化学物质残留在环境中对同科或同种植物的种子萌发及生长发育会产生抑制作用，即自毒作用(Miller,1996；Singh et al.,1999)。黄瓜连作造成的生长抑制现象与黄瓜根系分泌物以及根系残茬所产生的自毒物质有关(Yu et al.,2000and 2003)。黄瓜的根系分泌物包含肉桂酸、苯甲酸等多种酚酸类衍生物(Yu and Matsui,1994；吴凤芝，2002)。酚酸类化合物对黄瓜胚根和根系生长均能产生不同程度的抑制作用(Zhang et al.,2009；Bu et al.,2018and 2019)；同时酚酸类化合物影响细胞有丝分裂、核内复制和细胞循环相关基因的表达，其中以肉桂酸(CA)抑制效果最强(Zhang et al.,2009)。受体植物接触和吸收酚酸类物质后，会导致多种生理生化过程发生紊乱。例如对植物水分的吸收、矿质营养的吸收与运转产生影响(Bookeret al.,1992；Barkosky and Einhellig,1993；Baziramakenga et al.,1994；Yu andMatsui,1997)，同时可减弱植物的光合作用(Yu et al.,2003)，并且自毒物质是主要通过影响PSⅡ的功能对光合作用产生影响(Weir et al.,2004)。由于植物的根首先接触到自毒物质，因此根较其他植物器官对自毒作用更为敏感，植物旺盛生长的根尖分生区受化感物质影响，易产生细胞死亡及组织褐化现象(Bais et al.,2003)。此外，自毒物质影响活性氧的产生，使植物细胞膜去极性，引起膜质过氧化，提高膜透性，最终导致细胞死亡(Bu etal.,2016；Devi and Prasad,1996；Zeng et al.,2001；Yu et al.2003)。
设施蔬菜具有高度集约化、复种指数高和种植种类单一的特点，随连作年限增加，土壤理化性状变劣、土传病害加重、蔬菜产量和品质下降、严重制约了设施蔬菜生产发展的可持续性，目前已成为设施蔬菜生产中亟待解决的难题。特别是设施栽培黄瓜连作很容易导致土壤中酚酸类物质过量积累，连作5--9年的土壤酚酸类物质含量显著高于连作1--3年的土壤(马云华等，2005)。连作障碍可能将成为设施栽培黄瓜可持续发展的重要限制因素，自毒作用是设施蔬菜作物连作障碍发生的主要原因之一(Yu et al.,2000；Xiao et al.,2006)。因此，寻求一种有效的连作障碍缓解机制、解决自毒作用危害对设施栽培黄瓜自毒作用的研究和设施农业的高效利用具有重要的现实意义。由于目前黄瓜抗自毒作用品种较少，为了减少连作障碍引起的土壤问题以及对黄瓜产量和品质的影响，菜农主要靠喷施农药和增加化肥施用量，而农药化肥的大量使用造成了农药残留和环境污染，也极大的威胁了食品安全，因此培育黄瓜抗自毒作用新品种、延长设施温室的可连作年限成为解决黄瓜连作障碍问题、提高设施温室利用效率的理想途径，而黄瓜抗自毒作用育种的关键是挖掘出更多优良性状的基因。
植物遇到酚酸类物质胁迫时会启动自身的免疫机制如细胞壁加厚、产生活性氧和细胞程序化死亡，这个过程需要一系列基因的参与，如CmSCL13(scarecrow-like protein13-like)基因(Xie et al.,2014a)，CCCH型锌指蛋白基因和CmTIP(水通道蛋白)(Xie etal.,2014b)，钙信号途径和MAPK信号途径、生长素和玉米素合成及运输、光合作用、呼吸作用等相关基因(Yang et al.,2013and 2015)，这些基因相互协调，共同介导植物的抗性反应。Xie等采用cDNA-AFLP技术分析了甜瓜自毒作用相关基因CmSCL13(scarecrow-likeprotein 13-like)、CCCH型锌指蛋白基因和CmTIP(水通道蛋白)与甜瓜自毒作用密切相关(Xie et al.,2014a and 2014b)，其中根系分泌物能够诱导CmSCL13基因的表达(Xie etal.,2014a)，此外利用TMpred在线分析对甜瓜CCCH型锌指蛋白进行跨膜结构预测，推测CCCH型锌指蛋白可能存在跨膜结构域，属于跨膜蛋白(Xie et al.,2014b)。Yang等采用转录组测序技术构建了连作和正茬地黄根部和叶片表达序列标签库，地黄根部的钙信号途径和MAPK信号途径参与了地黄化感物质的信号感知、传导和放大(产生乙烯)(Yang et al.,2013and 2015)。然而抗性基因的挖掘，传统的方法是通过转录组测序，数据量大且目标基因不明确，因此寻找抗性明确且具有持久抗性的基因迫在眉睫。
突变体库已成为植物功能基因研究的重要手段。传统的突变体库构建方法有物理化学诱变、T-DNA插入突变、AC-DS转座子突变、同源重组等。然而这些方法在多拷贝基因、家族基因、特异表达基因、条件致死基因的研究中，存在着一定的局限性(谢洪科等，2015)。构建RNA干扰(RNA interference,RNAi)突变体库，则可以克服传统方法中的不足。RNAi由双链RNA(dsRNA)引发的转录后的基因沉默现象。由dsRNA产生的小分子RNA(smallinterference RNA，siRNA)进入RNA后，诱导沉默复合体(RISC)，导致了生物体内同源转录产物产生特异性降解，即PTGS(Post-tran-scriptional gene silencing)(Elbashir etal.,2001)。这是基因表达调控的重要方式之一。如今，RNAi技术已在遗传分析领域成为了强有力的工具，而且在基因功能分析鉴定方面发挥着越来越重要的作用。
2010年，王磊和罗彦忠等以RMHR(rolling-circle amplification(RCA)-mediated hpRNA)为基础构建了拟南芥RNAi突变体文库，得到的拟南芥250、350两个RNAi文库(Wang et al.,2008；罗彦忠,2010)。该RNAi文库可靶向覆盖拟南芥基因组的绝大部分基因，并且这些基因均匀分布在拟南芥染色体组上。利用以RMHR构建的拟南芥RNAi文库筛选得到的JAV1基因通过调控茉莉酮酸酯途径(jasmonate pathway)介导拟南芥提高对昆虫和病原体侵害的抵抗力(Hu et al.,2013)。申请人团队前期利用65℃高温处理筛选拟南芥RNAi突变体文库，鉴定突变体株系得到At234基因在多个耐高温的突变体株系中发生沉默，沉默At234基因对棉花大丽轮枝菌和大豆核盘菌均感病，对玉米灰葡萄孢菌和茄病镰刀菌均表现为明显抗病，对重金属CdCl2和Pb(NO3)2胁迫、甘露醇诱导的干旱胁迫以及NaCl诱导的高盐胁迫表现出显著抗性，表明利用拟南芥RNAi文库筛选得到的At234基因是拟南芥参与生物胁迫与非生物胁迫反应中的一个关键基因(马淑雅，2016)。此外，申请人团队利用CA诱导自毒作用通过拟南芥RNAi文库筛选突变体，发现沉默glycerol-3-phosphateacyltransferase 6(GPAT6)基因的拟南芥突变体株系对CA诱导的自毒作用表现出显著的抗性，利用项目组建立的黄瓜TRV-VIGS体系沉默黄瓜GPAT6同源基因CuGPAT6，植株通过维持细胞结构的完整、保持细胞活力、增加叶片叶绿体和类囊体数目、增加光合速率来提高对CA诱导的自毒作用抗性(Bu et al.,2019)。综上所述，突变基因的多样性决定了其参与的生物学过程的广泛性，如植物的生殖、催化、电子传递、结合等生物学功能，同时参与了脂肪酸的转化、氨基酸的代谢、生物碱的合成等代谢途径(罗彦忠，2010)。因此，拟南芥RNAi突变体文库的构建和应用为挖掘抗自毒作用相关基因提供了很好的遗传分析工具和工作基础。
挖掘和鉴定抗自毒作用相关基因对于更广泛而深入的研究自毒作用机理和抗自毒作用育种都有重要的意义。团队成员通过CA模拟自毒作用毒害，利用已构建好的拟南芥RNAi文库筛选突变基因，以期寻找对自毒作用具有显著抗性的关键调控基因，并解析其参与的抗自毒作用信号通路。我们前期在11,200个T0代拟南芥突变体中发现了约1000个拟南芥突变体株系，通过对突变体株系鉴定，发现14个基因在抗CA胁迫的拟南芥突变体株系中发生沉默。我们将14个基因发生沉默的拟南芥突变体株系T1代种子播种于含有0.25mM CA和50mg/L潮霉素的MS平板上，同时以野生型拟南芥(Columbia 0)为对照，观察各基因沉默的突变体株系的T2代植株对CA胁迫的抗性情况。同时我们在黄瓜中克隆了14个基因的同源基因，并分别构建了TRV-VIGS载体，利用已建立的黄瓜TRV-VIGS体系分别沉默14个黄瓜同源基因。结果表明At5g16610/MTG13_5基因发生沉默株系HCA350-597的T2代拟南芥植株依然对CA保持显著抗性，同时利用TRV-VIGS体系沉默黄瓜At5g16610/MTG13_5基因的同源基因CsAt5g16610/MTG13_5，结果显示沉默CsAt5g16610/MTG13_5基因的黄瓜植株对CA诱导的自毒作用毒害具有显著的抗性，利用高效液相色谱(High Performance LiquidChromatography,HPLC)对植株不同组织的CA含量进行分析表明，沉默CsAt5g16610/MTG13_5显著抑制CA胁迫条件下根系对CA的吸收积累，并且抑制CA由根系向地上部分运输，显著减少了CA在茎和叶片的积累量。上述结果表明，At5g16610/MTG13_5是拟南芥对CA胁迫抗性反应功能基因，CsAt5g16610/MTG13_5是黄瓜抵抗自毒作用的负调控关键基因。此外，At5g16610/MTG13_5和CsAt5g16610/MTG13_5在拟南芥和黄瓜中均是功能未知且未被命名的新基因。
发明内容
本发明的目的在于挖掘抗CA胁迫相关基因，利用拟南芥RNAi突变体文库筛选得到抗CA胁迫的相关基因At5g16610，该基因是拟南芥功能未知的新基因，其登录号为：AY078952.1。本发明的另一目的在于克隆的黄瓜At5g16610基因的同源基因CsAt5g16610/MTG13_5(Csa5G426400.1)，为一个功能未知的黄瓜新基因，在调控黄瓜植株对CA的吸收和运输，缓解CA诱导的黄瓜自毒作用中的应用。
利用拟南芥RNAi突变体文库，以黄瓜自毒物质肉桂酸(cinnamic acid,CA)模拟胁迫条件筛选得到拟南芥功能未知的新基因At5g16610，其Genbank登录号为AY078952.1。
所述的At5g16610黄瓜同源基因CsAt5g16610/MTG13_5(Csa5G426400.1)，该基因是一个功能未知的黄瓜新基因，其Genbank登录号为：XM_011656935.1。
所述的新基因CsAt5g16610/MTG13_5(Csa5G426400.1)在提高黄瓜光合作用、促进黄瓜生长，及缓解黄瓜自毒作用中的应用。
通过RNA干扰拟南芥新基因At5g16610来增加对CA胁迫的抗性。
沉默黄瓜新基因CsAt5g16610/MTG13_5(Csa5G426400.1)显著降低了CA诱导自毒作用条件下黄瓜植株对CA的吸收积累量，同时显著抑制了CA从根系向地上部(茎和叶片)运输的能力；结果表明CsAt5g16610/MTG13_5(Csa5G426400.1)基因参与了调控黄瓜植株对CA的吸收及运输。
沉默CsAt5g16610/MTG13_5(Csa5G426400.1)基因可显著提高叶片净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)，增加叶绿体细胞和根尖细胞中淀粉颗粒的积累量，同时增加根尖细胞中线粒体(Mi)、内质网(ER)、高尔基体(GA)等细胞器的积累量；增加胞间连丝(PL)的数目。这些结果表明，沉默CsAt5g16610/MTG13_5基因提高根尖细胞的活力，促进光合作用速率，增加光合产物(如淀粉颗粒)的积累储存量。同时，沉默CsAt5g16610/MTG13_5基因促进黄瓜生长，表明CsAt5g16610/MTG13_5基因参与了光合作用调控和黄瓜植株生长调控。
沉默CsAt5g16610/MTG13_5基因可显著增加CA诱导的自毒作用条件下黄瓜叶片的气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)，增加叶绿体中基粒片层(GL)的数目和类囊体(Thy)的垛叠程度，增加叶绿体细胞中淀粉颗粒的积累量，增加叶片细胞中胞间连丝(PL)的数目，维持叶片和根系细胞结构的完整性和稳定性，保障细胞功能的正常运行，增强黄瓜植株的抗CA诱导的自毒作用毒害的能力。结果表明CsAt5g16610/MTG13_5基因是抗黄瓜自毒作用的关键调控基因。
本发明提供了黄瓜At5g16610基因的同源基因为一个功能未知的黄瓜新基因，CsAt5g16610/MTG13_5(Csa5G426400.1)在参与调控提高黄瓜光合作用、促进黄瓜生长中的应用。
上述的应用是通过沉默At5g16610基因来抑制CA从根系向地上部运输、提高光合作用、促进黄瓜生长，以及缓解黄瓜自毒作用毒害的。
附图说明
图1.通过对11,200株转基因拟南芥RNAi突变体文库的遗传筛选，从一个发夹RNA突变体株系HCA350-597中鉴定得到该株系At5g16610基因被干扰发生沉默。突变体株系HCA350-597在萌发14天后对0.25mM CA表现出明显的抗性，而野生型(wild type,WT)植株在相同生长条件下出现明显的矮化和枯萎，甚至导致部分植株死亡。
图2.HCA350-597突变体株系T2代抗CA胁迫表型。(A)WT拟南芥生长在无胁迫的MS培养基表型，(B)WT拟南芥生长在0.25mM CA胁迫的MS培养基表型，(C)HCA350-597株系T2代生长在0.25mM CA胁迫的MS培养基表型。
图3.利用TRV介导的VIGS体系沉默At5g16610基因获得抗CA胁迫株系表型。(A1-A3)wild-type(WT)，(B1-B3)WT+CA，(C1-C3)TRV空载对照，(D1-D3)pTRV空载+CA，(E1-E3)CsAt5g16610/MTG13_5-VIGS，(F1-F3)CsAt5g16610/MTG13_5-VIGS+CA。
图4.黄瓜CsAt5g16610基因在TRV介导的CsAt5g16610/MTG13_5基因VIGS植株叶片和根系中表达量qRT-PCR分析(A)，黄瓜CsAt5g16610/MTG13_5基因在WT植株叶片和根系中的表达量qRT-PCR分析(B)。以黄瓜基因DQ641117作为内参基因，qRT-PCR在叶片中的表达水平表示为对照比例，定义为1。不同处理间叶片和根系中CsAt5g16610基因表达量(平均值±SE)差异显著性(P≤0.05)由不同字母表示。每处理三个生物学重复。
图5.利用农杆菌介导的黄瓜CsAt5g16610/MTG13_5基因RNAi遗传转化，获得沉默CsAt5g16610/MTG13_5基因抗CA胁迫的黄瓜植株表型。(A)WT，(B)WT+CA，(C)转化pK7GWIWG2II-RedRoot空载体对照植株，(D)pK7GWIWG2 II-RedRoot+CA，(E)利用pK7GWIWG2 II-RedRoot介导的CsAt5g16610/MTG13_5基因沉默的黄瓜植株，(F)pK7GWIWG2 II-RedRoot-CsAt5g16610/MTG13_5+CA；(G)黄瓜CsAt5g16610/MTG13_5基因沉默和CA诱导的自毒作用对黄瓜植株高度的影响，(H)pK7GWIWG2 II-RedRoot介导的CsAt5g16610/MTG13_5-RNAi的qRT-PCR分析，以黄瓜DQ641117未内参基因，3次独立生物学重复。以WT黄瓜叶片的表达量为参比，表达量设为1，分析CsAt5g16610/MTG13_5基因在不同处理中的差异表达量。值(平均值±SE)为三个独立试验的平均值，处理间的差异显著性(P≤0.05)由不同的小写字母表示。
图6.黄瓜自毒物质CA诱导的自毒作用和TRV介导的黄瓜CsAt5g16610/MTG13_5基因沉默对黄瓜植株不同组织中CA的吸收积累量的影响。值(平均值±SE)为三个独立试验的平均值，处理间的差异显著性(P≤0.05)由不同的小写字母表示。
图7.黄瓜CsAt5g16610/MTG13_5基因沉默和对照植株中根尖细胞透射电镜(TEM)超微结构观察。(A1-A5)WT，(B1-B5)WT+CA，(C1-C5)TRV空载对照，(D1-D5)pTRV空载+CA，(E1-E5)CsAt5g16610/MTG13_5-VIGS，(F1-F5)CsAt5g16610/MTG13_5-VIGS+CA。图A1,B1和D1的标尺为20.0μm，图C1和E1标尺为10.0μm，图A2,C2,C3,D2,E2和F1的标尺为5.0μm，图A3,B2,B3,D3,D4,F2和F3的标尺为2.0μm，图A4,A5,B4,C4,C5,E3-E5,F4和F5的标尺为1.0μm，图B5和D5的标尺为500nm。缩略词：CW＝cell wall,Nu＝nucleolus,Ka＝karyotheca,Cm＝cytomembrane,Mi＝mitochondria,Pl＝plasmodesmata,ER＝endoplasmic reticulum,GA＝Golgi apparatus,V＝vacuole,SG＝starch granule,Au-Pha＝autophagosome,Ka-oxis＝karyorrhexis,PV＝phagocytic vacuole,OG＝osmiophilic globules.
图8.黄瓜CsAt5g16610/MTG13_5基因沉默对CA胁迫条件下黄瓜叶片净光合速率(Pn)，气孔导度(Gs)，蒸腾速率(Tr)和胞间CO2浓度(Ci)的影响。
图9.黄瓜CsAt5g16610/MTG13_5基因沉默和对照植株中叶片叶绿体细胞透射电镜(TEM)超微结构观察。(A1-A4)WT，(B1-B4)WT+CA，(C1-C4)TRV空载对照，(D1-D4)pTRV空载+CA，(E1-E4)CsAt5g16610/MTG13_5-VIGS，(F1-F4)CsAt5g16610/MTG13_5-VIGS+CA。图B1,D1,E1和F1的标尺为20.0μm，图A1,C1和C2标尺为10.0μm，图D2,E2和F2的标尺为5.0μm，图A2,B2,C3,D4和F3的标尺为2.0μm，图A3,A4,B3,C4,D3和E3的标尺为1.0μm，图B4,E4和F4的标尺为500nm。缩略词：CW＝cell wall,Chl＝chloroplast,Thy＝thylakoid,GL＝granalamella,SL＝stroma lamella,Nu＝nucleolus,Ka＝karyotheca,Cm＝cytomembrane,Mi＝mitochondria,Chl-Bm＝chloroplast bimembrane,Pl＝plasmodesmata,ER＝endoplasmicreticulum,GA＝Golgi apparatus,V＝vacuole,SG＝starch granule,Au-Pha＝autophagosome,PV＝phagocytic vacuole,OG＝osmiophilic globules.
具体实施方式
下面结合附图对本发明做详细说明。
实施例1
利用已有的拟南芥RNAi突变体文库，在含有50mg/L潮霉素和0.25mM肉桂酸(CA)的MS培养基上，从约11200个RNAi转化植株中筛选得到抗CA胁迫的约1000个突变体株系。相反，野生型(WT)拟南芥植株在同样的MS平板上表现出明显的矮化和枯萎症状，甚至导致某些WT拟南芥植株死亡(图1)。在突变体株系莲座期，我们分别提取拟南芥突变体株系的DNA基因组，以特异性引物NOS-60：CAACAGGATTCAATCTTAAGAAAC和Intron FW2：CATATTGCAAAGTCTGAAGACTC对拟南芥转化RNAi文库中的干扰RNA进行PCR扩增，回收PCR产物并连接到pMDTM19-T(TaKaRa,Code No.6013)载体，测序以期获得突变基因。在NCBI中BLAST测序结果，我们发现一个拟南芥功能未知的新基因At5g16610(NM_203062.2)在HCA350-597突变体株系中沉默(图1)。
此外，我们还观察了HCA350-597突变体株系的T2代拟南芥抗CA表型。将收获的HCA350-597突变体株系的T1代拟南芥种子和WT种子同时播种至含有0.25mM CA的MS培养基上，同时做WT的对照处理。由图2A中可以观察到WT拟南芥在正常的MS培养基上根系发达，莲座叶生长旺盛；而WT拟南芥在CA胁迫条件下，根系短而少，莲座叶小，叶片数目减少(图2B)。在CA胁迫条件下，HCA350-597突变体株系的T2代拟南芥较WT长势好，根系增加，莲座叶叶片大且叶片数多(图2C)。结果表明HCA350-597突变体株系的T2代植株表现出显著的抗CA胁迫能力，拟南芥新基因At5g16610在抗CA诱导的自毒胁迫中可能具有重要的调控作用。
表1实施例1、2和4所用寡核苷酸的名称和序列
Figure BDA0002438934940000071
实施例2
黄瓜CsAt5g16610/MTG13_5基因同源基因的克隆及pTRV-VIGS载体的构建。在黄瓜基因组数据库(http://cucurbitgenomics.org/)中BLAST得到At5g16610基因的同源基因mRNA序列，设计引物，以黄瓜cDNA为模板克隆得到黄瓜同源基因CsAt5g16610/MTG13_5，在黄瓜中编码序列号为Csa5G426400.1，该基因是一个功能未知的黄瓜新基因。在黄瓜CsAt5g16610/MTG13_5基因的第326-745bp(总长为1905bp)设计引物CsAt5g16610-pTRV2-F：GCCTCCATGGGGATCCCTGGTGTGGCTGTAACTAA和CsAt5g16610-pTRV2-R：GCCTCGAGACGCGTGAGCTCCTGTAGCAACCTTCTCTGT，以黄瓜cDNA为模板，PCR扩增VIGS片段，回收，并利用In-FusionHD Cloning Kit(Takara,Cat.Nos.121416)将回收的黄瓜CsAt5g16610基因VIGS片段连接至已酶好切的TRV2(酶切位点为Sac I-BamH I)载体。
实施例3
黄瓜pTRV-VIGS侵染液的制备及黄瓜转化。将TRV1和连有黄瓜CsAt5g16610基因VIGS片段的TRV2质粒分别转化GV3101农杆菌，按照TRV1：TRV2为1：1的比例混合，28℃培养至OD 600为0.8，作为农杆菌侵染液。利用“黄瓜子叶节法”将制备好的农杆菌侵染液侵染黄瓜植株，获得黄瓜pTRV-VIGS转化黄瓜植株，同时设置WT和pTRV对照。
农杆菌侵染10天后，将WT黄瓜、pTRV空载对照和CsAt5g16610-VIGS黄瓜植株分别设置0.25mM CA胁迫处理和对照，设置处理如下：(A)WT，(B)WT+CA，(C)pTRV空载对照，(D)pTRV空载+CA，(E)CsAt5g16610-VIGS，(F)CsAt5g16610-VIGS+CA。CA处理14天后进行拍照和指标参数测定。
实施例4
黄瓜CsAt5g16610基因qRT-PCR的测定。利用OMEGA公司的RNA提取试剂盒对CA处理14天后的CsAt5g16610-VIGS和对照组黄瓜叶片和根系提取总RNA，并反转录成cDNA(PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser,Takara)。以cDNA为模板，特异性引物CsAt5g16610-qRT-PCR-F：GGGCTCCTGCCGGCAATGCT和CsAt5g16610-qRT-PCR-R：CCCGACTTCTCATCCACTCTTGCACA，利用TB GreenTM Premix Ex TaqTM II(TaKaRa,Japan)试剂盒和ABI 7500Real-Time PCR体系扩增。以黄瓜DQ641117基因为内参，内参基因特异性引物为DQ641117.1-F：GGGTTACGCCCTCCCTCATGCCA和DQ641117.1-R：TCCCGTTCGGCAGTGGTGGT同时进行Real-Time PCR反应。以WT黄瓜为对照样本(校准样本)，其表达量为1，目的基因相对转录表达水平计算公式为2-ΔΔCt，ΔCt(校准样本)＝Ct(校准样本)-Ct(Actin)，ΔCt(测定样本)＝Ct(测定样本)-Ct(Actin)；ΔΔCt＝ΔCt(测定样本)-ΔCt(校准样本)。
实施例5
农杆菌介导的黄瓜CsAt5g16610基因RNAi遗传转化。将构建好的CsAt5g16610基因的RNAi载体和空载pK7GWIWG2 II-RedRoot分别转化到GV3101农杆菌，28℃培养至OD 600为0.3，作为农杆菌转化液。将制备好的农杆菌转化液转化至黄瓜，利用子叶节诱导成苗，获得黄瓜CsAt5g16610-RNAi转化植株，同时设置WT和空载pK7GWIWG2 II-RedRoot对照。待转化植株成苗后，将WT黄瓜、pK7GWIWG2 II-RedRoot空载对照和CsAt5g16610-RNAi黄瓜植株分别设置0.25mM CA胁迫处理和对照，设置处理如下：(A)WT，(B)WT+CA，(C)pK7GWIWG2 II-RedRoot空载对照，(D)pK7GWIWG2 II-RedRoot空载+CA，(E)CsAt5g16610-RNAi，(F)CsAt5g16610-RNAi+CA。CA处理6周后进行拍照和指标参数测定。
实施例6
农杆菌介导的黄瓜CsAt5g16610-RNAi遗传转化株系中CsAt5g16610基因表达量分析。利用OMEGA公司的RNA提取试剂盒对CA处理6周后的CsAt5g16610-VIGS和对照组黄瓜叶片提取总RNA，并反转录成cDNA(PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser,Takara)。以cDNA为模板，qRT-PCR分析方法和引物同实施例4。
实施例7
黄瓜自毒物质CA诱导的自毒作用和CsAt5g16610/MTG13_5-VIGS基因沉默对TRV介导的黄瓜CsAt5g16610/MTG13_5基因VIGS植株不同组织中CA的吸收积累量的影响分析。分别快速分离CA处理14天后TRV介导的黄瓜CsAt5g16610-VIGS和对照植株(WT、WT+CA、TRV对照、TRV+CA、CsAt5g16610-VIGS,CsAt5g16610-VIGS+CA)的根、茎、叶，并在105℃的烘箱中烘15min，80℃烘12h，并研磨至粉末。分别取0.25g干粉溶解于5mL的甲醇静置0.5h，超声萃取45min，离心，取上清液过滤0.22μm滤膜，滤液为CA萃取液。采用高效液相色谱法(HPLC)测定肉桂酸含量，色谱柱：Waters C18(4.6×250mm,5μm)，流动相为乙腈-3％乙酸水溶液(58.5∶41.5)，流速1.0mL min-1，检测波长280nm，柱温30℃。
实施例8
黄瓜CsAt5g16610基因沉默和对照植株光合作用参数的测定。利用光合仪(LI-6400XT，UK)测定黄瓜CsAt5g16610基因植株和对照组黄瓜植株由上向下第2-3片新展开叶的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)和胞间CO2浓度(Ci)，测定时间为9:00-15:00，叶室温度25℃，叶室内CO2浓度为380mol CO2 mol-1air，光合作用光子通量强度为1000μmol photons m-2s-1。每处理六次独立生物学重复。
实施例9
黄瓜CsAt5g16610基因沉默和对照植株叶片和根尖细胞超微结构的观察。用薄刀片取黄瓜CsAt5g16610基因植株和对照组黄瓜植株的叶片和根尖组织(每样本1×3mm2)，并立即用2.5％(vol/vol)的戊二醛固定细胞。用常规操作步骤对样本进行处理包埋，用超薄切片机(MT-X；RMC Inc,Tucson,AZ)切片(约50nm厚)。样本用透射电子显微镜(HT7700；HITACHI Ltd,Japan)在80kV电压下观察黄瓜叶片和根尖细胞的超微结构。
试验结果分析：
(1)沉默CsAt5g16610基因和CA诱导的自毒作用对黄瓜植株生长的影响
将构建好的CsAt5g16610-TRV2载体与TRV1等比例(1:1)混合侵染黄瓜的特异分生组织部位进行农杆菌介导的转化。培养10天后用黄瓜自毒物质CA诱导自毒作用，同时设置对照组。CA诱导自毒作用14天后观察表型并对CsAt5g16610基因的表达量进行分析。
结果表明，WT和TRV空载对照在CA诱导的自毒作用条件下，地上和地下部分长势均变弱，表现为株高降低、叶片数量显著减少、叶面积变小，根系长度显著变短、根表面积、根体积和侧根数显著减少(图3B1-B3,D1-D3)，而TRV诱导的CsAt5g16610基因沉默后显著增加了黄瓜对CA胁迫的抗性(图3F1-F3)，表现为叶片数目、叶面积、根系长度、根表面积、根体积和根尖数量显著增加(图3F1-F3)。此外，沉默CsAt5g16610基因后黄瓜叶片和根系的长势显著优于TRV空载(图3E1-E3)，表现为在无CA胁迫的正常生长条件下沉默CsAt5g16610基因的黄瓜植株较TRV空载植株叶片数量、株高、根长、侧根数量显著增加(图3)，表明CsAt5g16610基因是影响黄瓜生长的负调控基因。
利用建立的黄瓜新型非组培原位转化技术体系对pK7GWIWG2 II-RedRoot载体携带的CsAt5g16610基因的RNA发夹结构进行遗传转化，结果表明CA胁迫显著降低了WT和pK7GWIWG2 II-RedRoot对照植株的株高，抑制了黄瓜生长(图5B,5D和5G)。然而沉默CsAt5g16610基因在正常生长条件下显著增加了黄瓜的株高，促进了黄瓜生长，同时在CA胁迫条件下CsAt5g16610-RNAi+CA植株高度显著大于pK7GWIWG2 II-RedRoot+CA对照植株，表明沉默CsAt5g16610基因显著增加了黄瓜植株对CA诱导的自毒作用的抗性(图5E-G)。
提取CA诱导自毒作用14天的黄瓜各处理RNA，并反转录成cDNA，以cDNA为模板，qRT-PCR分析黄瓜叶片和根系CsAt5g16610基因的相对表达量，结果表明，TRV介导的黄瓜CsAt5g16610-VIGS均显著降低了叶片和根系CsAt5g16610基因的相对表达量(图4A)；同时，我们分析了CsAt5g16610基因在WT植株的叶片和根系中的相对表达量，结果表明CsAt5g16610基因主要在叶片中表达，其在根系中的表达量极低(图4B)。此外，利用qRT-PCR分析了农杆菌介导的CsAt5g16610-RNAi植株叶片的CsAt5g16610基因表达量，pK7GWIWG2II-RedRoot介导的CsAt5g16610基因RNAi植株在CA胁迫和正常生长条件下，CsAt5g16610基因的相对表达量均显著下调(图5H)，与TRV介导的CsAt5g16610基因沉默结果一致(图4A)。
2)沉默CsAt5g16610显著抑制了CA诱导的自毒作用条件下黄瓜根系对CA的吸收积累量，同时抑制了CA胁迫和正常生长条件下CA从根系到茎、叶的运输能力
结果表明在无CA胁迫的正常生长条件下，与TRV空载对照植株相比，沉默CsAt5g16610基因显著抑制了CA从根到茎、叶片的运输量，即沉默CsAt5g16610的黄瓜植株茎和叶片的CA含量显著低于TRV对照植株(图6)。此外，CA处理显著增加了WT和TRV对照植株根系CA的吸收积累量，并且CA被大量运输至茎和叶片，然而沉默CsAt5g16610显著抑制了根系对CA的吸收积累量，并且显著抑制了CA从根系到地上部茎叶的运输量。导致CA处理条件下，CsAt5g16610基因沉默的黄瓜植株根、茎、叶的CA含量显著低于WT和TRV对照植株。其中CA处理条件下，CsAt5g16610沉默植株茎部CA含量显著低于正常生长条件下TRV对照植株茎中CA含量，CsAt5g16610沉默植株叶片CA含量显著低于WT和TRV对照植株，甚至与正常生长条件下的WT和CsAt5g16610-VIGS叶片CA含量保持一致(图6)。以上结果表明，沉默CsAt5g16610显著抑制了CA诱导的自毒作用条件下黄瓜根系对CA的吸收积累量，同时沉默CsAt5g16610显著抑制了CA胁迫和正常生长条件下CA从根系到茎、叶的运输量(图6)，这些结果表明CsAt5g16610基因参与了黄瓜CA的运输调控途径，沉默CsAt5g16610可能是通过抑制CA向地上部分运输来缓解黄瓜自毒作用毒害的，CsAt5g16610基因可能是调控黄瓜自毒作用的关键基因。
3)沉默黄瓜At5g16610(NM_203062.2)的同源基因CsAt5g16610(Csa5G426400.1)可促进黄瓜生长、提高黄瓜抗CA诱导的自毒作用能力，可能是通过沉默CsAt5g16610基因维持黄瓜根尖细胞结构的完整性、增加根尖细胞活力，进而促进植株生长，缓解CA诱导的自毒作用。
利用透射电镜(TEM)观察根尖细胞超微结构结果表明，WT和pTRV空载黄瓜植株根尖细胞结构完整且排列紧密；CA诱导自毒作用14天，导致黄瓜WT和pTRV空载植株根尖细胞质壁分离(图7B5；图7D5)，自噬体增加(图7B5；图7D3-D5)，细胞核发生核裂现象(图7B2-B4)，严重破坏了根尖细胞超微结构。沉默CsAt5g16610基因细胞壁光滑平整，线粒体(Mi)、高尔基体(GA)、内质网(ER)、淀粉颗粒(SG)等细胞器丰富，胞间连丝(Pl)增加(图7E1-E5)。表明沉默CsAt5g16610可增加黄瓜根尖细胞活力；此外，沉默CsAt5g16610可显著修复CA胁迫对黄瓜根尖细胞造成的损伤(图7F1-F5)。结果表明，沉默CsAt5g16610基因能够提高黄瓜根尖细胞活力，促进黄瓜生长，并且维持CA胁迫条件下根尖细胞结构的完整性，进而缓解CA诱导的黄瓜自毒作用。
4)沉默CsAt5g16610基因促进黄瓜植株生长、增强黄瓜对CA诱导的自毒胁迫的抗性可能是通过增加类囊体的数目和类囊体垛叠程度、提高黄瓜光合效率实现的
由图4B可知，黄瓜CsAt5g16610基因主要在叶片中表达。因此，我们还分析了CsAt5g16610沉默和对照组黄瓜光合参数。沉默CsAt5g16610基因能够显著增加黄瓜叶片的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)，而CA可显著诱导沉默CsAt5g16610黄瓜植株Pn下降，同时，诱导叶片Gs和Tr的显著下降(图8A-C)。结果表明，沉默CsAt5g16610基因显著增加黄瓜植株光合效率，而CA可能通过气孔因素诱导黄瓜植株光合速率下降(图8)。
叶绿体是植物进行光合作用的主要场所，我们观察了CsAt5g16610沉默和对照组黄瓜叶片叶绿体超微结构。结果表明，WT和pTRV对照组黄瓜叶片叶绿体细胞排列紧密，类囊体(Thy)垛叠整齐(图9A1-A4；图9C1-C4)；CA胁迫14天后导致WT和pTRV黄瓜叶片叶绿体细胞Thy垛叠减少(图9B1-B4；图9D1-D4)，甚至Thy垛叠紊乱、吞噬泡(PV)增加、噬俄体颗粒(OG)增多(图9D2-D4)。沉默CsAt5g16610维持CA胁迫条件下叶绿体细胞结构的完整性，叶绿体细胞排列紧密、Thy垛叠整齐、胞间连丝(PL)和淀粉颗粒(SG)显著增加，表明沉默CsAt5g16610可以维持CA胁迫条件下细胞功能、增加细胞活力、缓解CA胁迫(图9F1-F4)。此外，沉默CsAt5g16610基因显著增加CA胁迫下叶绿体细胞内SG(图9F1-F4)，这可能是导致叶片气孔导度下降(图8B)的主要原因之一。
综上所述，利用拟南芥RNAi文库在CA诱导的自毒作用下，筛选得到拟南芥突变体株系HCA350-597对CA表现出显著抗性(图1)。同时，HCA350-597株系的T2代拟南芥植株对CA诱导的自毒作用同样表现出显著抗性(图2C)。经鉴定发现一个拟南芥功能未知的新基因At5g16610(NM_203062.2)在HCA350-597突变体株系中发生沉默。我们克隆了黄瓜At5g16610的同源基因CsAt5g16610/MTG13_5(Csa5G426400.1)同样为一个功能未知的黄瓜新基因。利用团队已建立的TRV-VIGS体系和pK7GWIWG2 II-RedRoot介导的CsAt5g16610基因RNAi干扰原位转化体系分别沉默CsAt5g16610基因，均获得了黄瓜植株对CA诱导自毒作用的抗性表型(图3F1-F3；图5F-G)。沉默CsAt5g16610基因增加黄瓜对CA诱导的自毒作用抗性是通过增加根尖细胞壁厚度、维持细胞结构的完整性、丰富细胞器的种类的数目、提高细胞活性和功能(图7F1-F5)，抑制根系对CA的吸收和积累量、同时减少由根系向茎、叶的运输量(图6)；此外，沉默CsAt5g16610基因提高了叶片的光合效率(图8)，增加光合产物积累(图9F1-F4)，增加叶片细胞壁的厚度、减少质壁分离，增加类囊体的垛叠程度和数目(图9F2-F4)，促进叶片细胞叶绿体、线粒体等细胞器的活性，增加胞间连丝的数目(图9F3)，促进细胞间物质交换，提高细胞活力，增加黄瓜植株对CA诱导自毒作用的抗性。
此外，在无CA诱导自毒作用条件下，沉默CsAt5g16610基因提高了叶片光合作用(图8A)，促进光合产物积累(图7E1，E4-E5；图9E3)，丰富细胞器的种类和数目，提高细胞活力(图7E1-E5；图9E1-E4)，从而促进了黄瓜植株生长。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (7)

1.利用拟南芥RNAi突变体文库，以黄瓜自毒物质肉桂酸(cinnamic acid,CA)模拟胁迫条件筛选得到拟南芥功能未知的新基因At5g16610，其Genbank登录号为AY078952.1。
2.权利要求1所述的At5g16610黄瓜同源基因CsAt5g16610/MTG13_5(Csa5G426400.1)，该基因是一个功能未知的黄瓜新基因，其Genbank登录号为：XM_011656935.1。
3.沉默权利要求2所述的新基因CsAt5g16610/MTG13_5(Csa5G426400.1)在提高黄瓜光合作用、促进黄瓜生长，及缓解黄瓜自毒作用中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过RNA干扰拟南芥新基因At5g16610来增加对CA胁迫的抗性。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，沉默黄瓜新基因CsAt5g16610/MTG13_5(Csa5G426400.1)显著降低了CA诱导自毒作用条件下黄瓜植株对CA的吸收积累量，同时显著抑制了CA从根系向地上部(茎和叶片)运输的能力；结果表明CsAt5g16610/MTG13_5(Csa5G426400.1)基因参与了调控黄瓜植株对CA的吸收及运输。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，沉默CsAt5g16610/MTG13_5(Csa5G426400.1)基因可显著提高叶片净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)，增加叶绿体细胞和根尖细胞中淀粉颗粒的积累量，同时增加根尖细胞中线粒体(Mi)、内质网(ER)、高尔基体(GA)等细胞器的积累量；增加胞间连丝(PL)的数目。这些结果表明，沉默CsAt5g16610/MTG13_5基因提高根尖细胞的活力，促进光合作用速率，增加光合产物(如淀粉颗粒)的积累储存量；同时，沉默CsAt5g16610/MTG13_5基因促进黄瓜生长，表明CsAt5g16610/MTG13_5基因参与了光合作用调控和黄瓜植株生长调控。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，沉默CsAt5g16610/MTG13_5基因可显著增加CA诱导的自毒作用条件下黄瓜叶片的气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)，增加叶绿体中基粒片层(GL)的数目和类囊体(Thy)的垛叠程度，增加叶绿体细胞中淀粉颗粒的积累量，增加叶片细胞中胞间连丝(PL)的数目，维持叶片和根系细胞结构的完整性和稳定性，保障细胞功能的正常运行，增强黄瓜植株的抗CA诱导的自毒作用毒害的能力。结果表明CsAt5g16610/MTG13_5基因是抗黄瓜自毒作用的关键调控基因。
CN202010260006.8A 2020-04-03 2020-04-03 黄瓜基因在提高光合作用、促进植株生长和自毒作用抗性中的应用 Active CN111440794B (zh)

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