CN111398502A - 一种填充柱用于纯化血清样品中的多种多溴联苯醚及柱子再活化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种填充柱用于纯化血清样品中的多种多溴联苯醚及柱子再活化的方法，属于材料的制备、纯化、生物样品中残留有害物质的检测和材料再生的技术领域。具体方法是，利用填装好的强氧化性柱子不但可以去除水分还可以氧化分解血清中经过提取后残留的小分子脂肪杂质，以达到净化样品中的多溴联苯醚组分的目的，经过使用的柱子活化再生，避免了固废的产生。样品经过柱子纯化后，基质干扰大大降低，样品上机检测前定容体积为20μL，提高目标化合物的可检测浓度和灵敏度，可分离得到16种多溴联苯醚，扩充了血清样品中多种多溴联苯醚的检测种类，适用于临床血清中有害残留物多溴联苯醚的检测分析。
Description
技术领域
本发明属于生物样品中残留的有害物质的纯化、材料再生及检测技术领域，涉及多溴联苯醚的纯化和填充料再生的方法，具体涉及一种用于纯化血清样品中的多溴联苯醚的方法及其应用。
背景技术
多溴联苯醚的英文名为Poly Brominated Diphenyl Ethers(简称PBDEs)，有四溴联苯醚、五溴、六溴、八溴、十溴等209种同系物，其商品多溴联苯醚是一组溴原子数不同的联苯醚混合物，因此被总称为多溴联苯醚。多溴联苯醚可在高温状态下释放自由基，阻断燃烧反应，因此常用于塑料、聚氨酯泡沫塑料及纺织品等作阻燃剂，在产品制造过程中添加到复合材料中去，以提高产品的防火性能。
多溴联苯醚可以通过挥发、渗出等方式释放到外界环境中，广泛分布于水体、沉积物、垃圾、大气等，并随着生物链在生物体内富集和放大。由于其不易分解，可广泛、持久存在于环境，包括空气、水、泥土和食物中，已成为全球性的有机污染物，因此备受关注。
多溴联苯醚会进入人体后，有可能积蓄，也可能发生代谢作用，可能对人体带来健康危害；其危害性表现如下：
1、急性毒性：多溴联苯醚为淡黄色、无特殊气味的粉末状物质，对皮肤无刺激作用。其急性毒性很低，大鼠经口半数致死剂量(LD50)高达5800～ 7400mg/kg。原型物质进入胃肠道后基本上不被吸收，最终由粪便排出。
2、慢性毒性
1)发育毒性。研究表明，由于幼年动物排泄多溴联苯醚的能力低，会造成幼体多溴联苯醚浓度过高而导致组织(包括脑)损伤。胎儿和婴儿在出生前后接触多溴联苯醚，会引起持久性的行为改变。给孕期大鼠持续管饲多溴联苯醚后，可发现胎鼠后肢畸形。
2)干扰内分泌功能。研究还发现，多溴联苯醚能扰乱成年期和发育期哺乳动物的甲状腺系统，使T4代谢紊乱。
3)生殖毒性。低剂量的多溴联苯醚染毒雄性小鼠的精子和精原细胞数量下降。
4)可能致癌。给大鼠染毒1200～2500mg/kg连续20周，肝脏和胰腺的腺瘤发生率增加。
血液是评价机体污染物负荷水平的重要样本，常用作人群负荷水平调查的指示物。但因血液中非极性脂溶性物质PBDEs含量较低，组分复杂且干扰严重，增加了定量分析的难度。另外，血清样品比较难获取，因而对其在人体血清中的蓄积状况研究不多，尤其是关于对血清样品中有害物质残留物多溴联苯醚的纯化分析研究比较少见报道。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种适用于临床血清中有害残留物多溴联苯醚的检测分析方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于纯化血清样品中的多溴联苯醚的方法，包括如下步骤：
1)样品前处理：取血清样品至离心管中，加入回收率指示物、6mol/L HCl 溶液和异丙醇，震荡除去蛋白；再加入甲基叔丁基醚和饱和氯化钾盐水，剧烈震荡15min后离心，静置分层；分离其中的有机相，用甲基叔丁基醚萃取两次，合并萃取后的有机相，通过无水硫酸钠脱水干燥，并在旋转蒸发仪上浓缩，并用氮气干燥，得到待分离样品；按体积比，所述血清：HCl溶液(6M)：异丙醇：甲基叔丁基醚：饱和氯化钾盐水：甲基叔丁基醚＝1:2:6:10:5:10；
2)填充柱活化：用正己烷淋洗填充柱，抽干填充柱待用；所述填充柱下层为硅胶，上层为无水硫酸钠，硅胶和无水硫酸钠的填充高度比为3.5:1，不同填充材料之间通过硅胶垫片分隔；
3)上样：将待分离样品溶解于正己烷中，加入填充柱中，弃去流出液；
4)淋洗：用体积比为二氯甲烷：正己烷＝3:7的淋洗液进行淋洗；
5)洗脱：加入体积比为正己烷：二氯甲烷＝1:1的洗脱液进行洗脱，并收集洗脱液；
6)浓缩：将洗脱液浓缩，并通过氮气体吹干，得到残留物，即纯化后的多溴联苯醚样品。
本发明提供了一种通过吸附柱进行多溴联苯醚的方法，由于血清中的组分复杂，容易对检测结果带来严重干扰，因此对血清样品进行了预处理，通过加入HCl溶液和异丙醇，振荡混匀后使蛋白充分变性絮凝，离心后上清为不含大分子蛋白的溶液；并通过回收率指示物进行回收，可有效降低背景干扰；对血清样品初步纯化的过程还使用了甲基叔丁基醚，其沸点相对更高(沸点55.2℃)，挥发性更低，便于在不同的地方操作，且有效降低了毒性，更安全。然后通过由自组装的具有强氧化性的填充柱去除有机质的水分和小脂肪杂质，得到纯化的多溴联苯醚样品，大大提高了样品的检测精度。一般地，将初步萃取后的样品浓缩至0.5～1mL后用氮气干燥得到待分离样品。检测时将待分离样品溶解于正己烷中，然后按少量多次转入填充柱子，充分淋洗后洗脱检测，即得得到血清中含有的多溴联苯醚。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤1)中所述回收率指示物为BDE-77、 BDE-128和BDE-181。
本发明选用的指示物在检测中的色谱峰峰形好，利于区分，不干扰研究目标化合物的测定。使用三种回收率指示物进行标识，回收率高，回收的种类更多。
进一步地，所述回收率指示物共10μL，各指标物的浓度为20μg/L。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤2)中的填充柱为玻璃材质，内径为 1cm，高10cm；使用前经过铬酸-浓硫酸洗液浸泡6～12小时后，去离子洗涤，鼓风干燥箱烘干，再300～500℃烧3～6小时，冷却，备用。
使用该填充柱时，硅胶和无水硫酸钠的填充高度分别为3.5cm和1cm。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤2)中的硅胶为氧化性硅胶。
进一步地，所述氧化性硅胶的为硅胶和浓硫酸按质量比为2:1混匀制备得到。
进一步地，所述硅胶使用前先在索氏提取仪中用甲醇蒸馏12～48小时，再用正己烷蒸馏12～48小时后，再600℃烧6～12小时，冷却，置于干燥器中待用。
作为本发明的优选实施方式，所述硅胶为100～200目。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤2)中的无水硫酸钠或氯化钾使用前直接在600℃马弗炉烧3～6小时，冷却，置于干燥器待用。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤3)中的上样过程具体为：将待分离样品溶解于1mL正己烷中，转入填充柱子，用1mL体积比为二氯甲烷：正己烷＝3:7的淋洗液进行淋洗，然后按少量多次，收集淋洗液，每次加0.5mL洗涤样品再分多次重新转移至填充柱，淋洗洗涤重上柱过程转移至少3次。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤4)中的淋洗过程为：分别用1mL的淋洗液淋洗3次，收集每次流出的液体重新上柱；再分别用3mL的淋洗液淋洗 2次，最后用4mL的淋洗液再淋洗一次。洗脱速度为10mL/10min。
进一步地，本发明还提供了回收填充材料的方法：将无水乙醇、正己烷溶液加入洗脱后的填充柱，洗涤3次，分别收集上层的硫酸钠和下层硅胶，至于表面皿中，用铝箔纸封盖，于马弗炉600℃烧3～6小时，即获得再生的无水硫酸钠和硅胶填料。
本发明还要求保护所述方法在检测血清中多溴联苯醚的应用。
本发明还提供了一种检测血样中多溴联苯醚的方法，根据所述纯化方法获得纯化后的多溴联苯醚样品，用正己烷复溶残留物，并定容至20μL，通过 GC-NCI-MS检测。
本发明用于纯化血清样品中的多溴联苯醚的方法可操作性更高，能有效去除了血清的基质干扰，降低了有机试剂对样品的污染，以富集效率高、简便快速的分析方法快速实现多种多溴联苯醚的分离。样品上机检测前定容体积为 20μL，提高了目标化合物的可检测浓度，16种多溴联苯醚的回收率大于95％，扩充了血清样品中多种多溴联苯醚的研究种类，对于临床血清中有害残留物多溴联苯醚的检测，分析多溴联苯醚对人体的作用有重要的意义。另外，使用后的填充柱经过活化再生，得到回用的无水硫酸钠和硅胶填充材料，避免了固废的产生，更环保。
附图说明
图1为本发明用于纯化血清样品中的多溴联苯醚的方法的示意图。
图2为新生小牛血清空白GC-NCI-MS检测图谱。
图3为新生小牛血清空白加标GC-NCI-MS检测图谱。
图4为人体血清加标GC-NCI-MS检测图谱。
图5为人体血清加标GC-NCI-MS检测图谱各峰的具体信息和回收率结果。
图6为回收填充柱后不上样的检测结果。
其中，1、铁架台；2、可回收玻璃注射器；3、微孔硅胶板；4、有机试剂； 5、待分离样品；6、无水硫酸钠；7、酸性硅胶；8、收集瓶。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1新生牛血清空白实验和加标回收试验
(一)新生牛血清空白实验
装置和纯化的过程如图1所示(但不含加标示物步骤)，过程如下：
1)样品前处理：取5mL新生小牛血清于50mL聚四氟乙烯圆底旋盖离心管中，加入2mL 6mol/L的HCl溶液，涡旋振荡后加入6mL异丙醇溶液，震荡除去蛋白，然后加入10mL甲基叔丁基醚，5mL饱和氯化钾盐水，剧烈震荡15min，离心，分层，分离出有机相，然后用10mL甲基叔丁基醚再萃取两次，合并有机相，弃去氯化钾溶液。合并后的有机相经无水Na2SO4除水干燥后在旋转蒸发仪上浓缩至约1mL，转移到细胞瓶中, 用柔和的氮气吹干溶剂，放入干燥器中恒重，称量脂肪重量。
2)填充柱活化：用正己烷淋洗填充柱，抽干填充柱待用；所述填充柱下层为氧化性硅胶，上层为无水硫酸钠，硅胶和无水硫酸钠的填充高度为 3.5cm和1cm，不同填充材料之间通过硅胶垫片分隔。
3)上样：用5mL正己烷将上述恒重好的脂肪溶解，并转移到氧化性硅胶柱。
4)淋洗：分三次，每次1mL二氯甲烷(D)/正己烷(H)(V/V)＝3/7洗、转移至硅胶柱，然后再分三次淋洗(共10mLH：D(7：3)[3,3,4mL])。
5)洗脱：加入8mL正己烷-二氯甲烷(1:1,V/V)至填充柱进行洗脱，收集洗脱液。
6)浓缩：将洗脱液旋转浓缩至0.5mL后，转移到细胞瓶中，以柔和的氮气吹至将干，得到残留物，即纯化后的多溴联苯醚样品。
7)检测：将残留物用正己烷复溶，并定容至20μL，通过GC-NCI-MS检测。
小牛血清经过提取分离提纯，并经GC-NCI-MS检测显示，小牛血清几乎没有背景干扰，检测结果见图2。
(二)新生小牛血清加标回收实验
装置和纯化的过程如图1所示。
1)样品前处理：取5mL新生小牛血清于50mL聚四氟乙烯圆底旋盖离心管中，加入回收率指示物10μL(分别含有20μg/L的BDE-77、BDE-128 和BDE-181)，2mL 6mol·L-1的HCl溶液，涡旋振荡后加入6mL异丙醇溶液，震荡离心除去蛋白，然后加入10mL甲基叔丁基醚，5mL饱和氯化钾盐水，剧烈震荡15min，离心，分层，分离出有机相，然后用10 mL甲基叔丁基醚再萃取两次；合并有机相，弃去氯化钾溶液；合并后的有机相经无水Na2SO4除水干燥后在旋转蒸发仪上浓缩至约1mL，转移到细胞瓶中，用柔和的氮气吹干溶剂，放入干燥器中恒重，称量脂肪重量。
2)填充柱活化：用正己烷淋洗填充柱，抽干填充柱待用；所述填充柱下层为氧化性硅胶，上层为无水硫酸钠，硅胶和无水硫酸钠的填充高度为3.5cm和1cm，不同填充材料之间通过硅胶垫片分隔。
3)上样：用5mL正己烷将上述恒重好的脂肪溶解，并转移到氧化性硅胶柱。
4)淋洗：分三次，每次1mL体积比为二氯甲烷(D)：正己烷(H)＝3：7 的淋洗液洗、转移至再生的硅胶柱；然后再用体积比为二氯甲烷：正己烷＝3:7的淋洗液淋洗填充3次，淋洗液共10mL，前两次淋洗分别用3mL 淋洗液，最后一次用4mL淋洗液；
5)洗脱：加入8mL正己烷-二氯甲烷(1:1,V/V)至填充柱进行洗脱，收集洗脱液。
6)浓缩：将洗脱液旋转浓缩至0.5mL后，转移到细胞瓶中，以柔和的氮气吹至将干，得到残留物，即纯化后的多溴联苯醚样品。
7)检测：将残留物用正己烷复溶，并定容至20μL，通过GC-NCI-MS检测。
检测结果见图3，得到的图谱采用面积积分法计算回收率，计算方法如下：
其中，(S)经过回收实验为经纯化后样品检测图谱的面积；(S)不经过回收实验为未经纯化后样品检测图谱的面积。
小牛血清经过加标回收实验，提取分离提纯后的GC-NCI-MS检测，几乎没有背景干扰，计算得到加标物回收率大于95％。
实施例2人体血清实验
过程如下：
1)样品前处理：取1mL广州医科大学采集的人体血清+4mL去离子水于 50mL聚四氟乙烯圆底旋盖离心管中，加入回收率指示物10μL(分别含有20μg/L的BDE-77、BDE-128和BDE-181)，2mL 6mol·L-1的HCl 溶液,涡旋振荡后加入6mL异丙醇溶液，震荡除去蛋白，然后加入10mL 甲基叔丁基醚，5mL饱和氯化钾盐水，剧烈震荡15min，离心，分层，分离出有机相，然后用10mL甲基叔丁基醚再萃取两次，合并有机相，弃去氯化钾溶液；合并后的有机相经无水Na2SO4除水干燥后在旋转蒸发仪上浓缩至约1mL，转移到细胞瓶中，用柔和的氮气吹干溶剂，放入干燥器中恒重，称量脂肪重量。
2)填充柱活化：用正己烷淋洗填充柱，抽干填充柱待用；所述填充柱下层为氧化性硅胶，上层为无水硫酸钠，硅胶和无水硫酸钠的填充高度为 3.5cm和1cm，不同填充材料之间通过硅胶垫片分隔。
3)上样：用5mL正己烷将上述恒重好的脂肪溶解，并转移到氧化性硅胶柱。
4)淋洗：分三次，每次1mL体积比为二氯甲烷(D)：正己烷(H)＝3：7 的淋洗液洗、转移至再生的硅胶柱；然后再用体积比为二氯甲烷：正己烷＝3:7的淋洗液淋洗填充3次，淋洗液共10mL，前两次淋洗分别用3mL 淋洗液，最后一次用4mL淋洗液；
5)洗脱：加入8mL正己烷-二氯甲烷(1:1,V/V)至填充柱进行洗脱，收集洗脱液。
6)浓缩：将洗脱液旋转浓缩至0.5mL后，转移到细胞瓶中，以柔和的氮气吹至将干，得到残留物，即纯化后的多溴联苯醚样品。
7)检测：将残留物用正己烷复溶，并定容至20μL，通过GC-NCI-MS检测。
检测结果见图4、5，回收率的计算方法与实施例1相同。
由结果可得，人体血清经过加标实验，提取分离提纯后进行GC-NCI-MS检测，几乎没有背景干扰，多种多溴联苯醚分离明显。
实施例3填充柱子活化再生试验
经过使用的填充柱，用无水乙醇、正己烷溶液分别淋洗填充柱，分少量多次，每次2-3mL，洗涤3次后，倾泻收集上层结晶的硫酸钠，拆卸填充柱，将硅胶置于表面皿中，铝箔纸封盖，然后分别置于马弗炉600℃烧3h后，冷却得到再生的无水硫酸钠和硅胶填料。将再生的材料按上述方法进行填柱，分三次，每次1mL体积比为二氯甲烷(D)：正己烷(H)＝3：7的淋洗液洗、转移至再生的硅胶柱，然后再用淋洗液分三次淋洗(淋洗液共10mL，淋洗体积分别为3mL、 3mL、4mL])，加入8mL体积比为正己烷：二氯甲烷＝1：1的洗脱液进行洗脱，用玻璃试管收集洗脱液，抽干，氮吹，用正己烷定容至20μL，测程序空白，检测结果见图6。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种用于纯化血清样品中的多溴联苯醚的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)样品前处理：取血清样品至离心管中，加入回收率指示物、6mol/L HCl溶液和异丙醇，震荡除去蛋白；再加入甲基叔丁基醚和饱和氯化钾盐水，剧烈震荡15min后离心，静置分层；分离其中的有机相，用甲基叔丁基醚萃取两次，合并萃取后的有机相，通过无水硫酸钠脱水干燥，并在旋转蒸发仪上浓缩，并用氮气干燥，得到待分离样品；按体积比，所述血清：HCl溶液：异丙醇：甲基叔丁基醚：饱和氯化钾盐水：甲基叔丁基醚＝1:2:6:10:5:10；
2)填充柱活化：用正己烷淋洗填充柱，抽干填充柱待用；所述填充柱下层为硅胶，上层为无水硫酸钠，硅胶和无水硫酸钠的填充高度比为3.5:1，不同填充材料之间通过硅胶垫片分隔；
3)上样：将待分离样品溶解于正己烷中，加入填充柱中，弃去流出液；
4)淋洗：用体积比为二氯甲烷：正己烷＝3:7的淋洗液进行淋洗；
5)洗脱：加入体积比为正己烷：二氯甲烷＝1:1的洗脱液进行洗脱，并收集洗脱液；
6)浓缩：将洗脱液浓缩，并通过氮气体吹干，得到残留物，即纯化后的多溴联苯醚样品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中所述回收率指示物为BDE-77、BDE-128和BDE-181。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的填充柱为玻璃材质，内径为1cm，高10cm；使用前经过铬酸-浓硫酸洗液浸泡6～12小时后，去离子洗涤，鼓风干燥箱烘干，再300～500℃烧3～6小时，冷却，备用。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的硅胶为氧化性硅胶；为100～200目的硅胶和浓硫酸按质量比为2:1混匀制备得到。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述硅胶使用前先在索氏提取仪中用甲醇蒸馏12～48小时，再用正己烷蒸馏12～48小时后，再600℃烧6～12小时，冷却，置于干燥器中待用。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的上样过程具体为：将待分离样品溶解于1mL正己烷中，转入填充柱子，用1mL体积比为二氯甲烷：正己烷＝3:7的淋洗液进行淋洗，收集淋洗液，分多次重新转移至填充柱，淋洗重上柱过程至少3次。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无水硫酸钠或氯化钾使用前直接在600℃马弗炉烧3～6小时，冷却，置于干燥器待用。
8.作为本发明的优选实施方式，所述步骤4)中的淋洗过程为：分别用1mL的淋洗液淋洗3次，收集每次流出的液体重新上柱；再分别用3mL的淋洗液淋洗2次，最后用4mL的淋洗液再淋洗一次。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括回收填充材料的过程，将无水乙醇、正己烷溶液加入洗脱后的填充柱，洗涤3次，分别收集上层的硫酸钠和下层硅胶，至于表面皿中，用铝箔纸封盖，于马弗炉600℃烧3～6小时，即获得再生的无水硫酸钠和硅胶填料。
10.根据权利要求1～9任一项所述方法在检测血清中多溴联苯醚的应用。
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