CN111424045A - 鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin的优化基因及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一条重组鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin编码基因的优化序列和一个含有该序列的表达载体，优化序列中6个组氨酸密码子有利于产物的亲和纯化，TEV酶位点序列有利于最终纯化的蛋白去除组氨酸标签序列，本发明提供的方法可实现在巴斯德毕赤酵母中高效表达可溶性鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及一种优化的鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白表达序列及在巴斯德毕赤酵母中高效表达的方法，属于基因工程生物制药领域。
背景技术
轮状病毒感染小肠上皮细胞并产生肠毒素，造成细胞损伤，导致腹泻，是引起婴幼儿腹泻的主要病原体之一。轮状病毒的感染常导致婴幼儿脱水，严重时甚至危及生命。轮状病毒除感染人类外，也会感染动物，是造成幼年家畜的重要死亡病因之一。有研究表明鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin能有效的激活宿主小肠上皮细胞防御基因的表达，可作为免疫激活剂保护宿主免受轮状病毒病原体的感染，同时flagellin也可以诱导白介素18(IL-18)的表达，清除受感染的细胞。该项研究表明，flagellin是一种很有希望的广谱性抗肠道病毒药物[Benyue Zhang,Benoit Chassaing,Zhenda Shi,et al.Prevention andcure of rotavirus infection via TLR5/NLRC4–mediated production of IL-22 andIL-18.Science 2014；346:861-865]。
鉴于flagellin具有重要的实际应用价值，人们希望解决flagellin的来源问题。利用基因工程方法是解决蛋白类产品来源的一种有效方法。与大肠杆菌表达系统相比(大量表达的flagellin以不溶性的包涵体存在)，巴斯德毕赤酵母表达的flagellin以可溶性的形式分泌到胞外。然而由于来源基因密码子偏好的问题，使flagellin的产量偏低。解决这个问题的关键是开发一条适合巴斯德毕赤酵母表达的优化基因序列和选择适合的表达载体。
发明内容
本发明的目的在于提供一条在巴斯德毕赤酵母中高效表达的鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin的密码子优化序列。
本发明的另一目的是提供一种制备上述flagellin的方法。
为了实现本发明目的，本发明人对鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin基因进行序列优化，形成一条可在巴斯德毕赤酵母中高表达鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin的表达序列。优化后的基因序列如SEQ ID No.1所示。
为实现本发明的另一个目的，本发明人将鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin优化序列与巴斯德毕赤酵母表达载体连接，通过电转化将重组载体整合到巴斯德毕赤酵母的基因组中，通过甲醇诱导进行大量分泌表达。
所述的鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin的制备，具体包括以下步骤：
1)鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin巴斯德毕赤酵母表达载体的构建
利用人工合成基因序列技术将鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin优化基因酶切后与巴斯德毕赤酵母胞外表达载体连接，表达载体命名为pPIC9K-flagellin；
所述的巴斯德毕赤酵母胞外表达载体为pPIC9K；
2)表达鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin巴斯德毕赤酵母菌株的构建
用Sac I限制酶线性化重组载体pPIC9K-flagellin，并电转到巴斯德毕赤酵母GS115菌株中；利用MD平板筛选阳性克隆菌株；
3)鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin在巴斯德毕赤酵母菌株中的表达
将菌株GS115-flagellin在YPD平板中进行活化。从活化平板上挑取单菌落于BMGY液体培养基中进行菌体生长，生长一定量的菌体转移到BMMY诱导培养基中进行诱导表达。
在本发明中，我们通过对鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin表达序列进行优化，使得鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin在巴斯德毕赤酵母中能得到大量表达。本发明利用巴斯德毕赤酵母重组表达的鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin具有稳定、高产的优点。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
图1表达鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin载体示意图。
图2重组载体双酶切电泳鉴定图。泳道M为DNA分子量标准；泳道1为pPIC9K-flagellin重组载体SnaB I和EcoR I双酶切。
图3鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin优化基因在巴斯德毕赤酵母中诱导表达后Western blot分析图。泳道M为蛋白分子量标准；泳道1、2和3表示三株独立重组菌株表达结果。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
本发明的实施例中使用了以下菌株和质粒：
大肠杆菌TOP 10′(E.coli TOP 10′):用于基因克隆操作，购买于赛默飞世尔(Thermo Fisher Scientific)公司。
巴斯德毕赤酵母GS115：购买于赛默飞世尔(Thermo Fisher Scientific)公司。
pPIC9K表达质粒：购买于赛默飞世尔(Thermo Fisher Scientific)公司。
实施例一鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin基因的优化
根据公布的鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin蛋白氨基酸序列(登录号：P06179)进行基因序列优化设计。为了方便纯化，在flagellin蛋白氨基酸序列N端加上6×His标签，该标签使得产生的重组蛋白可用Ni柱进行亲和纯化。为了使最终得到的产物蛋白可以去除6×His标签，在6×His标签后加上TEV蛋白酶酶切位点。为了在巴斯德毕赤酵母中表达的flagellin蛋白不被N糖基化，对flagellin蛋白序列中6个潜在的N糖基化点序列(N-X-S/T，X为任意氨基酸)进行氨基酸替换，将N糖基化点序列中N替换成Q，最终要进行优化的鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin蛋白氨基酸序列如下：
上述序列中波浪下划线部分的6个氨基酸序列为6×His标签，直线划线部分的7个氨基酸序列(ENLYFQG)为TEV蛋白酶酶切位点。从第14个氨基酸开始为flagellin蛋白。
根据此前Schutter等发表的文章中巴斯德毕赤酵母密码子使用表进行序列优化[Kristof De Schutter,Yao-Cheng Lin,Petra Tiels et al.Genome sequence of therecombinant protein production host Pichia pastoris.Nature biotechnology,2009；27(6):561-568].优化步骤如下：首先，将所有的氨基酸序列用最优的密码子进行优化，产生一条优化序列，其次，对这条优化序列进行AT％含量检查，如果连续出现5个(含5个)以上的A或T或AT在一起的序列，则使用次优密码子进行替换最优密码子中AT含量高的密码子。例如：上述序列中第17、18氨基酸I-N，按最优密码子优化的碱基序列是ATT-AAT，为了避免连续的AT出现，选用密码子表中次优密码子进行替换，序列则变成ATC-AAC。最终得到鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin基因的优化序列(如SEQ ID No:1所示)。
实施例二鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin优化基因序列的合成与表达载体的构建
鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin基因的优化序列可送给任意基因合成公司进行序列合成并克隆到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K的SnaB I和EcoR I位点中,使得优化序列与载体上α-factor信号肽序列同在一个阅读框。本实施例鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin基因的优化序列合成和克隆到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中的工作由武汉金开瑞生物工程有限公司完成，获得质粒命名为pPIC9K-flagellin，载体示意图见附图1。重组质粒用SnaB I和EcoR I双酶切鉴定flagellin基因是否存在于构建的载体中，琼脂糖凝胶电泳检测结果如附图2所示，图中泳道M为DNA分子量标准；泳道1为pPIC9K-flagellin重组载体SnaB I和EcoR I双酶切。结果显示flagellin优化序列成功重组进所构载体中。
实施例三：鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin在巴斯德毕赤酵母中的表达
1、获得电转质粒
1)吸取1ul(浓度为50-1000ng/ul)的pPIC9K-flagellin质粒DNA加到感受态的大肠杆菌TOP 10′中，用无菌的枪头轻轻搅匀，冰浴20-40min，42℃热击60-90s，加入不含氨苄青霉素的LB液体培养基37℃220r/min培养0.5-1h，然后均匀的涂布到含有氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃培养过夜，获得转化子。
2)挑取一个平板上的单菌落，接种到有氨苄青霉素10ml LB液体培养基中，在37℃，220r/min的摇床中培养12-16h，按质粒提取通用方法提取质粒。
2、pPIC9K-flagellin质粒用Sal I使其线性化，线性化酶切条件按说明书进行，线性化后的质粒按通用方法进行纯化。
3、电转，使线性化的载体与巴斯德毕赤酵母菌株GS115的基因组整合，并在MD平板上筛选获得阳性转化子。具体操作和条件如下：
1)、制备巴斯德毕赤酵母GS115感受态的细胞:
①、将-80℃冻存的赤酵母酵母GS115宿主菌于YPD平板上活化，生长时间为48-60h；
②、挑取平板上的巴斯德毕赤酵母GS115单菌落接种于装有5mLYPD液体培养基的50mL试管中，28-30℃，220r/min培养16-24h；
③、取50-100μL培养的酵母菌液接种于装有50-100mLYPD培养基的250-500mL三角瓶中，28-30℃，220r/min培养至OD600为1.0-2.0；
④、将培养好的巴斯德毕赤酵母置于冰上5-10min，同时将50ml的灭菌离心管置于冰上5冷却。在4℃,1500-2500g离心5min，收集巴斯德毕赤酵母细胞，在冰上用40ml冰预冷的灭菌水悬浮细胞；
⑤、4℃,1500-2500g离心5min，收集巴斯德毕赤酵母细胞，在冰上用25ml冰预冷的灭菌水再次悬浮细胞；
⑥、4℃,1500-2500g离心5min，收集巴斯德毕赤酵母细胞，在冰上用30-40ml1mol/L的冰预冷的山梨醇悬浮细胞；
⑦、4℃,1500-2500g离心5min，收集巴斯德毕赤酵母细胞，在冰上用0.5-1ml1mol/L的冰预冷的山梨醇悬浮细胞，即成巴斯德毕赤酵母感受态细胞，该感受态细胞可以立即使用，也可储存-80℃冰箱中，但放在-80℃储存转化效率会大大降低。
2)、巴斯德毕赤酵母GS115的电转化:
①、取1-10μg线性化pPIC9K-flagellin质粒(体积不超过10μL)与80μL的巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞轻轻混匀，转移至预冷的0.2cm电转杯中，冰浴5-10min；
②、设置电转仪电压设为1.5kV，电击时间为45ms；
③、电击完毕后，将电转杯快速放到冰上，在无菌台中立即向电转杯中加入1mL冰冷的1mol/L山梨醇，用移液器轻轻吹打，将细胞充分悬浮；
④、吸取200-300μL细胞悬浮液直接均匀的涂布在MD平板上，在28-30℃恒温培养箱中培养，直至MD平板上会出现单菌落；
4、从选择培养基MD板上挑出单克隆的转化子，于5ml BMGY液体培养基中于摇床中培养24-36h(20-30℃，220-250rpm)，使其数量得到扩增。镜检是否染菌、并将BMGY液体培养基中培养的细胞于1500-2500g离心5min，收集菌体，用BMMY重悬菌体到OD600值约等于1，BMMY培养基中的菌体持续培养72-96h(28-20℃，220-250rpm)，每24h按培养体积的0.5-1％比例加入100％甲醇，诱导其表达。
5、诱导培养结束后，于4℃，10000rpm离心收集上清。取一小部分上清进行用western blot方法检测鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin表达情况。检测一抗用His抗体，操作方法按抗体说明书进行。检测结果见附图3，图中泳道M为蛋白分子量标准；泳道1、2和3表示三株独立重组菌株表达结果。结果显示所选取的三株重组菌株均能稳定表达flagellin蛋白。
Claims (6)
1.一条鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin编码基因的巴斯德毕赤酵母密码子优化序列，其核苷酸序列如SEQ ID：1所示。
2.一种含有权利要求1所述核苷酸的重组载体。
3.权利要求1所示的巴斯德毕赤酵母优化序列在工业化生产重组鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin的应用。
4.权利要求2所示的重组载体在工业化生产重组鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin的应用。
5.一种制备鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin的方法，包括：含有本发明所述优化基因序列的工程菌经诱导物诱导表达得到重组鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白flagellin蛋白。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的诱导物为甲醇。
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN103882050A (zh) * | 2014-01-02 | 2014-06-25 | 杭州璞题生物科技有限公司 | 鼠表皮生长因子在巴斯德毕赤酵母中的表达方法和纯化 |
| RU2015119607A (ru) * | 2015-05-25 | 2015-10-27 | Илья Владимирович Духовлинов | Гибридный белок, днк, генетическая конструкция, продуцент, вакцина на основе гибридного белка для профилактики и лечения туберкулеза (варианты) |
| WO2017021525A1 (en) * | 2015-08-06 | 2017-02-09 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) | Tools for multiprotein complex expression in pichia pastoris |
| CN108218965A (zh) * | 2016-12-22 | 2018-06-29 | 新疆农业大学 | 一种马流产沙门氏菌鞭毛蛋白FliC的制备方法和应用 |
-
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103882050A (zh) * | 2014-01-02 | 2014-06-25 | 杭州璞题生物科技有限公司 | 鼠表皮生长因子在巴斯德毕赤酵母中的表达方法和纯化 |
| RU2015119607A (ru) * | 2015-05-25 | 2015-10-27 | Илья Владимирович Духовлинов | Гибридный белок, днк, генетическая конструкция, продуцент, вакцина на основе гибридного белка для профилактики и лечения туберкулеза (варианты) |
| WO2017021525A1 (en) * | 2015-08-06 | 2017-02-09 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) | Tools for multiprotein complex expression in pichia pastoris |
| CN108218965A (zh) * | 2016-12-22 | 2018-06-29 | 新疆农业大学 | 一种马流产沙门氏菌鞭毛蛋白FliC的制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ADELE FANTONI等: "Improved yields of full-length functional human FGF1 can be achieved using the methylotrophic yeast Pichia pastoris" * |
| 陈明等: "鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FliC的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备" * |
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