CN111406056A - 4-(4-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-羰基)-6-甲氧基吡啶-2-基)苯甲酸的结晶2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇盐 - Google Patents

4-(4-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌啶]-1’-羰基)-6-甲氧基吡啶-2-基)苯甲酸的结晶2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇盐 Download PDF

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Abstract

本发明提供作为无水结晶或三水合物结晶的4‑(4‑(1‑异丙基‑7‑氧代‑1,4,6,7‑四氢螺[吲唑‑5,4'‑哌啶]‑1'‑羰基)‑6‑甲氧基吡啶‑2‑基)苯甲酸的tris盐；以及其多晶型物、药物组合物、剂型和在治疗动物中由抑制乙酰辅酶A羧化酶(ACC)酶调节的疾病、病况或病症中的用途。

Description

4-(4-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4’-哌 啶]-1’-羰基)-6-甲氧基吡啶-2-基)苯甲酸的结晶2-氨基-2- (羟甲基)丙烷-1,3-二醇盐
发明领域
本发明提供了4-(4-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4'-哌啶]-1'-羰基)-6-甲氧基吡啶-2-基)苯甲酸的tris盐；以及其结晶形式、多晶型物、药物组合物、剂型和在治疗动物中由抑制乙酰辅酶A羧化酶(ACC)酶调节的疾病、病况或病症中的用途。
发明背景
4-(4-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4'-哌啶]-1'-羰基)-6-甲氧基吡啶-2-基)苯甲酸 (本文称为化合物1)是一种选择性ACC抑制剂，并且在US 8,859,577的实施例9中作为游离酸制备，US 8,859,577是国际申请号PCT/IB2011/054119的美国国家阶段，所述专利全部特此通过引用以其整体并入本文以用于所有目的。作为游离酸的化合物1具有不合适的物理化学特性。
盐的形成提供了在不改变药物化学结构的情况下改变药物的物理化学和所得生物学特性的手段。盐形式可能会对药物的性质产生巨大影响。合适的盐形式的选择涉及许多因素的评价，包括是否可以形成任何盐。此选择中包括的其他因素包括可能发现的任何盐形式的吸湿性、稳定性、溶解性以及加工特性。
非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)是代谢综合征的肝表现，并且是一系列肝病况，包括脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、纤维化、硬化和最终的肝细胞癌。NAFLD和NASH被认为是主要的脂肪肝疾病，因为它们占肝脂质升高个体的最大比例。NAFLD/NASH的严重性基于存在脂质、炎性细胞浸润、肝细胞气球样变(hepatocyte ballooning)和纤维化程度。尽管并非所有患有脂肪变性的个体都发展为NASH，但相当一部分个体发展为NASH。
越来越明显地是，肝脂质蓄积会引起肝胰岛素抵抗，并导致2型糖尿病(T2D)的发病机理。Savage等人证明了ACC1和ACC2都参与调节肝细胞中的脂肪氧化，而大鼠肝中的主要同种型ACC1是脂肪酸合成的唯一调节剂。此外，在他们的模型中，需要组合降低两种同种型以显著降低肝丙二酰辅酶A水平，增加进食状态下的脂肪氧化，减少脂质蓄积并改善体内胰岛素作用。因此，肝ACC1和ACC2抑制剂可用于治疗NAFLD和肝胰岛素抵抗。参见Savage,D. B.等人"Reversal of diet-induced hepatic steatosis and hepatic insulinresistance by antisense oligonucleotide inhibitors of acetyl-CoA carboxylases1 and 2" J. Clin. Invest. 2006;116(3):817-24。还参见Oh, W.等人"Glucose and fatmetabolism in adipose tissue of acetyl-CoA carboxylase 2 knockout mice" PNAS,102(5) 1384-1389 (2005)。
因此，需要含有ACC1和/或ACC2抑制剂的口服药物以治疗包括NAFLD、NASH和T2D的疾病。
发明概述
本发明提供了4-(4-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4'-哌啶]-1'-羰基)-6-甲氧基吡啶-2-基)苯甲酸(本文称为化合物1)的tris盐的结晶多晶型物，其中结晶盐可以是无水的或水合物，更具体地是三水合物；以及其多晶型物、药物组合物、剂型和在治疗动物中由抑制乙酰辅酶A羧化酶(ACC)酶调节的疾病、病况或症状中的用途。本发明的新型结晶形式具有特别适合用作药物的性质，包括改善的溶解度和生物利用度。
本文公开了化合物1的固体结晶形式，其中每种固体形式可以通过单独或组合的若干不同的分析参数独特地鉴定，例如但不限于：粉末X射线衍射图峰或两个或更多个峰的组合；固态NMR 13C化学位移或两个或更多个化学位移的组合；和拉曼峰位移或两个或更多个拉曼峰位移的组合。
附图简述
图1显示在配备有Cu辐射源的Bruker AXS D4 Endeavor衍射仪上进行的形式1的说明性PXRD图。
图2显示使用附接到FT-IR工作台的Nicolet NXR FT-Raman附件收集的形式1的说明性拉曼光谱。
图3显示在置于Bruker-BioSpin Avance III 500 MHz(1H频率)NMR光谱仪中的Bruker-BioSpin CPMAS探针上进行的形式1的说明性13C ssNMR图。
图4显示在配备有Cu辐射源的Bruker AXS D4 Endeavor衍射仪上进行的形式2的说明性PXRD图。
图5显示使用附接到FT-IR工作台的Nicolet NXR FT-Raman附件收集的形式2的说明性拉曼光谱。
图6显示在置于Bruker-BioSpin Avance III 500 MHz(1H频率)NMR光谱仪中的Bruker-BioSpin CPMAS探针上进行的形式2的说明性13C ssNMR图。
图7显示形式2的说明性单晶结构。
发明详述
化合物1含有两个可电离的位点：在吡啶环上的氮和羧酸。本发明提供了化合物1 (4-(4-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4'-哌啶]-1'-羰基)-6-甲氧基吡啶-2-基)苯甲酸)的结晶tris盐。本发明关注化合物1的单-tris盐。单-tris盐有两种结晶形式：形式1是无水结晶固体，并且形式2是三水合物结晶固体。形式3是无定形形式。
定义
术语“tris”是指2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇，也称为THAM和氨丁三醇。化合物1的tris盐是指使用2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇制得的化合物1的盐。Tris与化合物1的羧酸部分缔合。除非另有说明，否则当提及化合物1的tris盐时，抗衡离子和化合物1的化学计量比约为1：1。
术语“形式1”是指作为单-tris盐的化合物1的无水结晶2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇(tris)盐。预期形式1不含水，但如果未完全干燥该材料，则可能存在残留溶剂，包括水。
术语“形式2”是指作为单-tris盐的化合物1的三水合物结晶2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇(tris)盐。
如本文所用，术语“三水合物”是指包含约三个水分子。
术语“约”通常是指在给定值或范围的10%之内，优选在5%之内，并且更优选在1%之内。可替代地，当由本领域普通技术人员考虑时，术语“约”是指在可接受的标准平均误差内。
G或g是克，并且mg是指毫克。
H或h是指小时。
IPA是指异丙醇。
L是升。
mL是毫升。
MCC是指微晶纤维素。
RH是指相对湿度。
RT或rt是指与环境温度相同的室温(约20至25℃)。
在所有情况下，1H核磁共振(NMR)光谱均与所提出的结构一致。特征化学位移(δ)以相对于氘代溶剂中的残留质子信号(CHCl3为7.27 ppm；CD2HOD为3.31 ppm)的百万分率(ppm)形式给出，并使用指定主要峰的常规缩写报告：例如 s，单峰；d，二重峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰；br，宽峰。
ssNMR是指固态NMR。
PXRD是指粉末X射线衍射。
RH是指相对湿度。
当用于描述X射线粉末衍射图时，术语“基本上相同”是指包括其中峰在+/- 0.2º2Ɵ的标准偏差内的图。
如本文所用，关于特定结晶形式的术语“基本上纯”是指该结晶形式包含小于10重量%，优选小于5重量%，优选小于3重量%，优选小于1重量%的任何其他化合物1的物理形式。
由于pKa低且结果差，例如使用硫酸作为抗衡离子获得了非常吸湿的固体，因此评价了极少的抗衡离子来在化合物1的氮上形成盐。
研究的许多抗衡离子没有得到盐形式，而是分离时得到游离酸：组氨酸、赖氨酸(带有Na和Ca)、L-鸟氨酸(带有Na)。尝试使用精氨酸(带有Na)导致产生游离酸，因为干燥时解离。评价许多抗衡离子的结果示于表1中。盐通过将化合物1的储备溶液以与化合物1约1：1的比例加入到抗衡离子源中获得。为了得到与化合物1(作为游离酸)的1：1摩尔比而计算的抗衡离子量提供在鉴定抗衡离子的列中的括号中。括号中提供了实际添加的抗衡离子的量，其中提供了不同溶剂中每种抗衡离子的结果。制备化合物1(作为游离酸)在给定溶剂中的储备溶液，并加入到给定溶剂中的抗衡离子中，并且然后加入其他溶剂，以得到表1中溶剂下方括号中提供的总体积。每个样品观察一周，在此期间将样品加热至约50ºC约3 hr，并允许其在搅拌下冷却至室温。对于其中使用甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)和乙酸异丙酯/乙酸乙酯(IPAC/EtOAc)的实验，总计观察样品三周。表1提供了在此期间观察到的结果。对于某些样品，第一周后加入2 mL庚烷，并且这在表1中用*识别。对于甲醇和乙腈(ACN)，储备溶液为15 mg/mL。对于乙醇，储备溶液为30 mg/mL。对于IPAC/EtOAc，储备溶液为13.6 mg/mL，于50mL IPAC/5 mL EtOAc(包括几滴水)中。在检查的每种列出的溶剂下方的括号中提供了总体积(vol.)。
表1 – 盐评价
Figure 900784DEST_PATH_IMAGE001
*第一周后加入2 mL庚烷。
确定是否会形成固体只是该评价的一个因素。尽管在使用钙、钾和钠制盐时会形成结晶固体，但该结晶固体太吸湿以致无法继续评价。由于主要通过目视观察，因此没有获得这些盐中许多的吸湿性数据。例如，当在滤纸上收集钙盐和钾盐形式时，固体材料变成胶状物。分离出作为胆碱盐的化合物1；发现在30%相对湿度下，吸湿性是超过20%重量变化。此外，尽管获得了二乙醇胺、二乙胺和哌嗪的盐的固体，但是没有寻求这些盐。参见例如C.Saal, A. Becker, Euro. J. of Pharm Sci 49 (2013) 614-623；Paullekuhn, GSteffen等人, J. Med. Chem. 2007, 50, 6665-6682。
此外，尽管获得了固体，但仍使用附加评价如1H NMR来确定是否确实形成了盐。在某些情况下，获得的固体是化合物1(作为游离酸)，并且不与抗衡离子缔合。
在环境温度且RH高于20%下，形式2是形式1和形式2之间更稳定的形式。溶剂条件会影响获得形式1还是形式2。经确定，在IPA/水中0.2的临界水分活度(critical wateractivity)提供结晶形式2。在水存在下使用时，以下溶剂提供形式2：5%至15%的水/丙酮、4%水/96%乙腈、1%水/99%乙酸丁酯、1%水/99%乙酸异丙酯、1%水/99%乙酸乙酯、2%水/98%二氯乙烯、2%水/98%甲基乙基酮、3 至6.0%的水/97至94%的2-甲基四氢呋喃，和4%水/96%正丙醇。
化合物1在溶解度方面也面临挑战。表2提供了化合物1(作为游离酸)和各种盐的溶解度。化合物1(作为游离酸)被证明是用于制备常规口服施用剂型的不可接受的形式。尽管化合物1(作为游离酸)为结晶，但热力学溶解度并不一致。钙盐在低pH下的溶解度极低。
表2 – 化合物1和盐形式的热力学溶解度
Figure 817924DEST_PATH_IMAGE002
寻求盐形式是因为化合物1(作为游离酸)未提供一致的结果；不受限制地，认为游离酸可以多种非化学计量的水合物/溶剂化物形式存在。如表2所示，在每个pH下，游离酸的溶解度在三个批次之间变化。
进行了在药物动力学研究中比较游离酸和tris盐的其他工作，如表3所提供的。化合物1的单-tris盐，无论是形式1还是形式2，都具有相似的药代动力学。化合物1的单-tris盐比化合物1(作为游离酸)具有更好的药代动力学。尽管悬浮液是用无水形式1制备的，但考虑到水性介质，三水合物形式2也可能存在。悬浮液中存在的形式未被鉴定。
表3 –化合物1的选择形式的药代动力学
用于制备口服制剂的化合物1的形式 口服制剂 剂量 (mg/kg) AUC/剂量 (ng*h/ml/mpk)
形式1 立即释放片剂 2 5750
形式2 立即释放片剂 2 5650
形式1 悬浮液 5 7240
化合物1的游离酸 悬浮液 10 4120
形式1是无水的并且在环境温度下(20%RH)在低于约0.2的水分活度下是热力学稳定的。形式1具有与图1所示的PXRD图基本相同的PXRD图。表示为2Ɵ + 0.2º 2Ɵ的形式1的特征PXRD峰在9.6、10.7和11.3处。图1中PXRD图的峰位置和强度提供在表4中。
表4 –形式1的PXRD峰和相对强度
Figure 348394DEST_PATH_IMAGE003
形式1具有与图2所示的拉曼光谱基本相同的拉曼光谱。形式1具有特征性的拉曼峰位移，表示为cm-1，在568 + 2 cm-1、698 + 2 cm-1、989 + 2 cm-1、1218 + 2 cm-1、1511 +2 cm-1、1561 + 2 cm-1和1615 + 2 cm-1处。图2中形式1的峰位置(+ 2 cm-1)和归一化强度(W＝弱，M ＝中，S ＝强)列于表5。
表5 –形式1的拉曼峰和归一化强度
Figure 805920DEST_PATH_IMAGE004
Figure 620292DEST_PATH_IMAGE005
形式1具有与图3所示的13C ssNMR光谱基本相同的13C ssNMR光谱。形式1具有特征性的13C ssNMR化学位移，表示为ppm，在22.9 + 0.2 ppm、146.2 + 0.2 ppm、157.9 + 0.2ppm、161.9 + 0.2 ppm和172.9 + 0.2 ppm处。图3所示的形式1的13C化学位移(+ 0.2 ppm)列于表6。
表6 – 形式1的13C化学位移和强度
Figure 65924DEST_PATH_IMAGE006
形式2是三水合物并且在环境温度和20% RH下在高于约0.2的水分活度下是热力学稳定的。形式2具有与图4所示的PXRD图基本相同的PXRD图。表示为2Ɵ + 0.2º 2Ɵ的形式2的特征PXRD峰在8.4、9.0、10.5、15.0和24.7处。图4中PXRD图的峰位置和强度提供在表7中。
表7 –形式2的PXRD峰和相对强度
Figure 395274DEST_PATH_IMAGE007
形式2具有与图5所示的拉曼光谱基本相同的拉曼光谱。形式2具有特征性的拉曼峰位移，表示为cm-1，在562 + 2 cm-1、692 + 2 cm-1、984 + 2 cm-1、1225 + 2 cm-1、1507 +2 cm-1、1557 + 2 cm-1和1610 + 2 cm-1处。图5中形式2的峰位置(+ 2 cm-1)和归一化强度(W＝弱，M ＝中，S ＝强)列于表8。
表8 –形式2的拉曼峰和归一化强度
Figure 594174DEST_PATH_IMAGE008
Figure 263053DEST_PATH_IMAGE009
形式2具有与图6所示的13C ssNMR光谱基本相同的13C ssNMR光谱。形式2具有特征性的13C ssNMR化学位移，表示为ppm，在19.2 + 0.2 ppm、149.5 + 0.2 ppm、155.6 + 0.2ppm、163.8 + 0.2 ppm和188.3 + 0.2 ppm处。图6所示的形式2的13C化学位移(+ 0.2 ppm)列于表9。
表9 – 形式2的13C化学位移和强度
Figure 944832DEST_PATH_IMAGE010
基于本文提供的公开内容，本领域普通技术人员将理解，可以通过呈不同组合的若干不同光谱峰或图来独特地鉴定各形式1和形式2。以下描述的是特征峰值的示例性组合，其可用于分别鉴定形式1和形式2，但绝不应将这些示例性组合视为限制本文中公开的其他峰值组合。
本发明的一个方面提供了4-(4-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4'-哌啶]-1'-羰基)-6-甲氧基吡啶-2-基)苯甲酸(化合物1)的结晶2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇盐。
本发明的另一方面提供了化合物1的结晶盐，其中4-(4-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4'-哌啶]-1'-羰基)-6-甲氧基吡啶-2-基)苯甲酸(化合物1)和盐的比例为1:1。
本发明的另一方面提供了作为化合物1的无水结晶盐(形式1)的结晶盐。
本发明的另一方面提供了作为化合物1的三水合物结晶盐(形式2)的结晶盐。
本发明的另一方面提供了形式1，其中形式1具有PXRD图，该PXRD图包括在9.6 2Ɵ+ 0.2º 2Ɵ、10.7 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ和11.3 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ的衍射角处的峰。
本发明的另一方面提供了形式1，其中形式1具有包括表示为2Ɵ的峰的PXRD图，该PXRD图与图1所示的PXRD图基本相同。
本发明的另一方面提供了形式1，其中形式1具有拉曼光谱，该拉曼光谱包括在1511 cm-1 + 2 cm-1、1561 cm-1 + 2 cm-1和1615 cm-1 + 2 cm-1处的峰位移。
本发明的另一方面提供了形式1，其中形式1具有拉曼光谱，该拉曼光谱包括在989cm-1 + 2 cm-1、1218 cm-1 + 2 cm-1、1511 cm-1 + 2 cm-1、1561 cm-1 + 2 cm-1和1615 cm-1 + 2cm-1处的峰位移。
本发明的另一方面提供了形式1，其中形式1具有拉曼光谱，该拉曼光谱包括在568cm-1 + 2 cm-1、698 cm-1 + 2 cm-1、989 cm-1 + 2 cm-1、1218 cm-1 + 2 cm-1、1511 cm-1 + 2 cm-1、1561 cm-1 + 2 cm-1和1615 cm-1 + 2 cm-1处的峰位移。
本发明的另一方面提供了形式1，其中形式1具有包括表示为cm-1的峰位移的拉曼光谱，该拉曼光谱与图2所示的拉曼光谱基本相同。
本发明的另一方面提供了形式1，其中形式1具有13C ssNMR光谱，该13C ssNMR光谱包括在22.9 ppm + 0.2 ppm、146.2 ppm + 0.2 ppm和161.9 ppm + 0.2 ppm处的化学位移。
本发明的另一方面提供了形式1，其中形式1具有13C ssNMR光谱，该13C ssNMR光谱包括在22.9 ppm + 0.2 ppm、146.2 ppm + 0.2 ppm、157.9 ppm + 0.2 ppm、161.9 ppm +0.2 ppm和172.9 ppm + 0.2 ppm处的化学位移。
本发明的另一方面提供了形式1，其中形式1具有包括表示为ppm的化学位移的13CssNMR光谱，该13C ssNMR光谱与图3所示的13C ssNMR光谱基本相同。
本发明的另一方面提供了形式1，其中形式1具有选自包括在1561 cm-1 + 2 cm-1和1615 cm-1 + 2 cm-1处的峰位移的拉曼光谱和包括在22.9 ppm + 0.2 ppm、146.2 ppm +0.2 ppm或161.9 ppm + 0.2 ppm处的至少一个化学位移的13C ssNMR光谱的分析参数。
本发明的另一方面提供了形式1，其中形式1具有选自包括在1511 cm-1 + 2 cm-1和1615 cm-1 + 2 cm-1处的峰位移的拉曼光谱和包括在22.9 ppm + 0.2 ppm、146.2 ppm +0.2 ppm或161.9 ppm + 0.2 ppm处的至少一个化学位移的13C ssNMR光谱的分析参数。
本发明的另一方面提供了形式1，其中形式1具有选自包括在1615 cm-1 + 2 cm-1处的峰位移的拉曼光谱和包括在22.9 ppm + 0.2 ppm、146.2 ppm + 0.2 ppm或161.9 ppm +0.2 ppm处的至少一个化学位移的13C ssNMR光谱的分析参数。
本发明的另一方面提供了形式1，其中形式1具有选自包括在1561 cm-1 + 2 cm-1处的峰位移的拉曼光谱和包括在22.9 ppm + 0.2 ppm、146.2 ppm + 0.2 ppm或161.9 ppm +0.2 ppm处的至少一个化学位移的13C ssNMR光谱的分析参数。
本发明的另一方面提供了形式1，其中形式1具有选自包括在22.9 ppm + 0.2 ppm和161.9 ppm + 0.2 ppm处的化学位移的13C ssNMR光谱和包括在1511 cm-1 + 2 cm-1、1561cm-1 + 2 cm-1或1615 cm-1 + 2 cm-1处的至少一个峰位移的拉曼光谱的分析参数。
本发明的另一方面提供了形式1，其中形式1具有选自包括在146.2 ppm + 0.2ppm和161.9 ppm + 0.2 ppm处的化学位移的13C ssNMR光谱和包括在1511 cm-1 + 2 cm-1、1561 cm-1 + 2 cm-1或1615 cm-1 + 2 cm-1处的至少一个峰位移的拉曼光谱的分析参数。
本发明的另一方面提供了形式1，其中形式1具有选自包括在9.6 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ和10.7 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ的衍射角处的峰的PXRD图和包括在1511 cm-1 + 2 cm-1、1561 cm-1 +2 cm-1或1615 cm-1 + 2 cm-1处的至少一个峰位移的拉曼光谱的分析参数。
本发明的另一方面提供了形式1，其中形式1具有选自包括在9.6 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ和10.7 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ的衍射角处的峰的PXRD图和包括在22.9 ppm + 0.2 ppm、146.2ppm + 0.2 ppm或161.9 ppm + 0.2 ppm处的至少一个化学位移的13C ssNMR光谱的分析参数。
本发明的另一方面提供了形式2，其中形式2具有PXRD图，该PXRD图包括在8.4 2Ɵ+ 0.2º 2Ɵ、9.0 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ和10.5 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ的衍射角处的峰。
本发明的另一方面提供了形式2，其中形式2具有PXRD图，该PXRD图包括在8.4 2Ɵ+ 0.2º 2Ɵ、9.0 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ、10.5 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ、15.0 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ和24.7 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ的衍射角处的峰。
本发明的另一方面提供了形式2，其中形式2具有包括表示为2Ɵ的峰的PXRD图，该PXRD图与图4所示的PXRD图基本相同。
本发明的另一方面提供了形式2，其中形式2具有拉曼光谱，该拉曼光谱包括在1507 cm-1 + 2 cm-1、1557 cm-1 + 2 cm-1和1610 cm-1 + 2 cm-1处的峰位移。
本发明的另一方面提供了形式2，其中形式2具有拉曼光谱，该拉曼光谱包括在984cm-1 + 2 cm-1、1225 cm-1 + 2 cm-1、1507 cm-1 + 2 cm-1、1557 cm-1 + 2 cm-1和1610 cm-1 + 2cm-1处的峰位移。
本发明的另一方面提供了形式2，其中形式2具有拉曼光谱，该拉曼光谱包括在562cm-1 + 2 cm-1、692 cm-1 + 2 cm-1、984 cm-1 + 2 cm-1、1225 cm-1 + 2 cm-1、1507 cm-1 + 2 cm-1、1557 cm-1 + 2 cm-1和1610 cm-1 + 2 cm-1处的峰位移。
本发明的另一方面提供了形式2，其中形式2具有包括表示为cm-1的峰位移的拉曼光谱，该拉曼光谱与图5所示的拉曼光谱基本相同。
本发明的另一方面提供了形式2，其中形式2具有13C ssNMR光谱，该13C ssNMR光谱包括在19.2 ppm + 0.2 ppm、149.5 ppm + 0.2 ppm和163.8 ppm + 0.2 ppm处的化学位移。
本发明的另一方面提供了形式2，其中形式2具有13C ssNMR光谱，该13C ssNMR光谱包括在19.2 ppm + 0.2 ppm、149.5 ppm + 0.2 ppm、155.6 ppm + 0.2 ppm、163.8 ppm +0.2 ppm和188.3 ppm + 0.2 ppm处的化学位移。
本发明的另一方面提供了形式2，其中所述形式2具有包括表示为ppm的化学位移的13C ssNMR光谱，该13C ssNMR光谱与图6所示的13C ssNMR光谱基本相同。
本发明的另一方面提供了形式2，其中形式2具有选自以下的分析参数
包括在8.4 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ和9.0 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ的衍射角处的峰的PXRD图；
包括在1557 cm-1 + 2 cm-1和1610 cm-1 + 2 cm-1处的峰位移的拉曼光谱；和
包括在19.2 ppm + 0.2 ppm、149.5 ppm + 0.2 ppm或163.8 ppm + 0.2 ppm处的至少一个化学位移的13C ssNMR光谱。
本发明的另一方面提供了形式2，其中形式2具有选自以下的分析参数
包括在8.4 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ和10.5 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ的衍射角处的峰的PXRD图；
包括在1507 cm-1 + 2 cm-1和1610 cm-1 + 2 cm-1处的峰位移的拉曼光谱；和
包括在19.2 ppm + 0.2 ppm、149.5 ppm + 0.2 ppm或163.8 ppm + 0.2 ppm处的至少一个化学位移的13C ssNMR光谱。
本发明的另一方面提供了形式2，其中形式2具有选自包括在1557 cm-1 + 2 cm-1处的峰位移的拉曼光谱和包括在19.2 ppm + 0.2 ppm、149.5 ppm + 0.2 ppm或163.8 ppm +0.2 ppm处的至少一个化学位移的13C ssNMR光谱的分析参数。
本发明的另一方面提供了形式2，其中形式2具有选自包括在1610 cm-1 + 2 cm-1处的峰位移的拉曼光谱和包括在19.2 ppm + 0.2 ppm、149.5 ppm + 0.2 ppm或163.8 ppm +0.2 ppm处的至少一个化学位移的13C ssNMR光谱的分析参数。
本发明的另一方面提供了形式2，其中形式2具有选自包括在19.2 ppm + 0.2 ppm和149.5 ppm + 0.2 ppm处的化学位移的13C ssNMR光谱和包括在1507 cm-1 + 2 cm-1、1557cm-1 + 2 cm-1或1610 cm-1 + 2 cm-1处的至少一个峰位移的拉曼光谱的分析参数。
本发明的另一方面提供了形式2，其中形式2具有选自包括在149.5 ppm + 0.2ppm和163.8 ppm + 0.2 ppm处的化学位移的13C ssNMR光谱和包括在1507 cm-1 + 2 cm-1、1557 cm-1 + 2 cm-1或1610 cm-1 + 2 cm-1处的至少一个峰位移的拉曼光谱的分析参数。
本发明的另一方面提供了形式2，其中形式2具有选自包括在8.4 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ和9.0 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ的衍射角处的峰的PXRD图和包括在1507 cm-1 + 2 cm-1、1557 cm-1 +2 cm-1或1610 cm-1 + 2 cm-1处的至少一个峰位移的拉曼光谱的分析参数。
本发明的另一方面提供了形式2，其中形式2具有选自包括在8.4 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ和9.0 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ的衍射角处的峰的PXRD图和包括在19.2 ppm + 0.2 ppm、149.5ppm + 0.2 ppm或163.8 ppm + 0.2 ppm处的至少一个化学位移的13C ssNMR光谱的分析参数。
本发明还包括：
用作药物的如本文所述的化合物1的结晶盐，包括形式1和/或形式2；
包括向哺乳动物施用治疗有效量的化合物1的结晶盐(包括形式1和/或形式2)以治疗包括NAFLD、NASH和T2D的疾病的方法；和
如本文所述的化合物1的结晶盐(包括形式1和/或形式2)在制备用于治疗包括NAFLD、NASH和T2D的疾病的药物中的用途。
本发明的另一方面提供了包含本文所述的形式1或形式2的药物组合物。在另一方面，本发明提供了口服剂型，其包含本文所述的形式1或形式2，或任一药物组合物。例如，在一个实施方案中，口服剂型是片剂、丸剂或胶囊剂。例如，在一个实施方案中，口服剂型是片剂或胶囊剂。
本发明化合物和/或含有所述化合物的组合物的剂量方案基于多种因素，包括患者的类型、年龄、重量、性别和医疗状况；病况的严重程度；施用途径；以及所用特定化合物的活性。因此，剂量方案可以广泛变化。对于体重约100 kg的正常成年人，典型地，在每千克体重约0.001 mg至约10 mg的范围内的典型日剂量是足够的，优选约0.01 mg/kg至约5.0mg/kg，更优选约0.01 mg/kg至约1 mg/kg。然而，取决于所治疗的对象的年龄和重量，预期的施用途径，所施用的特定化合物等，可能需要在一般剂量范围内有一些变化。确定特定患者的剂量范围和最佳剂量完全在受益于本公开内容的领域的普通技术人员的能力范围内。还应注意，本发明的化合物可以以持续释放、控制释放和延迟释放制剂使用，其形式也是本领域普通技术人员所熟知的。
在另一方面，本发明包括药物组合物。这种药物组合物包含形式1或形式2和药学上可接受的载体。也可以存在其他药理活性物质。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，以及它们的组合，并且可以在组合物中包括等渗剂，例如糖、氯化钠或多元醇，如甘露醇或山梨糖醇。药学上可接受的物质如润湿剂或少量的辅助物质如润湿或乳化剂、防腐剂或缓冲剂增强抗体或抗体部分的保质期或有效性。
口服施用的固体剂型可以例如存在于离散单位中，例如硬或软胶囊剂、丸剂、扁囊剂、锭剂或片剂，各自含有预定量的至少一种本发明的化合物。在另一个实施方案中，口服施用可以是粉末或颗粒形式。在另一个实施方案中，口服剂型是舌下的，如例如锭剂。在这种固体剂型中，式I化合物通常与一种或多种佐剂组合。这种胶囊剂或片剂可以含有控制释放制剂。就胶囊剂、片剂和丸剂而言，剂型还可以包含缓冲剂或可以用肠溶衣制备。
实施例
在化合物1的制备中，应注意，本文所述的某些制备方法可能需要保护远程官能团(例如，式I前体中的伯胺、仲胺、羧基)。这种保护的需要将根据远程官能团的性质和制备方法的条件而有所不同。这种保护的需要是本领域技术人员容易确定的。这种保护/脱保护方法的使用也在本领域技术范围内。关于保护基及其使用的一般说明，参见T.W. Greene,Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991。此外，本发明不限于本文提供的可以变化的具体合成方法。
中间体1: 1-异丙基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4'-哌啶]-7(1H)-酮, 盐酸盐
Figure 761478DEST_PATH_IMAGE011
步骤1. 9-氧代-3-氮杂螺[5.5]十一碳-7-烯-3-甲酸叔丁酯
Figure 560807DEST_PATH_IMAGE012
在25-30℃下，在干燥的反应器中装入4-甲酰基哌啶-1-甲酸叔丁酯 (108 Kg)、环己烷(1080 L)和吡咯烷(64.8 Kg)。将混合物搅拌5-10 min，并且然后加热至回流12-16 h，同时使用Dean-Stark分水器收集水。然后将反应混合物冷却至50-60℃，在该温度下施加真空以蒸馏过量的吡咯烷和环己烷。然后将反应混合物冷却至25-30℃，并装入环己烷(648 L)，随后装入甲基乙烯基酮(49.63 Kg)。将混合物搅拌12-16 h，然后过滤，并将滤液装入清洁和干燥的反应器中。将溶液冷却至10-15℃，然后缓慢加入乙酸(54.75 Kg)的水(54 L)溶液，保持温度低于15℃。在添加结束时，将混合物温热至25-30℃并搅拌12-16 h。分离层，并用乙酸乙酯(324 L)萃取水层。合并的有机层用碳酸氢钠(32.34 Kg)的水(324 L)溶液洗涤，然后经硫酸钠干燥。用乙酸乙酯(54 L)洗涤固体，并将合并的滤液在低于40℃下在减压下浓缩。将正庚烷(216 L)装入反应器中，并在减压和低于40℃下进行蒸馏直至干燥。将混合物冷却至25-30℃，并将正庚烷(216 L)装入反应器中。形成固体后，将混合物搅拌1-2 h。然后将固体过滤，用正庚烷(54 L)洗涤，并在40-50℃下干燥10-12 h以产生期望的材料(90.1Kg，67%产率)。
步骤2. (E)-10-((二甲基氨基)亚甲基)-9-氧代-3-氮杂螺[5.5]十一碳-7-烯-3-甲酸叔丁酯
Figure 84192DEST_PATH_IMAGE013
在25-30℃在氮气气氛下，在清洁和干燥的反应器中装入9-氧代-3-氮杂螺[5.5]十一碳-7-烯-3-甲酸叔丁酯 (50 Kg)、N,N-二甲基甲酰胺(500 L)和N,N-二甲基甲酰胺二甲缩醛(135 Kg)。将反应混合物搅拌5-10 min，然后加热至120-130℃持续20 h。然后将混合物冷却至50-60℃，并在低于60℃下在高真空下蒸馏溶剂。在低于45℃下装入混合二甲苯(200L)，并在低于60℃下在高真空下蒸馏溶剂。用另一批混合二甲苯(200 L)重复此操作。然后将甲苯(200L)装入反应器中，并在低于60℃下在高真空下蒸馏溶剂。用第二批甲苯(200 L)重复此操作。然后在低于30℃下装入甲基叔丁基醚(100 L)，并在低于40℃下在高真空下蒸馏溶剂。将混合物冷却至15-20℃，并在低于20℃下装入甲基叔丁基醚(100 L)。将混合物搅拌20-30 min，并将固体过滤，用甲基叔丁基醚(50 L)洗涤，并在50-55℃下在无真空下干燥10 h以提供期望的化合物(52.1 Kg，87%产率)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.48 (s,1H), 6.57 (d, J=9.97 Hz, 1H), 5.99 (d, J=10.16 Hz, 1H), 3.32-3.51 (m, 4H),3.06 (s, 6H), 2.72 (s, 2H), 1.57-1.66 (m, 2H), 1.41-1.53 (m, 11H)。
步骤3. 1-异丙基-1,4-二氢螺[吲唑-5,4'-哌啶]-1'-甲酸叔丁酯
Figure 893797DEST_PATH_IMAGE014
在25-30℃下在清洁和干燥的反应器中装入(E)-10-((二甲基氨基)亚甲基)-9-氧代-3-氮杂螺[5.5]十一碳-7-烯-3-甲酸叔丁酯 (80 Kg)、甲苯(704 L)和三甲胺(16 L)。将反应混合物温热至70-80℃，并经4-5 h加入异丙基肼盐酸盐的甲醇溶液(1.25当量，总计141Kg)。然后将反应混合物在70-80℃下搅拌8-10 h，然后冷却至15-25℃。然后缓慢加入柠檬酸(48 Kg)的水(480 L)溶液，保持内部温度低于25℃。加入乙酸乙酯(208 L)，并将混合物搅拌10 min。分离层，并且依次用柠檬酸(48 Kg)的水(480 L)溶液，然后仅用水(320 L)洗涤有机层。用乙酸乙酯(320 L)萃取合并的水层。然后将合并的有机层经硫酸钠(8 Kg)干燥，并将溶剂在减压和低于40℃下蒸发至干。将二氯甲烷(240 L)装入反应器中，并将混合物在25-30℃下搅拌直至澄清。在25-30℃下依次装入活性炭(1.84 Kg)、硅酸镁(1.84 Kg)和硅胶(32 Kg，100-200目)，并将不均匀混合物搅拌1 h。然后将浆料在Hyflow床上过滤，其通过混合Hyflow supercell (8 Kg)和二氯甲烷(40 L)制备。用二氯甲烷洗涤滤饼(120 L，3次)。将合并的滤液装回反应器中，并在低于40℃下在减压下蒸发溶剂。然后装入正庚烷(160 L)，并在低于40℃下在减压下蒸馏。将正庚烷(200 L)装入反应器中，并将混合物冷却至0-5℃。搅拌12-15 h后，将固体在0℃下过滤，用冷(0-5℃)正庚烷(160 L)洗涤，并在40-50℃下在真空下干燥，以提供标题化合物(82.4 Kg，75%)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm7.25 (s, 1H), 6.42 (dd, J=10.05, 0.49 Hz, 1H) 5.84 (d, J=9.95 Hz, 1H), 4.42-4.52 (m, 1H), 3.36-3.53 (m, 4H), 2.62 (s, 2H) 1.56-1.68 (m, 2H) 1.45-1.55 (m,17H)。
步骤4. 1-异丙基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4'-哌啶]-7(1H)-酮, 盐酸盐
Figure 135423DEST_PATH_IMAGE015
在25-30℃下在清洁和干燥的反应器中装入1-异丙基-1,4-二氢螺[吲唑-5,4'-哌啶]-1'-甲酸叔丁酯 (60 Kg)和甲醇(600 L)。在25-30℃下经30-40 min分5份加入N-溴代琥珀酰亚胺(32.4 Kg)，并继续搅拌30-60 min。缓慢加入硫代硫酸钠五水合物(5.4 Kg)的水(102 L)溶液，保持内部温度低于30℃。将混合物搅拌20-30 min，然后在低于45℃下在减压下蒸发溶剂。将残余物冷却至25-30℃，并将2-甲基四氢呋喃(420 L)与水(90 L)一起装入反应器中。将混合物搅拌15-20 min，然后分离层，进一步用2-甲基四氢呋喃(120 L)萃取水层。在25-30℃下用氢氧化钠(4.8 Kg)的水(120 L)溶液处理合并的有机萃取物15-20 min。分离层，并将有机层用水(120 L)，随后用氯化钠(12 Kg)的水(120 L)溶液洗涤，并且然后经硫酸钠(6 Kg)干燥。过滤后，用2-甲基四氢呋喃(30 L)洗涤滤饼，并将合并的滤液装回反应器中。在低于45℃下在减压下将溶剂完全蒸馏，并将残余物溶解在四氢呋喃(201 L)中。在25-30℃下，在另一个清洁和干燥的反应器中装入叔丁醇钾(60.6 Kg)和四氢呋喃(360L)。向该混合物中缓慢加入残留物的四氢呋喃溶液，保持温度低于30℃。然后将反应混合物温热至60-65℃，并在该温度下保持1-2 h。完成时，将混合物冷却至0-10℃，并用盐酸溶液(1 N，196 L)缓慢淬灭，保持内部温度低于10℃。允许反应混合物温热至25-30℃，并装入乙酸乙酯(798 L)。搅拌15-20 min后，分离层，并进一步用乙酸乙酯(160 L)萃取水层。合并的有机层用水(160 L)洗涤，经硫酸钠(8 Kg)干燥，过滤，并用乙酸乙酯(300 L)洗涤滤饼。在低于45℃下在减压下将溶剂完全蒸馏，并在25-30℃下将乙酸乙酯(540 L)装入反应器中，随后装入甲醇(156L)。将混合物冷却至0-5℃，在此时缓慢加入乙酰氯(79.8 Kg)，将温度保持在指定范围内。然后允许混合物温热至20-25℃，并在搅拌下在该温度下保持4-5 h。将得到的浆料过滤并将固体用乙酸乙酯(120 L)洗涤，然后在40-45℃下干燥8-10 h以提供期望的粗产物(33.5 Kg，65%)。
通过在25-30℃下在清洁干燥的反应器中，将该粗制固体(56.8 Kg)溶解在甲醇(454.4 L)中，进行最终纯化步骤。将溶液搅拌30-45 min，然后在25-30℃下通过0.2微米筒式过滤器进入清洁和干燥的反应器中。在低于50℃下在减压下蒸馏甲醇，直到剩余约1 vol溶剂。将反应混合物冷却至25-30℃，并通过0.2微米筒式过滤器装入新鲜的乙腈(113.6L)。在低于50℃下在减压下蒸馏溶剂，直至剩余约1 vol溶剂。将反应混合物冷却至25-30℃，并通过0.2微米筒式过滤器将新鲜的乙腈(190 L)装入反应器中。将混合物温热至65-70℃并搅拌45 min，然后冷却至25-30℃并搅拌1 h。过滤得到的浆料，并用冷(15℃)乙腈(56.8 L)洗涤滤饼。将固体在40-50℃下在减压下干燥8 h以得到中间体1 (36.4 Kg，64%)。1HNMR (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7.43 (s, 1H), 5.32-5.42 (m, 1H), 3.15-3.25 (m,4H), 2.89 (s, 2H), 2.64 (s, 2H), 1.69-1.90 (m, 4H), 1.37-1.45 (m, 6H); ESI [M+H]+ =248。
中间体2: 2-(4-(叔丁氧基羰基)苯基)-6-甲氧基异烟酸
Figure 472863DEST_PATH_IMAGE016
在20-25℃下，在清洁和干燥的反应器中装入2,6-二氯异烟酸(30 Kg)和甲醇(120 L)。将浆料搅拌5 min，然后加热至65℃(回流)。然后通过加料漏斗经至少4 h缓慢装入甲醇钠的甲醇溶液(30%，87.2 Kg)。用甲醇(15 L)冲洗漏斗，并在65℃下进行搅拌至少15 h。然后将混合物冷却至45℃，并在减压下蒸馏直至残留体积为约90 L。然后在40-45℃下将碳酸氢钾(28.2 Kg)和碳酸钾(21.6 Kg)在水(180 L)中的溶液装入反应器。用水(21 L)冲洗含有水溶液的反应器，并将洗涤液装入反应混合物中。将混合物在低于80℃下在减压下蒸馏，直至残留体积为约240 L，然后冷却至20-25℃。
在另一个清洁和干燥的反应器中装入4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯甲酸叔丁酯(52.3 Kg)和二噁烷(340 Kg)，并在2-25℃搅拌直至完全溶解。然后将前一反应器的内容物在40℃加热以确保完全溶解，并转移到该新反应器中。将反应混合物冷却至20-25℃，并通过真空/氮气循环进行脱氧步骤。将混合物进一步冷却至0-10℃，并将乙酸钯(0.65 Kg)装入反应器中，随后在氮气流下装入三苯基膦(2.46 Kg)。将该混合物温热至20-25℃，并通过真空/氮气循环进行另一脱氧步骤。然后将混合物加热至80℃，并在此温度下保持至少18 h。将混合物冷却至20-25℃，然后将甲基叔丁基醚(133.2 Kg)和水(30 L)依次装入反应器中。分离层，并将水层用水(110 L)稀释，然后用甲基叔丁基醚(110L)萃取。用柠檬酸(52 Kg)的水(84 L)溶液洗涤合并的有机萃取物，并分离层。用甲基叔丁基醚(88.8 Kg)进一步萃取水层，并将有机层合并，然后用三分之一的氯化钠(43 Kg)的水(80 L)溶液洗涤3次。在最后的层分离之后，将有机层通过含有炭筒的颇尔过滤器过滤，并将滤饼用甲基叔丁基醚(11.2 Kg)洗涤。将滤液在低于50℃下在减压下蒸馏至约90 L，并且然后接着在低于50℃下与庚烷(120 L)共蒸馏至约120 L。然后经1 h将混合物冷却至20-25℃，然后在该温度下搅拌另外1 h。过滤浆料，并将滤饼用庚烷(3×18 L)洗涤3次，然后用乙腈(3×18 L)洗涤3次。将所得的湿固体在低于45℃下在真空和氮气流下干燥至少15 h，以得到中间体2(44.6 Kg，87%产率)。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8.13 (s, 2H), 8.09(s, 2H), 7.97 (d, J=1.17 Hz, 1H), 7.34 (d, J=0.98 Hz, 1H), 4.08 (s, 3H), 1.61(s, 9H); ESI [M+H]+ =330。
中间体3: 4-(4-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4'-哌啶]-1'-羰基)-6-甲氧基吡啶-2-基)苯甲酸叔丁酯
Figure 116334DEST_PATH_IMAGE017
在圆底烧瓶中装入2-(4-(叔丁氧基羰基)苯基)-6-甲氧基异烟酸(中间体2，15.2 g，46.2 mmol)和乙酸乙酯(140 mL)。一次性加入1,1'-羰基二咪唑(8.98 g，55.4 mmol)，并在室温搅拌1 h。加入1-异丙基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4'-哌啶]-7(1H)-酮盐酸盐(中间体1,14.8 g, 52.2 mmol)，随后加入N,N-二异丙基乙胺(9.1 mL, 52.2 mL)，并在室温搅拌反应18 h。加入2M HCl水溶液(40 mL)，随后加入1M硫酸氢钾(40 mL)和50 mL庚烷。将所得混合物在室温搅拌1 h。将混合物转移至分液漏斗。将有机相分离，依次用水(20 mL)、饱和碳酸氢钠(30 mL)、水(20 mL)、盐水(20 mL)洗涤，经20 g硫酸镁和10 g硅胶干燥，过滤，并真空浓缩。在浓缩即将结束时开始形成固体。在80℃在40 mL乙酸乙酯中搅拌残余物，并缓慢滴加庚烷(120 mL)。将混合物在80℃搅拌1 h，然后在搅拌下经1 h缓慢冷却至室温，并在室温搅拌18 h。固体通过过滤收集，用水和乙酸乙酯-庚烷(1：3)洗涤，并在50℃下在真空下干燥18 h以获得中间体3(19.64 g，76%产率)。
中间体3的替代制备：
在20-25℃下，在清洁和干燥的反应器中装入乙腈(219 Kg)和2-(4-(叔丁氧基羰基)苯基)-6-甲氧基异烟酸(中间体2，34.8 Kg)。将混合物搅拌5 min，然后以三个连续份装入1,1-羰基二咪唑(18.9 Kg)。将浆料在20-25℃下进一步搅拌至少1 h，然后将1-异丙基-4,6-二氢螺[吲唑-5,4'-哌啶]-7(1H)-酮盐酸盐 (中间体1, 33.0 Kg)装入反应器中，随后通过泵装入N,N-二异丙基乙胺(20.5 Kg)。用乙腈(13.7 Kg)洗涤试剂泵以及反应器的壁，并在20-25℃下进行搅拌至少2 h。完成时，用4-(4-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4'-哌啶]-1'-羰基)-6-甲氧基吡啶-2-基)苯甲酸叔丁酯(中间体3, 209 g)接种混合物，并搅拌至少30 min。确认结晶开始后，经1 h装入柠檬酸一水合物(58.5 Kg)的水(257 L)溶液。将得到的浆料在20-25℃下进一步搅拌至少2 h，然后过滤，并将滤饼用乙腈(68.4 Kg)和水(87 L)的混合物洗涤。该洗涤液也用于冲洗反应器。将固体在低于55℃下在减压下干燥，得到中间体3(43.44 Kg，73%产率)。
化合物1 (作为游离酸)：4-(4-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4'-哌啶]-1'-羰基)-6-甲氧基吡啶-2-基)苯甲酸
Figure 513817DEST_PATH_IMAGE018
在圆底烧瓶中装入4-(4-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4'-哌啶]-1'-羰基)-6-甲氧基吡啶-2-基)苯甲酸叔丁酯 (3.7 g, 6.6 mmol)和甲苯(25 mL)。在搅拌下滴加85%磷酸(3.0 mL)，并将反应加热至60℃持续4小时。形成无色的粘稠胶状物。将反应冷却至室温，并加入水。观察到白色固体。丢弃甲苯有机层，保留水层和固体。加入乙酸乙酯(60mL)，并加入4N NaOH溶液以将pH调节至约7。分离层，并用乙酸乙酯(50 mL)萃取水层。合并的乙酸乙酯有机层经硫酸钠干燥，过滤，并真空浓缩，以提供白色固体。将这些在50℃下溶于乙酸乙酯(80 mL)中，并缓慢加入庚烷(90 mL)。除去加热，并将混合物冷却至室温，并搅拌16 h。所得固体通过过滤收集，用母液冲洗，并干燥，以提供为白色固体的标题化合物(化合物1游离形式，2.15 g，65%产率)。
化合物1 (作为游离酸)的替代制备：
在20-25℃下在清洁干燥的反应器中装入乙腈(130.4 Kg)和4-(4-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4'-哌啶]-1'-羰基)-6-甲氧基吡啶-2-基)苯甲酸叔丁酯(中间体3, 20.72 Kg)。将混合物搅拌5 min，然后在温和的氮气吹扫下装入对甲苯磺酸(8.5 Kg)。将反应混合物温热至70℃，并在该温度下保持至少6.5 h。完成时，将混合物冷却至40℃，用化合物1(104 g)接种，并经至少1 h缓慢装入水(83 L)。将混合物在40℃下进一步搅拌最少4 h，然后经2 h冷却至20-25℃。进一步搅拌至少2 h，随后过滤，并用乙腈(33 Kg)和水(41L)的溶液冲洗滤饼。该洗涤液也用于冲洗反应器。在低于55℃下在减压下干燥所得固体，以得到化合物1(16.5 Kg，89%产率)。
形式1 –化合物1的无水单-tris的制备：
Figure 305056DEST_PATH_IMAGE019
在小瓶中装入4-(4-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4'-哌啶]-1'-羰基)-6-甲氧基吡啶-2-基)苯甲酸 (151 mg, 0.300 mmol)和3 mL乙醇。将混合物加热至80℃持续5分钟以溶解固体，并且然后冷却至室温。加入三(羟甲基)氨基甲烷(39 mg，0.32mmol)，并将混合物在室温搅拌过夜。滴加庚烷(2.25 mL)以产生浆料，将其加热至50℃以产生澄清溶液。将混合物在搅拌下冷却至室温过夜。观察到白色固体，并将混合物搅拌另外3天。将材料过滤并在50℃下在真空烘箱中干燥过夜，以产生形式1 (151 mg，0.242 mmol，81%产率)。
形式1：化合物1的无水单-tris的替代制备：
在清洁和干燥的反应器中装入乙醇(83 L)，随后加入化合物1(9.43 Kg)和tris(2.55kg)，同时将混合物保持在20-25℃的温度。罐壁用乙醇(2 L)冲洗，并将所得混合物在65-70℃加热，在该温度下保持至少30 min，直到所有固体溶解，然后冷却至45-50℃。通过10 µm在线聚丙烯过滤器进行温热过滤，并用乙醇(9 L)洗涤反应器和过滤器。将正庚烷(24 L)通过相同的在线过滤器装入到温热的溶液中，并在45-50℃下用于乙醇(0.5 L)中的4-(4-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4'-哌啶]-1'-羰基)-6-甲氧基吡啶-2-基)苯甲酸无水tris盐(100 g)接种混合物。将温度保持至少2 h，然后经至少2 h冷却至20-25℃。进行搅拌至少5天。然后将浆料过滤，并将滤饼用乙醇(13 L)和正庚烷(6 L)的混合物洗涤。将固体在低于45℃下在减压下干燥至少12 h，得到实施例1(11.7 Kg，77%)。
形式2 –化合物1的单-tris盐的三水合物的制备：
Figure 7039DEST_PATH_IMAGE020
通过从形式1转化获得形式2。向50 mL EasyMax反应器中加入形式1(1.7214 g，2.760mmol)、异丙醇(16.50 mL，215.8 mmol)和水(688μL，38.190 mmol)。将混合物在25℃的反应器夹套温度下搅拌(300 rpm)约72 hr。然后经15 min将反应混合物温热至40℃，并在40℃下保持约24小时，冷却一次至20℃以取出样品进行测试。通过PXRD看到形式混合物；因此，加入额外的水(688μL，38.190 mmol)。将搅拌速率增加至400 rpm，并且允许浆料搅拌6小时，并且然后冷却至15℃。在60 mL/40 M过滤器上分离固体，并用96/4异丙醇/水洗涤。通过PXRD，所得材料与形式2一致。
形式2 –化合物1的单-tris盐的三水合物的替代制备：
在清洁和干燥的反应器中装入异丙醇(60.4 Kg)，并加入化合物1(16.68 Kg)和tris(4.42 kg)，同时将混合物保持在20-25℃的温度下。将混合物搅拌5 min，然后装入水(6.7Kg)，并将浆料温热至55℃。通过在线10 µm聚丙烯过滤器将现在澄清的溶液过滤到预热的清洁和干燥的反应器(50-55℃)中。然后用三水合物形式的化合物1的单-tris盐(167 g)接种溶液。在确认晶种继续存在后，经至少2 h将混合物冷却至15℃，然后在15℃保持最少16h。将浆料过滤并将滤饼用冷异丙醇(13.1 Kg)洗涤。然后将固体在低于25℃下在减压下干燥，以得到仅形式2(22.1 Kg，98%产率)。
为了确认形式2中三个水分子的存在，使用Bruker D8 Venture衍射仪在室温下收集数据。参见图7。在单斜晶系空间群P21/c中使用SHELX软件套件(5.1版，Bruker AXS，1997)通过本征定相法(intrinsic phasing)来解析结构。随后通过全矩阵最小二乘法细化该结构。使用各向异性位移参数发现并细化所有非氢原子。
从傅里叶差值图中发现位于氮和氧上的氢原子，并在限制距离的情况下细化。将剩余的氢原子置于计算的位置并允许其搭载在它们的载体原子上。
最终的R因子为7.2%。最终的差值傅里叶表明没有遗漏或错位的电子密度。
表10提供关于形式2收集的数据：
表10
经验式 C28H30N4O5 ∙ C4H11NO3 ∙ 3H2O
式量 677.74
温度 RT
波长 1.54178 Å
晶体体系 单斜晶系
空间群 P21/c
晶胞尺寸 a = 17.6927(9) Å α= 90°.
b = 13.2753(7) Å β= 92.451(3)°.
c = 14.6480(8) Å γ = 90°.
体积 3437.3(3) Å3
Z 4
密度(经计算的) 1.310 Mg/m3
F2的拟合优度 1.053
最终R因子[I>2σ(I)] R1 = 0.0723, wR2 = 0.1835
R因子(所有数据) R1 = 0.1244, wR2 = 0.2110。
药代动力学研究：
在雄性(禁食)食蟹猴中进行药代动力学研究(每种制剂n = 2)。制备口服丸剂以比较形式1和形式2。分别地，为了比较化合物1的Tris盐和化合物1的游离酸，制备悬浮液。分别以含有2、5或10 mg/kg的口服剂量施用该剂量。在0、0.25、0.5、1、2、4、7和24小时时间点通过注射器经由股静脉收集系列血液样品，并转移到K3EDTA真空采血管中。然后离心血液样品，收获血浆并储存在-20℃或-80℃直到分析。
用于口服施用的固体片剂：
通过将形式1或形式2与赋形剂的标准掺合物混合来制备口服片剂，所述赋形剂的标准掺合物含有：64重量%的微晶纤维素(Avicel PH102)、32重量%的乳糖一水合物(Fast Flo316)、3重量%的羟基乙酸淀粉钠(Explotab®)和1重量%的硬脂酸镁。将适当量的形式1或形式2转移到研钵中。然后将相应量的赋形剂掺合物几何学地加入到研钵中并使用研杵与单独的形式1或形式2彻底混合。将混合物转移至容器中，并在Turbula混合器上掺和5分钟，以提供含有单独的与赋形剂混合的形式1或形式2的掺合物。对于形式1，掺合物含有19重量%的形式1和81重量%的赋形剂掺合物。对于形式2，掺合物含有21重量%的形式2和79重量%的赋形剂掺合物。
为了制备片剂，将每种掺合物转移至配备有0.2362"标准圆凹模具的Korsch XP-1单站压片机中。以15片/分钟的压制速度压缩片剂，以得到100 mg片重，目标片剂硬度为4至9 kp。
口服施用的悬浮液：
为了制备代表性批次大小的1 L 0.5% (w/v)甲基纤维素(Methocel® A4M)溶液，将约0.4 L去离子水加热至80-90℃，之后加入5克甲基纤维素(Methocel® A4M)并彻底混合直至颗粒彻底润湿。然后将混合物从加热中移出。然后加入冷水(0.6 L)，同时在冰浴中连续搅拌，直到溶解所有的甲基纤维素颗粒。
由游离酸制备的10 mg/mL化合物1悬浮液：将化合物1的游离酸(220 mg)转移到研钵中。使用研杵磨碎固体粉末(块破碎)。将2 mL 0.5% w/v甲基纤维素(Methocel® A4M)滴加到粉末中。将媒介物和游离酸充分混合以形成平滑的糊状物。在混合的同时以小等分试样加入剩余的媒介物，直到获得均匀的悬浮液。使用滴管将该悬浮液转移到30 mL玻璃瓶中，并补足22 mL体积，以实现10 mg/mL的化合物1游离酸浓度。测量pH为6.04。向悬浮液中加入22微升聚山梨醇酯80 (Tween® 80)。获得10 mg/mL化合物1游离酸在0.5% w/v甲基纤维素(Methocel® A4M)、0.1% v/v聚山梨醇酯80 (Tween® 80)中的制剂。
由化合物1的Tris盐制备的2.5 mg/mL化合物1的悬浮液：将形式1 (157 mg)转移至研钵中。使用研杵磨碎固体粉末(块破碎)。将少量的0.5% w/v甲基纤维素(Methocel®A4M)加入到粉末中以形成平滑的糊状物。在混合的同时以小等分试样加入剩余的媒介物，直到获得均匀的悬浮液。将悬浮液转移至容器中，并补足至50 mL的最终体积。观察到一些团块，但在搅拌约1小时后获得轻质悬浮液(light suspension)。
分析数据：
吸湿性：
吸湿性使用TA Instruments或Surface Measurement Systems制造的动态蒸汽吸附仪测量。将每种形式的样品暴露于递增的RH水平，直到达到5分钟内≤0.001%重量变化的重量平衡(视为稳定水平)，或在每个RH水平下120分钟的最大时间。在较短的5分钟内0.001%重量平衡或120分钟后，接着将样品暴露于下一个RH水平。存在初始干燥期，其中对于形式1，重量可能已经损失，对于形式2，不使用干燥。该方法在10% RH开始，RH增加到20% RH，并且然后在每个间隔(5分钟内小于0.001%平衡或120 min，以先发生者为准)后增加10% RH。在90% RH下，使用相同的平衡标准将RH逆转回10% RH。根据在90% RH下测量的重量增加百分比来测量吸湿性。形式1在90%RH/25℃下具有约1%的吸湿性。形式2也在90% RH/25℃下具有约1%的吸湿性。
表2提供的热力学溶解度:
以干燥粉末形式接收表2中鉴定的游离酸或盐形式的化合物1，并预称重到具有0.45μm聚四氟乙烯(PTFE)膜的Whatman Mini-Uniprep非注射式过滤器装置中。将450微升(450μL)的期望培养基加入到过滤器中，并在室温下搅动24小时。24小时后，过滤样品，并将滤液注入氮气检测器中进行定量。
缓冲剂制备：
• pH 1.2：称出1.0 g NaCl并转移到烧杯中。加入约450 mL HPLC级水溶解NaCl。用36.6% HCl滴定溶液至pH 1.2。将溶液转移到500 mL容量瓶中，并用HPLC级水引至500 mL。
• pH 6.5：用约500 mL的50 mM磷酸二氢钠滴定约250 mL的50 mM磷酸氢二钠至pH6.5。最终总体积是当向50 mM磷酸氢二钠中加入50 mM磷酸二氢钠时达到溶液具有pH 6.5的点时的体积。
• pH 7.4：用约50 mL的50 mM磷酸二氢钠滴定约200 mL的50 mM磷酸氢二钠至pH7.4。最终总体积是当向50 mM磷酸氢二钠中加入50 mM磷酸二氢钠时达到溶液具有pH 7.4的点时的体积。
粉末X-射线衍射：
使用配备有Cu辐射源的Bruker AXS D4 Endeavor衍射仪进行粉末X射线衍射分析。将发散狭缝设定在0.6 mm，而第二光学器件使用可变狭缝。衍射辐射通过PSD-Lynx Eye检测器检测。X射线管电压和电流强度分别设定至40 kV和40 mA。在θ-2θ测角仪中，在Cu (k-α平均)为3.0-40.0度2θ下，使用0.037度的步长和10秒的每步时间收集数据。通过将样品放置在硅低背景样品架中并在收集期间旋转来制备样品。使用Bruker DIFFRAC Plus软件收集数据，并通过EVA diffract plus软件(4.2.1版)进行分析。PXRD数据文件在峰搜索之前不进行处理。在EVA软件中使用峰搜索算法，使用以阈值1选择的峰进行初步峰分配。为了确保有效性，手动进行调整；目视检查自动分配的输出，并将峰位置调整至峰最大值。通常选择相对强度≥3%的峰。未选择未解析或与噪声一致的峰。与来自USP中所述的PXRD的峰位置相关的典型误差最多为+/- 0.2° 2-θ(USP-941)。
FT-拉曼：
使用附接到FT-IR工作台的Nicolet NXR FT-拉曼附件收集拉曼光谱。该光谱仪配备有1064 nm Nd:YVO4激光器和液氮冷却的锗探测器。在数据采集之前，使用聚苯乙烯进行仪器性能和校准验证。在光谱收集期间在静止的玻璃NMR管中分析形式1或形式2的样品。将片剂样品收集在片剂样品架中，其分析完整片剂上的一个点。使用0.5W的激光功率和512次共同增加扫描收集光谱。收集范围为3700-100 cm-1。使用2 cm-1分辨率和Happ-Genzel变迹法记录这些光谱。利用上述拉曼方法，与光谱测量相关的可能变化为± 2 cm-1。在环境条件(约23℃和30%-60% RH)下收集样品(纯API和药物产品二者)。形式1应与干燥剂一起储存，而形式2可在环境条件(15-30℃和环境湿度)下储存。
在峰拾取之前将强度标度归一化为1。使用Thermo Nicolet Omnic 9.7.46软件手动鉴定峰。在峰最大值处拾取峰位置，并且如果在每侧上存在斜坡，则仅如此鉴定峰；不包括峰上的肩峰。对于形式1或形式2，在峰拾取期间利用0.004至0.017的绝对阈值，灵敏度为80。使用标准惯例(0.5向上舍入，0.4向下舍入)将峰位置四舍五入到最接近的整数。归一化峰强度在(1-0.75)、(0.74-0.30)、(0.29-0)之间的峰分别标记为强、中和弱。
固态NMR:
在置于Bruker-BioSpin Avance III 500 MHz (1H频率) NMR光谱仪中的Bruker-BioSpin CPMAS探针上进行固态NMR (ssNMR)分析。将形式1材料装入用标准驱动盖密封的4mm转子中，并在环境温度下收集其光谱。将形式2材料装入用含有O形环的驱动盖密封的4mm转子中以防止脱水。在25℃收集形式2光谱(通过PbNO3的化学位移校准)。填充转子以魔角取向并以15.0 kHz旋转。使用质子去耦交叉极化魔角旋转(CPMAS)实验收集13C ssNMR光谱。在光谱采集期间施加80-90 kHz的相位调制质子去耦场。交叉极化接触时间设定至2ms，并且循环延迟设定至10秒。调整扫描次数以获得足够的信噪比。使用13C CPMAS实验在结晶金刚烷外标上参考碳化学位移标度，将其高场共振设定为29.5 ppm (如从纯TMS测定的)。
使用Bruker-BioSpin TopSpin 3.5版软件进行自动峰拾取。通常，5%相对强度阈值用于初步峰选择。目视检查自动峰拾取的输出以确保有效性，并在必要时手动进行调整。尽管本文报告了具体的13C固态NMR峰值，但由于仪器、样品和样品制备的差异，这些峰值的确存在一定范围。由于峰位置固有的变化，这在固态NMR领域中是普遍的实践。对于结晶固体，13C化学位移x轴值的典型变化约为+0.2 ppm。本文报告的固态NMR峰高是相对强度。固态NMR强度会根据CPMAS实验参数的实际设置和样品的热历史而变化。

Claims (18)

1.4-(4-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4'-哌啶]-1'-羰基)-6-甲氧基吡啶-2-基)苯甲酸的结晶2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇盐。
2.权利要求1的结晶盐，其中4-(4-(1-异丙基-7-氧代-1,4,6,7-四氢螺[吲唑-5,4'-哌啶]-1'-羰基)-6-甲氧基吡啶-2-基)苯甲酸和所述盐的比例为1:1。
3.权利要求1或权利要求2的结晶盐，其中所述结晶盐是无水结晶盐。
4.权利要求3的无水结晶盐，其中所述无水结晶盐具有PXRD图，所述PXRD图包括在9.62Ɵ + 0.2º 2Ɵ、10.7 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ和11.3 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ的衍射角处的峰。
5.权利要求3或权利要求4的无水结晶盐，其中所述无水结晶盐具有拉曼光谱，所述拉曼光谱包括在1511 cm-1 + 2 cm-1、1561 cm-1 + 2 cm-1和1615 cm-1 + 2 cm-1处的峰位移。
6.权利要求3至5中任一项的无水结晶盐，其中所述无水结晶盐具有13C ssNMR光谱，所述13C ssNMR光谱包括在22.9 ppm + 0.2 ppm、146.2 ppm + 0.2 ppm和161.9 ppm + 0.2ppm处的化学位移。
7.权利要求3的无水结晶盐，其中所述无水结晶盐具有选自包括在1511 cm-1 + 2 cm-1和1615 cm-1 + 2 cm-1处的峰位移的拉曼光谱和包括在22.9 ppm + 0.2 ppm、146.2 ppm +0.2 ppm或161.9 ppm + 0.2 ppm处的至少一个化学位移的13C ssNMR光谱的分析参数。
8.权利要求1至7中任一项的无水结晶盐，其中所述无水结晶盐是基本上纯的。
9.权利要求1或权利要求2的结晶盐，其中所述结晶盐是三水合物结晶盐。
10.权利要求9的三水合物结晶盐，其中所述三水合物结晶盐具有PXRD图，所述PXRD图包括在8.4 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ、9.0 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ和10.5 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ的衍射角处的峰。
11.权利要求9或权利要求10的三水合物结晶盐，其中所述三水合物结晶盐具有拉曼光谱，所述拉曼光谱包括在1507 cm-1 + 2 cm-1、1557 cm-1 + 2 cm-1和1610 cm-1 + 2 cm-1处的峰位移。
12.权利要求9至11中任一项的三水合物结晶盐，其中所述三水合物结晶盐具有13CssNMR光谱，所述13C ssNMR光谱包括在19.2 ppm + 0.2 ppm、149.5 ppm + 0.2 ppm和163.8ppm + 0.2 ppm处的化学位移。
13.权利要求9的三水合物结晶盐，其中所述三水合物结晶盐具有选自以下的分析参数：
包括在8.4 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ和9.0 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ的衍射角处的峰的PXRD图，
包括在1557 cm-1 + 2 cm-1和1610 cm-1 + 2 cm-1处的峰位移的拉曼光谱，和
包括在19.2 ppm + 0.2 ppm、149.5 ppm + 0.2 ppm或163.8 ppm + 0.2 ppm处的至少一个化学位移的13C ssNMR光谱。
14.权利要求9的三水合物结晶盐，其中所述三水合物结晶盐具有选自包括在8.4 2Ɵ+ 0.2º 2Ɵ和9.0 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ的衍射角处的峰的PXRD图和包括在1507 cm-1 + 2 cm-1、1557 cm-1 + 2 cm-1或1610 cm-1 + 2 cm-1处的至少一个峰位移的拉曼光谱的分析参数。
15.权利要求9的三水合物结晶盐，其中所述三水合物结晶盐具有选自包括在8.4 2Ɵ+ 0.2º 2Ɵ和9.0 2Ɵ + 0.2º 2Ɵ的衍射角处的峰的PXRD图和包括在19.2 ppm + 0.2ppm、149.5 ppm + 0.2 ppm或163.8 ppm + 0.2 ppm处的至少一个化学位移的13C ssNMR光谱的分析参数。
16.权利要求1至2和9至15中任一项的三水合物结晶盐，其中所述三水合物结晶盐是基本上纯的。
17.药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1至16中任一项的结晶盐和药学上可接受的载体。
18.治疗哺乳动物中的选自NAFLD、NASH和T2D的疾病的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的权利要求1至16中任一项的结晶盐。
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