CN111423435A - (1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶衍生物及其应用 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
本发明属于化学药物技术领域,具体涉及(1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶衍生物及其应用。
背景技术
肿瘤癌基因相关转录因子负责基本的转录机制以维持其致癌状态,但是目前仍很难以药物直接抑制该转录因子。然而,转录机制中包含各种酶的辅助因子,这些辅助因子可作为新的癌症治疗的一个靶点。化合物通过作用于这些辅助因子达到对癌细胞周期阻滞的作用,如肿瘤细胞有丝分裂G2/M期的阻滞,从而达到抗肿瘤的目的。另外,核受体是哺乳动物中含量最丰富的转录调节因子之一,它们在新陈代谢、性别决定与分化、生殖发育和稳态的维持等方面发挥着重要的功能。近年来,核受体家族在代谢性疾病领域受到广泛的关注,已有研究证明,它们与糖尿病、脂肪肝、癌症等疾病的发生发展密切相关。
发明内容
本发明的目的在于提供(1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶衍生物及其应用。
本发明的技术方案之一如下:
(1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶衍生物,其结构式为
其中,L为低级烷基链或烷基醚链,R为未取代的芳基、取代的芳基或环烷基。
上述(1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶衍生物在制备用于治疗和/或预防RARγ/EGFR/CDK9相关的疾病的药物中的应用,该疾病包括癌症。
上述(1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶衍生物具有明显抗癌活性,体外细胞毒实验表明该(1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶衍生物普遍对MCF7,HepG2,A549等多种癌细胞有很好的细胞毒活性,是靶向抑制RARγ的EGFR和CDK9小分子配体。
本发明的技术方案之二如下:
(1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶衍生物,其结构式为
其中,L为低级烷基链或烷基醚链,R为未取代的芳基、取代的芳基或环烷基,L’为具有碳原子和氧原子的连接链,R’为CRBN或者VHL的配体小分子(通过间接作用于E3连接酶启动泛素化降解途径)或R’为Biotin。
上述(1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶衍生物在制备用于治疗和/或预防RARγ/EGFR/CDK9相关的疾病的药物中的应用,该疾病包括癌症。
上述(1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶衍生物也具有明显抗癌活性,是靶向抑制RARγ的EGFR和CDK9小分子配体。
上述(1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶衍生物也可作为功能分子工具在探究化合物在细胞内的作用靶点及其潜在作用机制中的应用。
附图说明
图1为本发明实施例2的实验结果图,显示化合物XWJ-1601对肿瘤细胞克隆形成的干预作用。
图2为本发明实施例3的实验结果图,显示化合物XWJ-1601诱导肿瘤细胞凋亡的作用。
图3为本发明实施例4的实验结果图,显示化合物XWJ-1601对肿瘤细胞的G2/M周期阻滞作用。
图4为本发明实施例5的实验结果图,显示化合物XWJ-1601对哺乳动物(小鼠)的HepG2肝癌异种移植肿瘤的抑制作用。
图5为本发明实施例6的实验结果图,显示化合物XWJ-1601对核受体RARγ的影响。
图6为本发明实施例10的实验结果图,其中,(A)XWJ-1601-PO系列的化合物引起RARAγ的下调;(B)系列功能分子对HepG2细胞的IC50值;(C-D)XWJ-1601-PO-4和XWJ-1601都可以引起细胞凋亡;(E)XWJ-1601-PO-4和XWJ-1601都可以诱导HepG2细胞发生G2-M阻滞。
图7为本发明实施例11的实验结果图,其中,(A-B)XWJ-1601-Biotin钓蛋白质谱结果中具有竞争性抑制(Ratio<0.8)的376个蛋白的相互作用分析和基因富集分析;(C-D)XWJ-1601-PO-4引起下调(Ratio<0.8)的570个蛋白相互作用分析和基因富集分析;(E)XWJ-1601的潜在靶点分析。
图8为本发明实施例12的实验结果图之一,其中,(A)XWJ-1601和XWJ-1601-PO-4在时间梯度下对周期蛋白CDKs的调控作用;(B)&(C)XWJ-1601和XWJ-1601-PO-4在浓度梯度下对细胞周期蛋白CDKs、EGFR、NEK4、CDC20的调控作用。
图9为本发明实施例12的实验结果图之二,其中,(A)竞争抑制性的XWJ-1601-Biotin靶蛋白钓取蛋白胶(银染),55kd处条带明显抑制;(B)竞争抑制性的XWJ-1601-Biotin靶蛋白钓取Westrn Blot实验结果,XWJ-1601-Biotin钓取的蛋白EGFR、CDK9可被原小分子竞争抑制。
图10为本发明实施例1制得的两种互变异构体同时存在时化合物示例核磁谱图(为化合物XWJ-1616中间体谱图)。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
在本发明的一个优选实施方案中,所述L为-CH2-、-C2H4-、-CH2O-或-C2H4O-;所述R为取代苯基、吡啶基、CF3取代的吡啶基、吲哚-3-基,5-甲氧基吲哚-3-基或环烷基。进一步优选的,所述R为单取代苯基、二取代苯基或三取代苯基,其中的取代基包括Cl、F、CF3、羟基、氨基、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、CN、OC1-6烷基、OS1-6烷基、OC1-6卤代烷基、N(CH3)2和环丙基。
在本发明的一个优选实施方案中,所述L’为-OCO(CH2)2CO-、-CH2CO-、-(CH2)3CONH(CH2)3[O(CH2)2]3-CH2-、-CO(CH2)5-、-CO(CH2)7-、-NH(CH2)3(OC2H4)2O(CH2)3NHCO(CH2)2CO-、-CO(CH2)2CONH(CH2)3(OC2H4)2O(CH2)3NHCO(CH2)2CO-或(C2H4O)2C2H4NHCO(CH2)2CO-。
本发明的(1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶衍生物的合成方法包括将5-溴吡啶-2,3-二胺与取代羧酸在高温下缩合得到中间体(1),中间体(1)再与硼酸酯中间体(2)通过Suzuki偶联反应和脱Boc反应生成即得,具体反应路线如下:
实施例1:1-(5-(2-(4-氟苯基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺(XWJ-1601)的合成
(1)中间体6-溴-2-(4-氟苯基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶的合成:氮气保护下将4-氟苯丙酸(4.13g,25.0mmol)和2,3-二氨基-5-溴吡啶(1.87g,10.0mmol)的混合物在150℃熔融后搅拌2小时。将反应混合物用3N盐酸水溶液处理,然后通过加入氨水使其呈碱性,抽滤,滤饼洗涤后干燥,并通过硅胶柱色谱纯化(梯度洗脱方法,乙酸乙酯:甲醇=100:0~10:1,v/v),柱层析的产物用乙酸乙酯再重结晶,得到6-溴-2-(4-氟苯基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶,收率90%。1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):δ8.35(d,J=2.02Hz,1H),8.16(d,J=1.83Hz,1H),7.28-7.31(m,2H),7.08-7.12(m,2H),3.16-3.20(m,2H),3.12-3.16(m,2H);13C-NMR(151MHz,DMSO-d6):δ174.11,161.22(d,J=241.0Hz,1C),158.61(br s,1C),143.44,137.24(d,J=3.3Hz,1C),130.94-129.88(m,1C),115.46(d,J=22.0Hz,1C),112.71,32.40,31.17.
(2)中间体叔丁基(1-(5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧代硼戊环-2-基)吡啶-2-基)哌啶-4-基)氨基甲酸酯的合成:将2-氟-5-溴吡啶(1.75g,10mmol)与4-Boc氨基哌啶(2.00g,10mmol)溶于25mL的N,N-二甲基甲酰胺中,加入N,N-二异丙基乙胺(3.87g,30mmol),氮气置换反应体系后升温至120℃反应4小时。TLC检测原料反应完全后,停止加热,将反应液搅拌下导入100mL冰水中,有固体析出,抽滤,取滤饼,干燥后得白色固体叔丁基(1-(5-溴吡啶-2-基)哌啶-4-基)氨基甲酸酯3.37g,收率95%。1H-NMR(600MHz,CHLOROFORM-d):δ8.17(d,J=2.38Hz,1H),7.50(dd,J=2.48,9.08Hz,1H),6.55(d,J=8.99Hz,1H),4.14(br d,J=13.39Hz,2H),3.69(br s,1H),2.92-3.00(m,2H),2.02(br d,J=11.19Hz,2H),1.45(s,9H),1.35-1.43(m,2H).ESI-MS(+):m/z356.0,358.0[M+H]+。
(3)叔丁基(1-(5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧代硼戊环-2-基)吡啶-2-基)哌啶-4-基)氨基甲酸酯的合成:将上步所得叔丁基(1-(5-溴吡啶-2-基)哌啶-4-基)氨基甲酸酯(3.37g,9.5mmol)、连硼酸频呐醇酯(3.05g,12mmol)、1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.1mmol)、以及干燥的无水醋酸甲钾(0.93g,30mmol)加入25mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中,置换氮气,于氮气保护下升温至90℃反应3h,TLC检测叔丁基(1-(5-溴吡啶-2-基)哌啶-4-基)氨基甲酸酯反应完全后,将反应液搅拌下倒入100mL冰水中,用乙酸乙酯萃取三次(3*25mL),合并有机相,饱和氯化钠反萃后有机相加入无水硫酸钠干燥,过滤除去干燥剂,有机相浓缩后用硅胶拌样后,再用柱层析硅胶色谱分离纯化(等度洗脱方法,石油醚:乙酸乙酯=5:1,v/v),得白色粉末中间体叔丁基(1-(5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧代硼戊环-2-基)吡啶-2-基)哌啶-4-基)氨基甲酸酯,收率80%。1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):δ8.31(d,J=1.83,1H),7.66(dd,J=1.83,8.62Hz,1H),6.78(d,J=8.80Hz,1H),4.28(br d,J=13.20Hz,2H),3.47-3.56(m,1H),2.93(br t,J=11.65Hz,2H),1.76(br d,J=10.82Hz,2H),1.38(s,9H),1.26(s,12H),1.27(br t,J=11.65Hz,2H).ESI-MS(+):m/z 404.3[M+H]+.
(4)1-(5-(2-(4-氟苯基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺(XWJ-1601)的合成:取厚壁耐压瓶,称取中间体6-溴-2-(4-氟苯基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶(319.0mg,1mmol)与中间体叔丁基(1-(5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧代硼戊环-2-基)吡啶-2-基)哌啶-4-基)氨基甲酸酯(443.3mg,1.1mmol)以及碳酸钾(414mg,3mmol)和1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(30mg)溶于5mL溶剂(乙二醇二甲醚:水=4;1)中,氮气置换3次,升温至90℃反应过夜,TLC检测反应已平衡,停止反应,反应液冷至室温后抽滤,滤饼用少量乙二醇二甲醚洗涤后,干燥得粗品;粗品溶于二氯甲烷:甲醇(10:1,v/v)体系,加硅胶拌样,利用柱层析色谱分离纯化(等度洗脱方法,乙酸乙酯=1:1,v/v),得到化合物叔丁基(1-(5-(2-(4-氟苯基)-1H-咪唑[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-基)氨基甲酸酯,白色粉末,收率50%。1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):10.88(br.s.,1H),8.86(br.s.,1H),8.60(br.s.,1H),8.54(br.s.,1H),8.46(br.s.,1H),8.19(d,J=4.22Hz,1H),7.88(d,J=7.70Hz,1H),7.83(br.s.,1H),7.45(t,J=8.53Hz,1H),6.96(d,J=8.25Hz,1H),3.55(br.s.,4H),2.42(br.s.,4H),2.23(br.s.,3H).将得到的叔丁基(1-(5-(2-(4-氟苯基)-1H-咪唑[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-基)氨基甲酸酯溶于二氯甲烷:三氟乙酸(2:1,v/v)的体系中室温搅拌反应2h,减压蒸除二氯甲烷和三氟乙酸,将残留固体继续用二氯甲烷分散,搅拌下三乙胺处理至碱性(pH=8),有机相浓缩后加入硅胶拌样,用柱层析硅胶色谱分离纯化(梯度洗脱方法,二氯甲烷:甲醇:7M氨甲醇=100:10:0至二氯甲烷:甲醇:7M氨甲醇=100:9:1,v/v/v),得1-(5-(2-(4-氟苯基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺(XWJ-1601)。1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):δ8.51(br s,1H),8.50(d,J=2.4Hz,1H),8.06(br s,1H),7.93(dd,J=2.5,8.9Hz,1H),7.29(dd,J=5.7,8.4Hz,2H),7.10(t,J=8.8Hz,2H),7.02-6.98(m,1H),4.39(br d,J=13.4Hz,2H),3.29(br t,J=10.9Hz,2H),3.18-3.11(m,5H),2.95(br t,J=12.0Hz,2H),2.61(q,J=7.1Hz,2H),1.97-1.88(m,2H),1.47(dq,J=3.8,12.0Hz,2H);13C-NMR(151MHz,DMSO-d6):δ161.23(d,J=241.0Hz,1C),158.70(q,J=30.8Hz,1C),158.02,157.51(br s,1C),146.25,141.44,137.36(d,J=3.3Hz,1C),136.83,130.52(d,J=7.7Hz,1C),128.13,123.65,118.68,116.70,115.49(d,J=22.0Hz,1C),107.81,97.63,46.07,43.63,33.61,32.52,31.15,29.31,27.87.ESI-MS(+):m/z 417.2[M+H]+.
本发明所列举的其余化合物:1-(5-(2-(3-(三氟甲基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺(XWJ-1602)、1-(5-(2-(3-氟苯基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺(XWJ-1603)、1-(5-(2-(3-氯苯基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺(XWJ-1604)、1-(5-(2-(环己基甲基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺(XWJ-1605)、1-(5-(2-(3-甲基苯基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺(XWJ-1606)、1-(5-(2-(2-氟苯基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺(XWJ-1607)、1-(5-(2-(3,4-二氟苯基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺(XWJ-1608)、1-(5-(2-(4-氟苯基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺(XWJ-1609)、1-(5-(2-(2,3-二氟苯基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺(XWJ-1610)、1-(5-(2-(4-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺(XWJ-1611)、1-(5-(2-环己基-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺(XWJ-1612)、1-(5-(2-(3,5-二氟苯基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺(XWJ-1613)、1-(5-(2-(4-甲基苯基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺(XWJ-1614)、1-(5-(2-(3-氯-4-氟苯基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺(XWJ-1615)、1-(5-(2-(4-甲氧基苯基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺(XWJ-1616)、1-(5-(2-(4-(三氟甲基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺(XWJ-1617)、1-(5-(2-(4-氯苯基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺(XWJ-1618)、1-(5-(2-(2-(苯并[d][1,3]二氧环戊烷-5-基)乙基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺(XWJ-1619)、1-(5-(2-(3-甲氧基苯基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺(XWJ-1620)、1-(5-(2-(3,4,5-三氟苯基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺(XWJ-1621)、1-(5-(2-(3-吲哚基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺(XWJ-1622)、1-(5-(2-(4-氟苯基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺(XWJ-1623)与化合物XWJ-1601合成方法类似。
本发明所涉及化合物(1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶衍生物存在另一种互变异构体(3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶衍生物,一般情况下,两种互变异构体同时存在(如图10)。
以本实施例所得的XWJ-1601为例,其制备方法所制得的产物中也存在其互变异构体XWJ-1623(1-(5-(2-(4-氟苯基)-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺),结构式如下:
该互变异构体XWJ-1623的具体表征为:1H NMR(600MHz,DMSO-d6)8.51(br s,1H),8.48(d,J=2.02Hz,1H),7.80(d,J=2.57Hz,1H),1H NMR(600MHz,DMSO-d6)8.51(br s,1H),8.48(d,J=2.02Hz,1H),7.80(d,J=2.57Hz,1H),7.93(dd,J=2.5,8.9Hz,1H),7.29(dd,J=5.7,8.4Hz,2H),7.10(t,J=8.8Hz,2H),7.02-6.98(m,1H),4.39(br d,J=13.4Hz,2H),3.29(br t,J=10.9Hz,2H),3.18-3.11(m,5H),2.95(br t,J=12.0Hz,2H),2.61(q,J=7.1Hz,2H),1.97-1.88(m,2H),1.47(dq,J=3.8,12.0Hz,2H).
上述化合物1-(5-(2-(4-甲氧基苯基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶-2-基)哌啶-4-胺(XWJ-1616)的两种互变异构体同时存在时核磁谱图如图10所示
实施例2:肿瘤细胞的增值抑制活性的筛选
本实施例对本发明所涉及化合物用MTT法进行了化合物肿瘤增值抑制实验,首先,分别以1.0μM、20.0μM处理不同类型的肿瘤细胞株72h,发现化合物都表现出了较好的体外抗肿瘤活性(如下表所示)。再对化合物进一步进行IC50测试,发现大部分化合物对三种测试的肿瘤细胞表现出明显的增值抑制活性,化合物的IC50<20.0μM,其中XWJ-1601、XWJ-1616、XWJ-1618、XWJ-1619、XWJ-1622等5个化合物的IC50小于1.0μM。MTT实验操作:接种3000个细胞/孔接种于96孔板中,待细胞贴壁12h后,在肿瘤细胞加入10%血清培养基溶解的不同浓度化合物再培养72h后,每孔加入20μL的MTT试剂,培养箱中孵育3h,于490nm测吸光度。
化合物XWJ-1601在肿瘤细胞HepG2中又进行了克隆形成实验:接种500个细胞于六孔板中,XWJ-1601的加药浓度分别为50.0nM和100.0nM,每隔三天换一次完全培养基,培养12天后置于显微镜中观察,发现对照组细胞已形成单克隆,使用0.1%的结晶紫染色液对细胞团进行染色30min,发现XWJ-1601在100.0nM时具有显著地细胞增殖抑制作用,结果如图1所示。
实施例3:诱导肿瘤细胞凋亡实验
本发明所涉及化合物对细胞凋亡的诱导作用:对本发明涉及化合物在HepG2细胞中进行了细胞的凋亡实验,发现小分子XWJ-1601在0.5μM作用24h的情况下,细胞有很明显的PARP切割,且以浓度梯度诱导抗凋亡蛋白BCl2的下调;同时基于Annexin V-FITC/PI双染应用流式细胞术来检测细胞凋亡,加药浓度依次为0.05μM、0.25μM、0.5μM、1μM,10%血清加药时间为24h,结果如图2所示,XWJ-1601可以在以浓度依赖性诱导细胞发生早期和晚期凋亡。
实施例4:化合物对肿瘤细胞周期阻滞的影响
本实施例通过细胞流式技术检测本发明涉及化合物处理过后细胞周期的变化,结果如图3所示,发现本发明所涉及化合物XWJ-1601能够引起HepG2细胞周期阻滞在G2/M期,降低细胞S期分布,说明XWJ-1601可以通过使细胞周期阻滞于G2/M期发挥抑制肿瘤的效果。
实施例5:化合物对裸鼠HepG2肝癌异种移植肿瘤的作用
建立HepG2 Balb/c 5-7周龄雌性裸鼠异种移植荷瘤模型后,XWJ-1601盐酸盐用含DMSO-Tween 80(10/0.1%)的D5W溶液溶解,配成2.5mg/mL的XWJ-1601溶液,按小鼠体重给药(200μL/20g),即25mg/kg的给药剂量,给药方式为腹腔注射。设空白对照(n=6)、XWJ-1601(每两天给药)组(n=6),XWJ-1601(每天给药)组(n=6),连续给药两周,实验结果如图4所示,与媒介物处理的对照相比,XWJ-1601治疗显着降低肿瘤负荷,与载体治疗组相比,在药物治疗组中从第3天到实验结束时观察到肿瘤体积显着减少(p<0.05)。测量第13天每只小鼠的肿瘤体积、肿瘤重量,显示出显著的降低。说明XWJ-1601具有良好的耐受性,而且不会对携带HepG2肝癌异种移植肿瘤的小鼠的体重产生负面影响。
实施例6:化合物对核受体RARγ的调控作用
对本发明涉及化合物通过Western-blot实验检测了核受体RARγ在加药处理后的表达情况,发现大部分的本发明涉及的化合物对测试肿瘤细胞中RARγ的表达具有抑制作用。图5显示了化合物XWJ-1601以时间/浓度依赖性的方式下调RARγ。
上述各化合物的类型及MS数据如下表所示:
实施例7:上表中各化合物(PROTACs、BAS系统功能分子)的重要中间体合成
2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-fluoroisoindoline-1,3-dione向20ml冰醋酸中依次加入4-氟异苯并呋喃-1,3-二酮(1.66g,10mmol),3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(1.64g,10mmol),醋酸钠(2.98g,30mmol);将所得混合物加热至120℃,反应12小时,TLC检测反应已结束,停止反应。反应液冷却至室温后,抽滤,取滤饼,滤饼用水洗涤后干燥,再用硅胶柱层析分离(等度洗脱,洗脱剂为DCM:MeOH=20:1,v/v)纯化残余物,得到白色固体2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-fluoroisoindoline-1,3-dione 2.3g,收率83%。1H-NMR(600MHz,METHANOL-d4):δ7.82(dt,J=4.31,7.84Hz,1H),7.73(d,J=7.34Hz,1H),7.47(t,J=8.62Hz,1H),5.00-5.04(m,1H),2.77-2.91(m,3H),2.15-2.19(m,1H);13C-NMR(151MHz,METHANOL-d4):δ172.3,168.8,166.4,166.3,164.2,158.6,156.9,137.3,137.3,133.7,122.9,122.8,120.0,120.0,117.5,117.4,49.4,31.3,22.4;ESI-MS(-):m/z 239.1[M-H]-
tert-butyl(3-(2-(2-(3-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)amino)propoxy)ethoxy)ethoxy)propyl)carbamate依次将2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-fluoroisoindoline-1,3-dione(138mg,0.5mmol),tert-butyl(3-(2-(2-(3-aminopropoxy)ethoxy)ethoxy)propyl)carbamate(160mg,0.5mmol),N,N-二异丙基乙胺(0.26mL,1.5mmol)加入5mL N,N-二甲基甲酰胺中,氮气保护下,搅拌加热至90℃,反应2小时,TLC检测反应已结束,停止反应。冷却至室温后,反应液倒入10mL冰水中,用乙酸乙酯萃取三次(50mL×3)后,合并有机相,减压浓缩,浓缩残渣用硅胶柱层析分离(等度洗脱,洗脱剂为DCM:MeOH=20:1,v/v),得到黄绿色固体tert-butyl(3-(2-(2-(3-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)amino)propoxy)ethoxy)ethoxy)propyl)carbamate,收率70%。1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):δ7.75(br t,J=5.50Hz,1H),6.76(br t,J=5.14Hz,1H),6.42(s,1H),6.36(s,1H),4.31(dd,J=5.14,7.52Hz,1H),4.13(dt,J=2.29,4.91Hz,1H),3.51(dd,J=2.48,4.86Hz,4H),3.45-3.48(m,4H),3.38(q,J=6.42Hz,4H),3.04-3.13(m,3H),2.96(q,J=6.72Hz,2H),2.82(dd,J=5.14,12.47Hz,1H),2.58(d,J=12.29Hz,1H),2.05(t,J=7.43Hz,2H),1.55-1.64(m,5H),1.44-1.55(m,3H),1.37(s,9H),1.30(ddd,J=3.21,6.14,9.35Hz,2H);13C-NMR(151MHz,METHANOL-d4):δ176.3,174.0,164.2,156.6,79.2,70.4,70.4,70.0,70.0,69.4,69.2,61.9,60.1,55.6,55.5,40.3,38.0,37.2,35.8,33.6,29.4,28.8,28.4,28.3,28.2,28.1,25.5,24.6.ESI-MS(+):m/z 577.3[M+H]+.
4-((3-(2-(2-(3-aminopropoxy)ethoxy)ethoxy)propyl)amino)-2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)iso indoline-1,3-dione将tert-butyl(3-(2-(2-(3-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)amino)propoxy)ethoxy)ethoxy)propyl)carbamate(0.58g,1mmol)加入10mL含10%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中,室温搅拌2小时,减压浓缩,固体残余物中加入10mL的三乙胺二氯甲烷溶液溶解并搅拌10分钟,减压浓缩,固体残余物用硅胶柱纯化(梯度洗脱方法,二氯甲烷:甲醇:7M氨甲醇=100:10:0至二氯甲烷:甲醇:7M氨甲醇=100:9:1,v/v/v),得黄色固体4-((3-(2-(2-(3-aminopropoxy)ethoxy)ethoxy)propyl)amino)-2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)isoindol ine-1,3-dione,收率60%。1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):δ11.10(s,1H),7.66-7.80(m,3H),7.59(dd,J=7.15,8.44Hz,1H),7.11(d,J=8.62Hz,1H),7.03(d,J=6.97Hz,1H),6.67(t,J=5.87Hz,1H),5.05(dd,J=5.50,12.84Hz,1H),3.52-3.57(m,4H),3.48-3.51(m,6H),3.46(t,J=6.05Hz,2H),3.36-3.39(m,2H),2.81-2.93(m,3H),2.55-2.63(m,1H),1.96-2.09(m,1H),1.81(quin,J=6.28Hz,2H),1.73-1.79(m,2H),1.22-1.28(m,2H);13C-NMR(151MHz,DMSO-d6):δ173.3,170.6,169.3,167.8,158.7,158.5,158.3,146.9,136.8,132.7,118.8,117.6,116.8,110.9,109.5,70.2,70.1,69.9,68.7,67.8,54.0,49.0,42.3,40.5,37.3,31.4,29.3,27.6,22.6,18.5,17.2,12.9,0.6.ESI-MS(+):m/z 478.2[M+H]+.
N-(3-(2-(2-(3-aminopropoxy)ethoxy)ethoxy)propyl)-5-((3aS,4R,6aR)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanamide依次向20mLDMF中加入bioton(5-((3aS,4R,6aR)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanoicacid(1.22g,50mmol)、HOBT、EDCI,室温搅拌20分钟后,加入tert-butyl(3-(2-(2-(3-aminopropoxy)ethoxy)ethoxy)propyl)carbamate(160mg,0.5mmol),室温搅拌反应24h,反应结束后,反应液加入40mL冰水中,用二氯甲烷萃取三次(30mL×3),合并有机相,减压浓缩,所得残渣用硅胶柱分离纯化(等度洗脱,洗脱剂为DCM:MeOH=20:1,v/v),得白色固体。向该固体中加入10mL含10%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中,室温搅拌2小时,减压浓缩,固体残余物中加入10mL的三乙胺二氯甲烷溶液溶解并搅拌10分钟,减压浓缩,固体残余物用硅胶柱纯化(等度洗脱,洗脱剂为DCM:MeOH=10:1,v/v),得类白色固体65.3mg,收率50%。1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):δ7.80(br t,J=5.50Hz,1H),6.43-6.52(m,1H),6.35-6.41(m,1H),4.29-4.33(m,2H),4.13(dt,J=1.93,4.72Hz,1H),3.50-3.54(m,2H),3.43-3.50(m,3H),3.39(t,J=6.33Hz,1H),3.03-3.14(m,2H),2.79-2.85(m,1H),2.76(br t,J=7.15Hz,1H),2.58(d,J=12.47Hz,1H),2.11(br t,J=7.34Hz,2H),2.05(t,J=7.43Hz,1H),1.73(quin,J=6.60Hz,1H),1.61(td,J=6.56,13.30Hz,2H),1.40-1.56(m,4H),1.24-1.38(m,3H);13C-NMR(151MHz,DMSO-d6):δ172.4,163.2,70.1,68.3,61.5,59.7,55.9,55.9,37.4,36.2,35.7,35.3,29.9,29.1,28.7,28.7,28.5,28.5,25.8,25.5.ESI-MS(+):m/z 447.2[M+H]+.
(2R,4S)-1-((S)-2-amino-3,3-dimethylbutanoyl)-4-hydroxy-N-(4-(4-methylthiazol-5-yl)benzyl)p yrrolidine-2-carboxamide的制备:参照文献(Galdeano,C.;Gadd,M.S.;Soares,P.;Scaffidi,S.;Van Molle,I.;Birced,I.;Hewitt,S.;Dias,D.M.;Ciulli,A.J.J.o.m.c.,Structure-guided design and optimization of smallmolecules targeting the protein–protein interaction between the von Hippel–Lindau(VHL)E3 ubiquitin ligase and the hypoxia inducible factor(HIF)alphasubunit with in vitro nanomolar affinities.2014,57(20),8657-8663.)报道的步骤进行合成。1H NMR(600MHz,METHANOL-d4)δ9.93(s,1H),7.51(br d,J=7.70Hz,2H),7.37-7.42(m,J=7.70Hz,2H),4.78(br s,1H),4.55(br s,1H),4.05(br d,J=11.19Hz,2H),3.63-3.69(m,1H),2.70(s,1H),2.63(s,3H),2.29-2.43(m,1H),2.12(ddd,J=4.03,9.67,13.25Hz,1H),1.15(br s,9H);13C NMR(151MHz,METHANOL-d4)δ172.2,167.5,163.2,154.8,141.1,136.3,129.1,128.7,128.4,128.3,126.4,70.2,59.6,59.4,57.1,57.1,42.6,37.4,36.6,34.6,31.4,26.1,18.3,16.9,12.8.ESI-MS(+):m/z431.2[M+H]+.
实施例8:XWJ-1601的PROTACs功能分子XWJ-1601-PO-4的制备
本实施例的反应路线如下:
8-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)amino)-N-(1-(5-(2-(4-fluorophen ethyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-6-yl)pyridin-2-yl)piperidin-4-yl)octanamide(XWJ-1601-Po-4)的制备:将10mmol的4-fluoroisobenzofuran-1,3-dione和11mmol的3-aminopiperidine-2,6-dione以及30mmol的醋酸钠于20mL的冰醋酸中95℃反应6h,得2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-fluoroisoindoline-1,3-dione;所得的2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-fluoroisoindoline-1,3-dione于8-氨基辛酸于DMSO和3倍当量的DIEA缩合得中间体8-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)amino)octanoic acid;最后,中间体8-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)amino)octanoic acid与XWJ-1601缩合反应得XWJ-1601-Po-4。1H-NMR(600MHz,METHANOL-d4):δ8.50(br s,1H),8.35(d,J=2.20Hz,1H),8.09(s,1H),7.97(dd,J=1.93,9.08Hz,1H),7.41-7.45(m,1H),7.18-7.23(m,2H),7.07(d,J=6.97Hz,1H),7.04(br d,J=9.17Hz,1H),6.95-6.99(m,2H),6.93(d,J=8.62Hz,1H),4.90-4.97(m,1H),3.98-4.06(m,1H),3.25-3.31(m,4H),3.17-3.25(m,4H),2.75-2.87(m,3H),2.20(t,J=7.61Hz,2H),2.11-2.16(m,1H),2.03-2.09(m,2H),1.61-1.71(m,4H),1.53-1.61(m,2H),1.34-1.47(m,6H),1.27(brs,2H),0.83-0.91(m,1H);13C-NMR(151MHz,METHANOL-d4):δ174.54,173.14,170.10,170.03,168.61,162.15(d,J=244.3Hz,1C),158.43,149.94(br s,1C),147.47,142.13,139.90,136.71,136.11(d,J=3.3Hz,1C),132.94,130.27(d,J=8.8Hz,2C),128.51,124.00,121.87(br s,1C),117.33,115.84(d,J=20.9Hz,2C),111.74,110.39,110.14,46.76,45.73,42.97,36.81,33.49,31.88,31.65,31.59,30.15,29.64,29.57,29.53,27.27,26.25,23.28.ESI-MS(+):m/z 814.4[M+H]+.
实施例9:XWJ-1601的BAS系统功能分子XWJ-1601-Biotin的制备
本实施例的反应路线如下:
N1-(1-(5-(2-(4-fluorophenethyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridin-6-yl)pyridin-2-yl)piperidin-4-yl)-N4-(15-oxo-19-((3aS,4R,6aR)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)-4,7,10-trioxa-14-azanonadecyl)succinamide(XWJ-1601-Bio)的制备:化合物XWJ-1601-Bio合成路线见上图。1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):δ8.51(br d,J=5.69Hz,1H),8.48(d,J=2.57Hz,1H),8.06(br s,1H),7.90(dd,J=2.48,8.89Hz,1H),7.80-7.85(m,2H),7.77(br t,J=5.50Hz,1H),7.26-7.35(m,2H),7.06-7.13(m,2H),6.96(d,J=8.99Hz,1H),6.44(s,1H),6.38(s,1H),4.29-4.33(m,1H),4.22-4.29(m,2H),4.11-4.15(m,1H),3.78-3.88(m,1H),3.50-3.55(m,3H),3.45-3.49(m,3H),3.37-3.40(m,3H),3.15(s,3H),3.07-3.09(m,2H),3.05-3.07(m,2H),2.98-3.04(m,2H),2.82(dd,J=5.04,12.38Hz,1H),2.74(s,1H),2.58(d,J=12.29Hz,1H),2.30(s,3H),2.05(t,J=7.43Hz,1H),1.76-1.82(m,2H),1.57-1.65(m,4H),1.43-1.56(m,3H),1.33-1.41(m,2H),1.25-1.33(m,2H),1.23(br s,1H),0.99(t,J=7.15Hz,1H);13C-NMR(151MHz,DMSO-d6):δ172.39,171.70,171.05,163.19,161.22(d,J=242.1Hz,1C),158.88,158.29,157.44(brs,1C),146.21,141.41,137.37(d,J=3.3Hz,1C),136.68,130.52(d,J=8.8Hz,2C),128.23,123.21,115.50(d,J=20.9Hz,2C),107.60,70.23,70.00,68.57,68.53,61.52,59.66,55.90,54.97,46.50,44.26,42.54,40.31,36.64,36.24,36.18,35.67,34.60,32.52,31.36,31.32(br t,J=19.3Hz,1C),29.87,29.84,28.69,28.51,25.82,25.77,16.10.ESI-MS(+):m/z945.5[M+H]+.
实施例10:XWJ-1601的PROTACs、BAS系统功能分子的生物活性评估
本实施例对XWJ-1601的PROTACs、BAS系统功能分子进行活性评估,首先在HepG2细胞中检测其抗肿瘤活性,设置浓度梯度为20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.32μM、0.16μM、0.08μM,含有10%血清的完全培养基加药作用72h,72h后每孔加入20μL的MTT试剂,培养箱内放置3.5h后于490nm处测得各孔的OD值,用GraphPad Prism得到其IC50值(见下表);然后,本实施例对这一系列功能分子在蛋白水平上进行了RARγ的检测,在含有10%血清的完全培养基加药作用24h,设置加药浓度为5μM、0.5μM、0.1μM,裂解细胞,进行WesternBlot,检测RARγ表达(见图6(A))。结果显示XWJ-1601-PO-4较其他几个功能分子有更好的RARγ下调能力和细胞毒活性,基于流式细胞术,发现XWJ-1601-PO-4和XWJ-1601在同等作用条件下都能引起细胞周期的G2-M期阻滞和细胞凋亡,且最佳作用时间在0.5μM、12h(见图6(B)、(C)、(D)、(E))。
应用XWJ-1601-PO-4作为PROTAC的功能分子,XWJ-1601-Biotin作为体外钓蛋白的功能分子,结合定量同位素标记技术(SILAC),在全细胞裂解液中首先在重标细胞裂解液中加入100μM的XWJ-1601作为竞争组,后在重标轻标中都加入终浓度为10μM的功能分子,孵育过夜后用键合Avidin的琼脂糖珠子钓取蛋白,分别用250mM裂解液进行洗涤,将两组1:1混合后以备质谱检测分析。
实施例11:基于高分辨质谱的PROTACs和BAS系统技术对化合物XWJ-1601抗肿瘤作用机制和靶点的研究
基于高分辨质谱的BAS系统技术(BAS-MS):1)收集重标和轻标的HepG2细胞全裂解液,重标细胞为竞争抑制组,轻标细胞为实验组,XWJ-1601-Biotin的浓度为10μM,竞争抑制组的XWJ-1601浓度为100μM,进行BAS靶点调取实验并对调取的蛋白做质谱鉴定;2)分析质谱数据,选择XWJ-1601-Biotin质谱结果中被竞争性抑制(Ratio<0.8)的蛋白作为钓蛋白这一策略的可信结果,摒除没有具体比值的蛋白,最终得到个376蛋白,其中与G2-M期阻滞相关的的蛋白有8个,分别为HNRNPC、KHDRBS1、YWHAG、ARID1A、YWHAQ、KIF20A、EGFR和SRSF11。通过String网站在高可信度下对这些蛋白进行蛋白相互作用分析,基于Metascape网站对基因进行富集分析(见图7,(A)&(B)),可发现相关蛋白基因主要与mRNA加工、RNA定位、核小体的形成以及细胞周期等过程相关。
基于高分辨质谱的PROTACs(PROTACs-MS)技术:1)对照组(重标)和实验组(轻标)的细胞分别用DMSO、0.5μM XWJ-1601(或XWJ-1601-PO-4)进行8h的处理,然后细胞1:1混合,进行细胞总蛋白的预处理后进行质谱检测。2)分析质谱数据:其中以XWJ-1601-PO-4这个功能分子诱导的蛋白降解策略中,若蛋白Ratio<0.8,这些蛋白可能是化合物小分子的靶点,也可能是靶点的下游信号通路,所以我们结合原分子作用后蛋白的比值,选择XWJ-1601-PO-4/XWJ-1601的比值<0.8的蛋白作为可信结果,筛选得到570个蛋白,其中与细胞G2-M期阻滞相关的蛋白有15个,分别为EGFR、NES、CTNNB1、MTA3、USP39、MAPK3、MEF2D、CDK7、BMI1、KLF4、RELB、CDC20、BMPR2、CDKN2A和ALMS1;我们对这570个蛋白进行蛋白相互作用分析和基因富集分析(见图7,(C)&(D)),这570个基因的功能性分析主要集中在线粒体组织、线粒体基因表达以及磷脂代谢过程等相关。
针对BAS-MS技术:因为BAS异双功能分子虽然在筛选中保证了与小分子有相同的表型功能,但应BAS异双功能分子结构和原小分子仍具有一定的差异,分子的靶向性或靶向效率有一定的变化,所以该技术得到的结果中可能漏筛靶点(假阴性)或出现假阳性;另外,由于丰度较高的蛋白会隐藏丰度较低的蛋白,从而使低丰度蛋白调取效率较差或漏筛,MS检测结果不全或产生假阴/阳性。针对PROTAC技术:虽然PROTACs异双功能分子在筛选中保证了与小分子有相同的表型功能,但应PROTACs异双功能分子结构和原小分子仍具有一定的差异,分子的靶向性或靶向效率有一定的变化,所以原分子的个别靶点不满足XWJ-1601-PO-4/XWJ-1601的比值可能不满足<0.8。综上,基于上述的PROTACs-MS及BAS-MS技术得到的结果,并根据这类分子G2-M周期阻滞中筛选出候选的潜在靶点(见图7(E))。其中,EGFR在两个技术中都检测到,CDK1、CDK9、CDK12在BAS-MS技术中检测到,CDK4、CDC20在PROTACs-MS技术中检测到。这些候选靶点在实施例12继续进行验证。
实施例12:化合物XWJ-1601潜在靶点的验证
针对PROTACs-MS和BAS-MS筛选到的靶点,本实施例进行了靶点验证:1)XWJ-1601-PO-4和XWJ-1601对肿瘤细胞HepG2中的CDK1、CDK2、CDK4都没有明显调控作用(图8(A));0.5μMXWJ-1601-PO-4对肿瘤细胞HepG2作用8h后诱导CDK6降解,但XWJ-1601对CDK6的表达没有明显调控作用(图8(B));1.0μMXWJ-1601-PO-4对肿瘤细胞HepG2作用8h后可诱导CDK12明显下调,但XWJ-1601对CDK6的表达没有明显调控作用(图8(B));对于CDK9蛋白,0.5μMXWJ-1601对肿瘤细胞HepG2作用8h后可以诱导其产生下调,但是0.5μMXWJ-1601-PO-4作用12h才产生下调作用(图8(A));对于蛋白EGFR和NEK4,XWJ-1601-PO-4作用浓度在5μM时才能够产生下调作用(图8(C));1.0μM和5.0μM XWJ-1601可上调CDC20,但1.0μM和5.0μM的XWJ-1601-PO-4对CDC20具有降解作用(图8(C)),这些结果与质谱检测的CDC20在原分子作用下上调,但XWJ-1601-PO-4作用下下调的结果是一致的。根据上述结果,可以推测蛋白CDK6、CDK9、EGFR、NEK4、CDC20与化合物XWJ-1601的抗肿瘤作用具有一定相关性,可能是XWJ-1601的潜在靶点或其下游蛋白。2)为了验证上述蛋白是否为XWJ-1601的直接结合靶点,对竞争抑制的XWJ-1601-Biotin靶蛋白钓取样品进行跑胶。首先通过银染,发现55kd处的条带由于竞争而变淡,利用MS检测发现55kd处的条带包含蛋白CDK9以及相应作用复合物Cyclin T1、MEPCE(图9(A),这进一步验证CDK9可能为其靶点;另外进一步利用抗体印证的XWJ-1601-Biotin钓取靶蛋白的实验结果,实验发现XWJ-1601-Biotin可调取RARg、CDC20、CDK9、EGFR、NEK4,其中在原分子的竞争下,EGFR、CDK9被显著竞争抑制(图9(B))。最后激酶活性测试发现XWJ-1601的IC50=6.8μM.
综上,XWJ-1601是作为靶向抑制RARγ的EGFR和CDK9小分子配体,抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞的G2/M周期阻滞和凋亡,产生抗肿瘤活性。
以上所述,仅为本发明的较佳实施例而已,故不能依此限定本发明实施的范围,即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰,皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (11)
2.如权利要求1所述的(1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶衍生物,其特征在于:所述L为-CH2-、-C2H4-、-CH2O-或-C2H4O-;所述R为取代苯基、吡啶基、CF3取代的吡啶基、吲哚-3-基,5-甲氧基吲哚-3-基或环烷基。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于:所述R为单取代苯基、二取代苯基或三取代苯基,其中的取代基包括Cl、F、CF3、羟基、氨基、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、CN、OC1-6烷基、OS1-6烷基、OC1-6卤代烷基、N(CH3)2和环丙基。
4.权利要求1至3中任一权利要求所述的(1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶衍生物在制备用于治疗和/或预防RARγ/EGFR/CDK9相关的疾病的药物中的应用。
6.如权利要求5所述的(1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶衍生物,其特征在于:所述L为-CH2-、-C2H4-、-CH2O-或-C2H4O-;所述R为取代苯基、吡啶基、CF3取代的吡啶基、吲哚-3-基,5-甲氧基吲哚-3-基或环烷基。
7.如权利要求6所述的(1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶衍生物,其特征在于:所述R为单取代苯基、二取代苯基或三取代苯基,其中的取代基包括Cl、F、CF3、羟基、氨基、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、CN、OC1-6烷基、OS1-6烷基、OC1-6卤代烷基、N(CH3)2和环丙基。
8.如权利要求5所述的(1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶衍生物,其特征在于:所述L’为-OCO(CH2)2CO-、-CH2CO-、-(CH2)3CONH(CH2)3[O(CH2)2]3-CH2-、-CO(CH2)5-、-CO(CH2)7-、-NH(CH2)3(OC2H4)2O(CH2)3NHCO(CH2)2CO-、-CO(CH2)2CONH(CH2)3(OC2H4)2O(CH2)3NHCO(CH2)2CO-或(C2H4O)2C2H4NHCO(CH2)2CO-。
10.权利要求5至9中任一权利要求所述的(1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶衍生物在制备用于治疗和/或预防RARγ/EGFR/CDK9相关的疾病的药物中的应用。
11.权利要求5至9中任一权利要求所述的(1H-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-基)吡啶衍生物作为功能分子工具在探究化合物在细胞内的作用靶点及其潜在作用机制中的应用。
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