CN111398434B - 葡萄糖氧化酶活力测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种测定粉色氧化型邻联茴香胺含量的方法以及葡萄糖氧化酶活力测定的方法。其中，测定粉色氧化型邻联茴香胺含量的方法包括：1)将待测粉色氧化型邻联茴香胺进行高效液相色谱检测，2)基于色谱检测结果，确定所述待测粉色氧化型邻联茴香胺的峰面积，以便获知所述待测粉色氧化型邻联茴香胺的含量。该方法简单易行、耗时短、成本低、稳定性好、检测误差小、灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及检测领域，具体地，本发明涉及葡萄糖氧化酶活力测定方法。
背景技术
葡萄糖氧化酶(G1ucose oxidase，E.C.1.1.3.4，简称GOD)是一种需氧脱氢酶，在有氧的情况下，能氧化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，在食品添加剂、动物饲料添加剂、生化检测和生物传感器等方面具有广泛的应用。
目前，葡萄糖氧化酶活力主要的检测方法有气压测定法、滴定法、电化学法和分光光度法等。气压法的原理是葡萄糖氧化酶催化葡萄糖和氧气发生反应，且能在反应中消耗部分氧气，通过测定一定时间内的耗氧量，即可计算酶活力。此方法仅能用于样品中大量葡萄糖氧化酶的检测，对微量的葡萄糖氧化酶无法有效测定；滴定法的原理是葡萄糖氧化酶酶催化葡萄糖生成葡萄糖醛酸，再通过酸碱滴定可以间接测定出葡萄糖醛酸的产量，然后根据葡萄糖醛酸的产生量计算出GOD的酶活力。此方法虽然简单易行，成本低，但是该方法存在检测误差大和灵敏度低的缺点，而且需要进行繁复的移液滴定操作，工作量较大。电化学法的原理是根据酶促反应中的电压或电流的变化来测量氧化还原性酶活力，以氧电极进行测定，然而这个方法容易受到检测液中溶氧和其他电化学活性物质的干扰，从而影响实验结果。分光光度法的原理是在有氧的情况下，葡萄糖氧化酶催化β-D-葡萄糖产生葡萄塘酸和过氧化氢。随后，辣根过氧化物酶(HRP)催化过氧化氢与显色底物发生反应，然后采用分光光度计检测生成的有色物质。虽然分光光度法较为灵敏，但其结果易受到样品中不溶性颗粒及色素等物质的影响，且操作较为繁琐。
因此，建立快速、简便、直观、准确的GOD酶活力检测方法对GOD的质量研究及后续样品酶活力的监测具有重要的意义。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
为了弥补GOD酶活力检测过程的缺陷，增加检测过程的直观性和提高检测结果的准确性，本发明提供了一种葡萄糖氧化酶活力准确定性定量的方法，通过反复验证，建立了较为实用可靠的GOD酶活力检测体系。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种测定粉色氧化型邻联茴香胺含量的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：1)将待测粉色氧化型邻联茴香胺进行高效液相色谱检测，2)基于色谱检测结果，确定所述待测粉色氧化型邻联茴香胺的峰面积，以便获知所述待测粉色氧化型邻联茴香胺的含量，其中，所述高效液相色谱的色谱条件如下所示：
梯度洗脱，梯度洗脱条件为：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 45％ | 55％ |
| 20 | 15％ | 85％ |
| 26 | 15％ | 85％ |
| 26.1 | 45％ | 55％ |
| 40 | 45％ | 55％ |
其中，A为乙酸钠溶液，B为纯甲醇，色谱柱的型号为C30(4.6*250mm)；检测波长为525nm；色谱柱的柱温为26～30℃；流动相的流速：1.0ml/min。发明人发现，在上述高效液相色谱的条件下，测定结果的稳定性高，不受不溶性颗粒及有关色素的影响。根据本发明实施例的方法可高效实现对测定粉色氧化型邻联茴香胺含量的测定，方法简单易行、耗时短、成本低、稳定性好、检测误差小、灵敏度高。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述色谱柱为Welch-C30(4.6*250mm)。
根据本发明的实施例，所述色谱柱的柱温为28℃。
根据本发明的实施例，所述乙酸钠溶液的pH为5.3～5.7，优选为5.5，浓度为80～90mM，优选为86mM。发明人发现，在pH为5.3～5.7、浓度为80～90mM的乙酸钠溶液的条件下，检测结果稳定、准确，在pH为5.5、浓度为86mM的乙酸钠溶液的条件下，检测结果更加稳定、更加准确。
根据本发明的实施例，所述待测粉色氧化型邻联茴香胺进行高效液相色谱检测前进一步包括将待测粉色氧化型邻联茴香胺进行过滤处理。由此，能过滤掉不溶性杂质，排除不溶性颗粒和色素等物质对检测结果的干扰，进一步提高效液相色谱检测的准确度。
根据本发明的实施例，所述过滤处理是通过0.45μm滤膜过滤。进而将直径大于0.45μm的杂质有效过滤去除。
根据本发明的实施例，所述待测粉色氧化型邻联茴香胺是以溶于乙酸钠溶液的形式提供的，所述方法进一步包括将所述乙酸钠溶液作为空白对照进行所述高效液相色谱检测。进而，通过所测出的粉色氧化型邻联茴香胺的出峰面积，排除空白对照所导致的基底峰面积，可更加精确地计算出粉色氧化型邻联茴香胺的出峰面积。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种葡萄糖氧化酶活力测定的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将无色邻联茴香胺在待测葡萄糖氧化酶、葡萄糖、辣根过氧化物酶存在的条件下进行第一氧化反应，以便获得棕色氧化型邻联茴香胺；将所述棕色氧化型邻联茴香胺在盐酸存在的条件下进行第二氧化反应，以便获得粉色氧化型邻联茴香胺；利用前面所述的方法对所述粉色氧化型邻联茴香胺进行高效液相色谱检测；基于色谱检测结果，确定所述粉色氧化型邻联茴香胺的峰面积，以便获知所述待测葡萄糖氧化酶的酶活，其中，所述无色邻联茴香胺、葡萄糖以及盐酸在反应体系中相对于待测葡萄糖氧化酶过量。
根据本发明实施例的GOD酶活检测原理如下所述：
第一步：葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化产生过氧化氢，即：
第二步：过氧化氢在辣根过氧化物酶存在的条件下氧化无色邻联茴香胺，生成棕色氧化型邻联茴香胺，即：
第三步：在盐酸的作用下，棕色氧化型邻联茴香胺进一步氧化生成粉色氧化型邻联茴香胺，即：
根据本发明实施例的上述检测方法具有直观准确的特点，能直观地反映出粉色氧化型邻联茴香胺的峰面积，且粉色氧化型邻联茴香胺的稳定性高，通过优化条件的色谱检测，可实现粉色氧化型邻联茴香胺的准确定性定量，且反应时间短，同时上述方法中涉及的检测条件温和，采用HPLC测定粉色氧化型邻联茴香胺不受不溶性颗粒及有关色素的影响，适用范围广，并且检测中用到的辣根过氧化物酶及GOD的样品量少，成本低。根据本发明实施例的方法简单易行、耗时短、成本低、稳定性好、检测误差小、灵敏度高。此外，根据本发明实施例的方法还可以对GOD酶样品储存过程中的酶活进行监测。
根据本发明的实施例，所述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述待测葡萄糖氧化酶是以待测葡萄糖氧化酶溶液的形式提供的，所述待测葡萄糖氧化酶溶液是通过用乙酸钠溶液溶解待测葡萄糖氧化酶获得的，所述待测葡萄糖氧化酶溶液的浓度为7-105U/mL。待测葡萄糖氧化酶的浓度为7-105U/mL的范围内，与酶活检测时标准品溶解的酶活范围一致，使得检测结果更加准确，并且采用的乙酸钠溶液与高效液相色谱的所采用的流动相一致，可以有效降低溶剂效应对粉色氧化型邻联茴香胺色谱峰型的影响。
根据本发明的实施例，所述乙酸钠溶液的浓度为80～90mM，优选为86mM。利用与高效液相色谱检测时流动相一致的缓冲液进行溶解样品，进行高效液相色谱检测时，粉色氧化型邻联茴香胺色谱峰型更加尖锐。
根据本发明的一个具体实施例，所述无色邻联茴香胺是以溶于甲醇的形式提供的，所述无色邻联回香胺的浓度为1.25g/L，所述葡萄糖是以溶于水的形式提供的，所述葡萄糖的浓度为100g/L，所述辣根过氧化物酶是以溶于水的形式提供的，所述辣根过氧化物酶的浓度为0.4mg/mL。
根据本发明的再一具体实施例，在所述第一氧化反应开始时，相对于0.1mL的所述待测葡萄糖氧化酶溶液，反应体系中所述无色邻联茴香胺、葡萄糖、辣根过氧化物酶的质量比为(3～4)：(20～40)：(0.03～0.05)，优选为3.125：30：0.04。在第一氧化反应开始时，可根据需要(保证反应体系中，无色邻联茴香胺、葡萄糖相对于待测葡萄糖氧化酶过量)，采用合适的质量比，如上面所提到的根据本发明实施例的质量比，将无色邻联茴香胺溶液、葡萄糖溶液以及辣根过氧化物酶溶液以合适的体积加入到反应体系中，使体系发生第一氧化反应。根据本发明实施例，相对于0.1mL的7-105U/mL的待测葡萄糖氧化酶溶液，无色邻联茴香胺、葡萄糖、辣根过氧化物酶的质量比在(3～4)：(20～40)：(0.03～0.05)范围内，反应完全，所获得的检测结果更加真实可靠。
根据本发明的再一具体实施例，所述盐酸以溶于水的形式提供的，所述盐酸的浓度为5mol/L。
根据本发明的再一具体实施例，在所述第二氧化反应开始时，反应体系中加入的盐酸的用量可以与最初第一氧化反应时无色邻联茴香胺的用量进行参比，例如，根据本发明实施例的(0.005～0.02)moL：(3～4)g(盐酸：无色邻联茴香胺)，优选为0.01moL：3.125g。在第一氧化反应结束之后，第二氧化反应开始前，可根据需要(保证反应体系中盐酸相对于待测葡萄糖氧化酶过量)，采用合适的质量比，如上面根据本发明实施例的质量比，将盐酸溶液以合适的体积加入到反应体系中，使体系发生第二氧化反应。根据本发明实施例，相对于0.1mL的7-105U/mL的待测葡萄糖氧化酶溶液，盐酸与无色邻联茴香胺的用量比在(0.005～0.02)moL：(3～4)g范围内，反应充分，所获得的检测结果更加真实可靠。
根据本发明的实施例，所述第一氧化反应是在室温下进行3min。由此，能使得反应更彻底，根据本发明实施例的方法的检测结果更准确。
根据本发明的实施例，所述第二氧化反应是通过涡旋振荡10s进行的。进而，棕色氧化型邻联茴香胺可完全转化为粉色氧化型邻联茴香胺。
根据本发明的实施例，进一步包括将乙酸钠溶液作为空白对照进行所述高效液相色谱检测，所述乙酸钠溶液的浓度与待测葡萄糖氧化酶溶液中乙酸钠的浓度相同。进而，通过所测出的粉色氧化型邻联茴香胺的出峰面积，排除空白对照所导致的基底峰面积，可更加精确地计算出粉色氧化型邻联茴香胺的出峰面积。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种葡萄糖氧化酶活力测定的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将无色邻联茴香胺在待测葡萄糖氧化酶与葡萄糖、辣根过氧化物酶存在的条件下进行第一氧化反应，以便获得棕色氧化型邻联茴香胺，所述待测葡萄糖氧化酶是以待测葡萄糖氧化酶溶液的形式提供的，所述待测葡萄糖氧化酶溶液是通过用乙酸钠溶液溶解待测葡萄糖氧化酶获得的，所述待测葡萄糖氧化酶溶液的浓度为7-105U/mL；将所述棕色氧化型邻联茴香胺在盐酸存在的条件下进行第二氧化反应，以便获得粉色氧化型邻联茴香胺；将粉色氧化型邻联茴香胺通过0.45μm滤膜进行过滤处理；将所述粉色氧化型邻联茴香胺进行高效液相色谱检测，所述高效液相色谱采用梯度洗脱，梯度洗脱条件为：
其中，A为乙酸钠溶液，B为纯甲醇，色谱柱的型号为C30(4.6*250mm)；检测波长为525nm；色谱柱的柱温为26～30℃；流动相的流速：1.0ml/min；基于色谱检测结果，确定粉色氧化型邻联茴香胺的峰面积，以便获知所述待测葡萄糖氧化酶的酶活，其中，所述无色邻联茴香胺、葡萄糖以及盐酸在反应体系中相对待测葡萄糖氧化酶过量；同时，进一步包括将所述乙酸钠溶液作为空白对照进行所述高效液相色谱检测，所述乙酸钠溶液的浓度与溶解所述待测葡萄糖氧化酶的乙酸钠溶液的浓度相同，所述乙酸钠溶液的pH为5.3～5.7，优选为5.5，浓度为80～90mM，优选为86mM。发明人发现，利用根据本发明实施例的方法具有直观准确的特点，能直观地反映出粉色氧化型邻联茴香胺的峰面积，且粉色氧化型邻联茴香胺的稳定性高，进而可实现对粉色氧化型邻联茴香胺的准确定性定量，同时上述方法中涉及的反应条件温和，反应时间短，采用HPLC测定粉色氧化型邻联茴香胺不受不溶性颗粒及有关色素的影响，适用范围广，并且检测中用到的辣根过氧化物酶及GOD的样品量少，成本低。根据本发明实施例的方法的简单易行、耗时短、成本低、稳定性好、检测误差小、灵敏度高。此外，根据本发明实施例的方法还可以对GOD酶样品储存过程中的酶活进行监测。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述色谱柱为Welch-C30(4.6*250mm)。根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：获得标准曲线，所述标准曲线的获得是通过如下方式进行的：1)利用前面所述的方法测定葡萄糖氧化酶标准溶液中葡萄糖氧化酶的活力，其中，所述葡萄糖氧化酶溶液的浓度分别为105U/mL、52U/mL、26U/mL、13U/mL、6U/mL，2)以粉色氧化型邻联茴香胺的峰面积为横坐标，以葡萄糖氧化酶的酶活为纵坐标绘制标准曲线。由此，利用所述标准曲线计算得到的待测葡萄糖氧化酶的酶活结果准确。
根据本发明的实施例，根据所述标准曲线，能得到所述待测葡萄糖氧化酶的酶活的计算公式为：
U液体＝(K*A+C)*N，
其中，A为待测葡萄糖氧化酶所得到的粉色邻联茴香胺的峰面积，K为标准曲线的斜率，C为标准曲线的截距，N为酶的稀释倍数，M为待测葡萄糖氧化酶的质量，U固体是指待测葡萄糖氧化酶固体样品中的酶活，U液体是指待测葡萄糖氧化酶溶液中的酶活。由此，计算出的待测葡萄糖氧化酶的酶活结果准确。根据本发明的具体实施例，所述待测葡萄糖氧化酶溶液是这样获得的：称取一定质量M的待测葡萄糖氧化酶，所称取的待测葡萄糖氧化酶为固体样本，进而将一定质量M的待测葡萄糖氧化酶溶于乙酸钠中，形成待测葡萄糖氧化酶溶液，其中，根据上述公式可获得的待测葡萄糖氧化酶溶液中的酶活U液体，进而可获知待测葡萄糖固体样品中的酶活U固体。
根据本发明的实施例，本发明的检测方法粉色氧化型邻联茴香胺含量的方法和检测葡萄糖氧化酶活力的方法具有以下优势至少之一：
1)本发明所建立的HPLC测定方法具有直观准确的特点，能直观反映出反应产物粉色氧化型邻联茴香胺的峰面积，以实现对其准确定性定量，且反应时间较短，产物稳定性好。
2)在本发明中，反应条件温和，采用HPLC测定产物不受不溶性颗粒及有关色素的影响，适用范围广。同时，检测中用到的过氧化物酶及葡萄糖氧化酶标品量少，成本较低，方法稳定性好。
附图说明
图1是根据本发明实施例的HPLC检测过程中绘制的标准曲线图；
图2是根据本发明实施例的UV检测过程中绘制的标准曲线图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在下列实施例中所采用的材料均为已知的并且可以通过商业手段获得的。为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。
需要说明的是，在本发明中，“无色”、“棕色”、“粉色”是指邻联茴香胺在不同的环境下自身所呈现的颜色，而不包括人为添加色素或显色剂等调配出或其他非邻联茴香胺显示的颜色，例如，邻联茴香胺本身是无色的，但是在过氧化氢以及辣根过氧化物酶的作用下会被氧化形成棕色氧化型邻联茴香胺(指此时氧化型邻联茴香胺自身呈现为棕色)，而棕色氧化型邻联茴香胺则会在盐酸的作用下，生成粉色氧化型邻联茴香胺(指此时氧化型邻联茴香胺自身呈现为粉色)。
在本发明的上下文中，所有在此公开了的数字均为近似值。每一个数字的数值有可能会出现1％、2％、5％、7％、8％或10％差异。每当公开一个具有N值的数字时，任何具有N+/-1％，N+/-2％，N+/-3％，N+/-5％，N+/-7％，N+/-8％或N+/-10％值以内的数字会被明确地公开，其中“+/-”是指加或减。每当公开一个数值范围中的一个下限，DL，和一个上限，DU，时，任何处于该公开了的范围之内的数值会被明确地公开。
在本发明中，GOD酶活定义为：在温度为25℃和pH5.5条件下，葡萄糖氧化酶1min催化葡萄糖氧化产生1μg过氧化氢所需的酶量，即为一个酶活力单位(IU)。
根据本发明的具体实施例，葡萄糖氧化酶活力的检测方法的一般步骤:
在测定酶活力之前，先要配制pH5.5的86mM的乙酸钠溶液、100g/L的葡萄糖溶液，用甲醇配制1.25g/L的邻联茴香胺储存液，采用超纯水配制0.4mg/mL的辣根过氧化物酶和5mol/L的盐酸溶液，具体操作如下：
(1)在反应前，先进行粉色氧化型邻联茴香胺峰面积—葡萄糖氧化酶活力标准曲线的绘制。吸取配制好的葡萄糖氧化酶标准品溶液，依次稀释成约105U/ml、52U/ml、26U/ml、13U/ml、6U/ml的标准品系列溶液。通过验证，在该范围内，GOD的酶活与产物的峰面积呈良好的线性关系。
(2)在10mL离心管中依次加入2.5mL邻联茴香胺、0.3mL葡萄糖溶液、0.1mL辣根过氧化物酶溶液，混合均匀后，分别加入上述不同浓度的葡萄糖氧化酶标准溶液0.1mL，混合后加入5mol/L的盐酸溶液2mL，振荡均匀冷却至室温，过0.45μm滤膜，采用HPLC在525nm处测定其粉色氧化型邻联茴香胺的峰面积。以粉色氧化型邻联茴香胺峰面积为横坐标，葡萄糖氧化酶活力为纵坐标绘制标准曲线。
(3)对待测样品进行处理，固体样品精密称取100mg于25mL容量瓶中，采用醋酸盐缓冲液溶解并定容至刻度，临用时采用醋酸盐缓冲液稀释至适当倍数；液体样品直接采用醋酸盐缓冲液稀释至适当倍数。稀释后的样品中葡萄糖氧化酶的活力控制在7～105U/mL之间。
(4)反应时，在10mL离心管中依次加入2.5mL邻联茴香胺、0.3mL葡萄糖溶液、0.1mL辣根过氧化物酶溶液，混合均匀后，加入待测GOD酶溶液0.1mL，立即振荡，室温下反应3min后，加入5mol/L的盐酸溶液2mL终止反应，振荡均匀后冷却至室温，过0.45μm滤膜，采用HPLC在525nm处测定其粉色氧化型邻联茴香胺的峰面积，以缓冲液做空白对照，利用粉色氧化型邻联茴香胺峰面积—葡萄糖氧化酶活力标准曲线计算待测样品中的葡萄糖氧化酶活力。
(5)高效液相色谱检测条件
色谱柱：Welch-C30(4.6*250mm 5um)；波长：525nm；柱温：26～30℃；流速：1.0ml/min；运行时间：40min；流动相：A：80～90mM乙酸钠溶液(pH5.3～5.7)；B：甲醇；洗脱梯度如表1所示。
表1：洗脱梯度
| 时间(min) | A | B |
| 0 | 45％ | 55％ |
| 20 | 15％ | 85％ |
| 26 | 15％ | 85％ |
| 26.1 | 45％ | 55％ |
| 40 | 45％ | 55％ |
下面介绍本发明的具体实施例。
实施例1
具体检测条件如下所述，其余操作同上述一般方法：
色谱柱：Welch-C30(4.6*250mm 5um)；波长：525nm；柱温：28℃；流速：1.0ml/min；运行时间：40min；流动相：A：86mM乙酸钠溶液(pH5.5)；B：甲醇；洗脱梯度如表2所示。
表2：洗脱梯度
| 时间(min) | A | B |
| 0 | 45％ | 55％ |
| 20 | 15％ | 85％ |
| 26 | 15％ | 85％ |
| 26.1 | 45％ | 55％ |
| 40 | 45％ | 55％ |
标准品酶活及峰面积的检测结果见表3，以产物的峰面积为横坐标，标品的酶活(U/mL)为纵坐标，制作标准曲线，见图1，将待测液进行HPLC检测后所得的峰面积代入标准曲线，即可求得相应待测液的酶活，其中待测样品的峰面积及酶活的结果见表4。
U液体＝(K*A+C)*N
A：待测液产物峰面积；K：标准曲线的斜率；C：标准曲线的截距；N：酶的稀释倍数；M：称取的待测酶粉重量；U固体：固体样品的酶活；U液体：液体样品的酶活。
表3：标品酶活及峰面积
| 峰面积 | 酶活(U/mL) |
| 2331389 | 100 |
| 1485996 | 50 |
| 762009 | 25 |
| 416172 | 12.5 |
| 223185 | 6.25 |
表4：待测样品峰面积及酶活
| 样品信息 | 峰面积 | 酶活(U/mg) |
| BO-170526-1 | 760850 | 47.29 |
实施例2
在本实施例中，发明人进一步调整柱温、乙酸钠溶液浓度和pH，以期优化或获得色谱检测的合理范围、
在调整柱温、乙酸钠溶液浓度、pH的情况下，发明人在评价单因素色谱条件对检测结果的影响时，固定除待评价的单因素色谱条件外的其余检测条件同实施例1，调整待评价的单因素色谱条件。
实验时，每个条件下标品溶液、样品溶液与空白溶液各进1针，记录色谱图，报告主峰面积，并计算酶活。结果如表5所示，当改变以上条件后，酶活测定值与正常条件偏差小于10％。即该方法在柱温为28±2℃、乙酸钠溶液浓度为80～90mM、pH为5.5±0.2范围内是耐用的，并且可以保证对酶活检测的准确性。
表5：耐用性考察结果
另外，在上述色谱检测条件下，发明人将C30色谱柱更换为普通C18柱，发现，C30色谱柱具有更高的分离度，能最大限度地排除相关杂质的影响，而普通C18柱，目标峰与杂质峰难以分开，影响定量结果的准确性。
同时，发明人在保持单变量变化的前提下，进一步调整了注温、乙酸钠溶液的浓度或乙酸钠溶液的pH，发现，当柱温高于30℃，乙酸钠溶液浓度低于80mM或pH低于5.3时，酶活检测值呈现明显的偏低趋势；反之，当柱温低于26℃，乙酸钠溶液浓度高于90mM或pH高于5.7时，酶活检测值呈现明显的偏高趋势，偏低或偏高的幅度均会高于10％，超过控制范围，造成检测结果不准。
对比例1
在本对比例中，发明人利用现有的分光光度法对葡萄糖氧化酶进行活力检测。具体步骤如下所示：
(1)UV检测：用1cm比色皿，在波长525nm处，以不加酶液的反应液作参比，空白调零，测定待测液的吸光度A。以产物的吸光度(Abs)为横坐标，标品的酶活(U/mL)为纵坐标，制作标准曲线，结果见表6和图2，将待测液进行UV检测后所得的吸光度代入标准曲线，即可求得相应待测液的酶活。
U液体＝(K*A+C)*N
A：待测液吸光度；K：标准曲线的斜率；C：标准曲线的截距；N：酶的稀释倍数；M：称取的待测酶粉重量；U固体：固体样品的酶活；U液体：液体样品的酶活。
表6：
| 吸光度(Abs) | 酶活(U/mL) |
| 0.8902 | 105.85 |
| 0.45795 | 52.425 |
| 0.2307 | 26.2 |
| 0.12965 | 13.1 |
| 0.0619 | 6.55 |
| 0.026 | 3.275 |
发明人利用实施例1所描述的方法和本对比例1所描述的方法，检测相同样品(样品编号为406-17001-BO)的酶活，检测结果如下表7和表8所示。
表7：
表8：
可见，本申请的方法所检测的酶活与现有技术-分光广度法所检测的酶活一致，说明本申请的检测方法所获得的检测结果准确，但本申请的方法，检测步骤更加简单，不易受不溶性颗粒及色素等物质的影响，检测方法更加稳定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (13)
1.一种葡萄糖氧化酶活力测定的方法，其特征在于，包括：
将无色邻联茴香胺在待测葡萄糖氧化酶、葡萄糖、辣根过氧化物酶存在的条件下进行第一氧化反应，以便获得棕色氧化型邻联茴香胺；
将所述棕色氧化型邻联茴香胺在盐酸存在的条件下进行第二氧化反应，以便获得粉色氧化型邻联茴香胺；利用如下方法对所述粉色氧化型邻联茴香胺进行高效液相色谱检测，所述方法包括：
1）将待测粉色氧化型邻联茴香胺进行高效液相色谱检测，
2）基于色谱检测结果，确定所述待测粉色氧化型邻联茴香胺的峰面积，以便获知所述待测粉色氧化型邻联茴香胺的含量，
其中，所述高效液相色谱的色谱条件如下所示：
梯度洗脱，梯度洗脱条件为：
其中，A为乙酸钠溶液，B为纯甲醇，
色谱柱的型号为C30，4.6*250 mm；
检测波长为525 nm；
色谱柱的柱温为26~30℃；
流动相的流速：1.0 ml/min；
所述乙酸钠溶液的pH为5.3~5.7，浓度为80~90 mM；
基于色谱检测结果，确定所述粉色氧化型邻联茴香胺的峰面积，利用粉色氧化型邻联茴香胺峰面积—葡萄糖氧化酶活力标准曲线，确定待测样品中所述待测葡萄糖氧化酶活力，
其中，所述无色邻联茴香胺、葡萄糖以及盐酸在反应体系中相对于待测葡萄糖氧化酶过量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为Welch-C30，4.6*250 mm；
所述色谱柱的柱温为28℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乙酸钠溶液的pH为5.5，浓度为86 mM。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测粉色氧化型邻联茴香胺进行高效液相色谱检测前进一步包括将待测粉色氧化型邻联茴香胺进行过滤处理。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述过滤处理是通过0.45 μm滤膜过滤。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测粉色氧化型邻联茴香胺是以溶于乙酸钠溶液的形式提供的，所述方法进一步包括将所述乙酸钠溶液作为空白对照进行所述高效液相色谱检测。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测葡萄糖氧化酶是以待测葡萄糖氧化酶溶液的形式提供的，所述待测葡萄糖氧化酶溶液是通过用乙酸钠溶液溶解待测葡萄糖氧化酶获得的，所述待测葡萄糖氧化酶的浓度为7-105 U/mL。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述乙酸钠的浓度为86mM。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述第一氧化反应开始时，相对于0.1mL的所述待测葡萄糖氧化酶溶液，反应体系中所述无色邻联茴香胺、葡萄糖、辣根过氧化物酶的质量比为（3~4）：（20~40）：（0.03~0.05）；
在所述第二氧化反应开始时，所述盐酸的与无色邻联茴香胺的用量比为（0.005~0.02）moL：（3~4）g。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，反应体系中所述无色邻联茴香胺、葡萄糖、辣根过氧化物酶的质量比为3.125：30：0.04；所述盐酸的与无色邻联茴香胺的用量比为0.01 moL：3.125 g。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
进一步包括将乙酸钠溶液作为空白对照进行所述高效液相色谱检测，所述乙酸钠溶液的浓度与待测葡萄糖氧化酶溶液中乙酸钠的浓度相同。
12.根据权利要求1-11任一项所述的方法，其特征在于，进一步包括：获得标准曲线，所述标准曲线的获得是通过如下方式进行的：
1）利用权利要求1-11任一项所述的方法测定葡萄糖氧化酶标准溶液中葡萄糖氧化酶的活力，其中，所述葡萄糖氧化酶标准溶液的浓度分别为105 U/mL、52 U/mL、26 U/mL、13U/mL、6 U/mL，
2）以粉色氧化型邻联茴香胺的峰面积为横坐标，以葡萄糖氧化酶的酶活为纵坐标绘制标准曲线。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，根据所述标准曲线，能得到所述待测葡萄糖氧化酶的酶活的计算公式为：
，
其中，A为待测葡萄糖氧化酶所得到的粉色邻联茴香胺的峰面积，K为标准曲线的斜率，C为标准曲线的截距，N为酶的稀释倍数，M为待测葡萄糖氧化酶的质量，U固体是指待测葡萄糖氧化酶固体样品中的酶活，U液体是指待测葡萄糖氧化酶溶液中的酶活。
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| GR01 | Patent grant | ||
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