CN111420047B - 天然抗菌肽qha在制备免疫佐剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种天然抗菌肽QHA在制备免疫佐剂中的应用，免疫佐剂用于提高抗体的免疫滴度。另外，QHA与弗氏佐剂联用具有协同效应。本发明公开了天然抗菌肽QHA的新用途，其可以用于制备提高抗体的免疫滴度的免疫佐剂。QHA作为提高抗体的免疫滴度的免疫佐剂在制备抗体、疫苗、免疫治疗药物、肿瘤疫苗或免疫激活剂等领域具有广泛的应用前景。

Description

天然抗菌肽QHA在制备免疫佐剂中的应用
技术领域
本发明涉及免疫佐剂，尤其涉及一种天然抗菌肽QHA在制备免疫佐剂中的应用。
背景技术
免疫佐剂简称佐剂，即非特异性免疫增生剂，指同抗原一起或预先注入机体内能增强机体对抗原的免疫应答能力或改变免疫应答类型的辅助物质。佐剂可以具有免疫原性，也可无免疫原性。佐剂的免疫生物学作用包括增强免疫原性、增强抗体的滴度、改变抗体产生的类型、引起或增强迟发超敏反应等。由于免疫佐剂具有增强免疫应答的作用，故其应用广泛。其用途主要包括：①作为非特异性免疫增强剂，用于抗感染和抗肿瘤的辅助治疗；②增强特异性免疫应答，用于预防接种和制备动物抗血清等。理想的免疫佐剂应具有以下特点：对于特定的动物，要具有较小的副作用；佐剂作用要持久稳定；生产成本要尽量低；产生的免疫应答反应要适当，最好能够诱导机体细胞或体液免疫的强度要能达到保护要求等。研发高效低毒，能够提高机体免疫水平、细胞因子分泌和免疫记忆的新型免疫佐剂是目前研究的热点之一。
抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是多细胞生物体内一类由基因编码的天然小分子多肽，具有直接的杀伤微生物的活性。此外，部分抗菌肽还具有调节宿主免疫反应的作用。目前报道了多种可制备免疫佐剂的抗菌肽，如CN103908668A、CN 107446019A等。但是不同的抗菌肽的序列不同，其调节宿主免疫反应的原理也不尽相同，不同的抗菌肽作为佐剂时起到的免疫生物学作用也不能一概而论。
CN104497119A公开了一种天然抗菌肽QHA及其在制备抗菌药物、抑制细菌生长药物、防腐剂、动物饲料或化妆品前体中的应用，开发该抗菌肽的新用途可以拓展该抗菌肽的应用领域。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种天然抗菌肽QHA在制备免疫佐剂中的应用，本发明公开了天然抗菌肽QHA的新用途，其可以用于制备提高抗体的免疫滴度的免疫佐剂。
本发明的第一个目的是公开天然抗菌肽QHA在制备免疫佐剂中的应用，免疫佐剂用于提高抗体的免疫滴度。
进一步地，免疫佐剂用于制备抗体、疫苗、免疫治疗药物或免疫激活剂。
进一步地，疫苗包括肿瘤疫苗。
进一步地，天然抗菌肽QHA的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
进一步地，天然抗菌肽QHA的剂量为1-10μg/g。
本发明的第二个目的是公开天然抗菌肽QHA和弗氏佐剂在制备免疫佐剂中的应用，免疫佐剂用于提高抗体的免疫滴度。
进一步地，天然抗菌肽QHA和弗氏佐剂的体积比为1-10:1。
进一步地，弗氏佐剂为弗氏完全佐剂和/或弗氏不完全佐剂。
进一步地，免疫佐剂用于制备抗体、疫苗、免疫治疗药物或免疫激活剂。
进一步地，疫苗包括肿瘤疫苗。
进一步地，天然抗菌肽QHA的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
进一步地，天然抗菌肽QHA的剂量为1-10μg/g。
本发明的上述天然抗菌肽QHA来源于爬行类动物青环海蛇。可采用化学合成法合成天然抗菌肽QHA。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明公开了天然抗菌肽QHA在制备提高抗体的免疫滴度的免疫佐剂中的应用，将其作为免疫佐剂，能够增强动物对抗原刺激的反应性，提高所产生抗体的滴度，拓展了QHA的应用领域。
本发明还公开了天然抗菌肽QHA和弗氏佐剂在制备提高抗体的免疫滴度的免疫佐剂中的应用，天然抗菌肽QHA和弗氏佐剂联用具有协同效应，相对于单独使用天然抗菌肽QHA的效果更佳。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
图1是实施例2的免疫规程图；
图2是实施例2中不同实验组的抗体滴度测试结果；
图3是实施例3的免疫规程图；
图4是实施例3中不同实验组的抗体滴度测试结果。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中，所使用的小鼠的体重约为20g左右。
实施例1QHA的制备
(1)用自动多肽合成仪(433A,Applied Biosystems)合成来源于爬行类动物青环海蛇QHA的全序列(SEQ ID No.1所示)，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。
(2)分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)。
(3)纯化的QHA用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
本发明的天然抗菌肽QHA的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。其由30个氨基酸组成，分子量为3628.5Da，等电点为12.61，其中所有氨基酸均为L-型。
实施例2QHA作为免疫佐剂对小鼠抗体产生的影响检测
实验分为抗原组，抗原/QHA组和空白组(注射相同体积的PBS)，每组3只小鼠。
分别将SARS-CoV-2新冠病毒S1蛋白抗原(苏州思格生物提供)和抗菌肽QHA用PBS溶解至1mg/ml和0.5mg/ml，得到抗原溶液和QHA溶液。抗原组每只小鼠每次用100μl抗原溶液免疫小鼠，免疫方式为腹腔免疫。
此外，将以上配制的抗原溶液与QHA溶液按体积1:1比例混合，将得到的混合液放置在37℃震荡摇床上，100rpm/min震荡孵育35min，得到抗原/QHA混合液。抗原/QHA组每只小鼠每次免疫200μl抗原/QHA混合液，免疫方式为腹腔免疫。
空白组小鼠注射与抗原组相同体积的PBS溶液。
以上免疫规程如图1所示，图中横坐标代表免疫时间。免疫结束后，小鼠眼球取血，收集血清，稀释后用ELISA法检测小鼠血清中抗体滴度。
图2为不同实验组的抗体滴度测试结果，图2中小鼠血清稀释倍数为1:64000。如图2所示，与抗原组相比，抗原/QHA组小鼠血清中抗体的滴度显著升高，表明抗菌肽QHA具有明显的免疫佐剂活性。
实施例3QHA与弗氏佐剂联用为免疫佐剂对小鼠抗体产生的影响检测
实验分为抗原/弗氏佐剂组，抗原/QHA组和抗原/弗氏佐剂/QHA组，每组3只小鼠。
将SARS-CoV-2新冠病毒S1蛋白抗原(苏州思格生物提供)和抗菌肽QHA用PBS溶解至1mg/ml和0.5mg/ml，得到抗原溶液和QHA溶液。然后将抗原溶液和弗氏佐剂(体积比1:1)、抗原溶液和QHA溶液(体积比1:1)、抗原溶液、弗氏佐剂和QHA溶液(体积比1:1:1)混合，得到抗原/弗氏佐剂混合溶液、抗原/QHA混合溶液和抗原/弗氏佐剂/QHA混合溶液。混合时，将混合液放置在旋涡震荡仪上剧烈震荡35min，使弗氏佐剂充分乳化。
然后将以上混合溶液按照表1中的剂量和方式免疫小鼠。
表1免疫剂量和方式
Figure BDA0002513660520000041
以上免疫规程如图3所示，图中横坐标代表免疫时间。对于抗原/弗氏佐剂/QHA组，首次免疫使用完全弗氏佐剂(Sigma，美国)，二免和三免使用不完全弗氏佐剂(Sigma，美国)。免疫结束后，小鼠眼球取血，收集血清，稀释后用ELISA法检测小鼠血清中抗体滴度。
图4为不同实验组的抗体滴度测试结果，图4中小鼠血清稀释倍数为1:64000。如图4所示，与抗原/QHA组和抗原/弗氏佐剂组相比，抗原/弗氏佐剂/QHA组小鼠血清中抗体的滴度显著升高，表明QHA与弗氏佐剂联用具有协同作用。
以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Figure BDA0002513660520000051
序列表
<110> 苏州大学
<120> 天然抗菌肽QHA在制备免疫佐剂中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> (人工序列)
<400> 1
Lys Phe Phe Lys Arg Leu Leu Lys Ser Val Arg Arg Ala Val Lys Lys
1 5 10 15
Phe Arg Lys Lys Pro Arg Leu Ile Gly Leu Ser Thr Leu Leu
20 25 30

Claims (4)

1.天然抗菌肽QHA和弗氏佐剂在制备免疫佐剂中的应用，所述免疫佐剂用于提高抗体的免疫滴度，所述天然抗菌肽QHA的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述弗氏佐剂为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述天然抗菌肽QHA和弗氏佐剂的体积比为1-10:1。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述免疫佐剂用于制备抗体、疫苗、免疫治疗药物或免疫激活剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述疫苗包括肿瘤疫苗。
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