CN111393400A - 一种从罗汉果籽仁中制备角鲨烯、维生素e及甾醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从罗汉果籽仁中制备角鲨烯、维生素E及甾醇的方法，具体是包括了萃取，皂化，多次析晶和分离，对析出物和母液分别进行处理，以高收率，高纯度得到了角鲨烯、维生素E及甾醇三种产品。本发明提供的工艺除了浸提和皂化在相对较高条件进行，其余工艺都在较低的温度，且无反应剧烈的条件下进行，对目标活性物质的破坏极小，对设备的腐蚀性也非常小。且结晶是获得高含量物质的主要手段之一，通过结晶工艺，条件温和，含量高，品相好，以罗汉果籽仁为原料，制备高含量角鲨烯的同时，可同时分离出多种活性成分。

Description

一种从罗汉果籽仁中制备角鲨烯、维生素E及甾醇的方法

技术领域

本发明涉及罗汉果籽仁天然有效成分的分离方法，具体涉及一种从罗汉果籽仁中制备角鲨烯、维生素E及甾醇的方法。

背景技术

中药罗汉果为葫芦科，罗汉果，植物罗汉果的干燥果实，是广西自治区特色药用植资源。几年来，国内外对其化学成分、有效成分都做了诸多研究，但都主要集中在天然甜味剂以及药理等方面。同时由于罗汉果天然甜味物质都集中在果壳及果瓤，其籽仁都完整的被保留下来，且作为废弃物处理了。据悉，罗汉果籽仁含有48.5wt％油脂，油脂中含不饱和脂肪较多，籽仁以角鲨烯(十六碳六烯)为主，占籽仁油的51.21wt％，同时还含有大量的维生素E和甾醇等活性物质。

从植物中提取角鲨烯，是获其的重要来源之一，角鲨烯是一种全反式三萜烯化合物，为淡黄色不溶于水的油状液体，角鲨烯在常温下为一种无色油状液体，不溶于水，难溶于甲醇、乙醇和冰醋酸，易溶于乙醚、石油醚、丙酮、四氯化碳等有机溶剂。角鲨烯具有提高体内超氧化物歧化酶(SOD)活性、增强机体免疫能力、改善性功能、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤等多种生理功能，是一种无毒性的具有防病治病作用的生物活性物质。

维生素E(Vitamin E)是一种脂溶性维生素，其水解产物为生育酚，是最主要的抗氧化剂之一。溶于脂肪和乙醇等有机溶剂中，不溶于水，对热、酸稳定，对碱不稳定，对氧敏感，对热不敏感，但油炸时维生素E活性明显降低。能促进性激素分泌，使男子精子活力和数量增加；使女子雌性激素浓度增高，提高生育能力，预防流产，还可用于防治男性不育症、烧伤、冻伤、毛细血管出血、更年期综合症、美容等方面。近来还发现维生素E可抑制眼睛晶状体内的过氧化脂反应，使末梢血管扩张，改善血液循环，预防近视眼发生和发展。

植物甾醇，是从玉米、大豆等中经过物理提纯而得，具有营养价值高、生理活性强等特点。植物甾醇可通过降低胆固醇减少心血管病的风险。其广泛应用在食品、医药、化妆品、动物生长剂及纸张加工、印刷、纺织等领域，特别是在欧洲作为食品添加剂非常普遍，广泛用于食品中以降低人体胆固醇。

现有技术中有一些关于从从植物中中提取角鲨烯等有效成分的文献。

CN105016956公开了一种提取角鲨烯的方法，具体是将富含角鲨烯的植物油脱臭馏出物酯化和转酯化反应，液体进行蒸馏得到维生素E和角鲨烯馏分，而后色谱分离和蒸发得到原料，然后将原料进行二次结晶、蒸发、色谱分离从而得到高纯度角鲨烯、维生素E及甾醇。该方法步骤极其繁琐，同时涉及到多次高温蒸发操作，对热敏成分角鲨烯等易造成破坏，直接导致收率低下。

CN1670005公开了罗汉果的种仁或种籽破碎后制备角鲨烯的方法，具体为用有机溶剂将罗汉果种仁会种籽中的脂溶性物质浸提，而后除去有机溶剂，硅胶层析和洗脱，减压除去有机溶剂即得角鲨烯产品。该方法得到的角鲨烯含量较低，且色谱柱处理能力小，其他成分也未分离出来。

CN106748615公开了一种从油脂中提取角鲨烯的方法，具体为利用甘油和脂肪酶对油脂进行甘油解，环糊精包合甘油解产物，乙醇回流解得到角鲨烯粗品，最后氧化铝吸附分离得到角鲨烯。该方法对酶解条件要求苛刻，甘油解-环糊精包合技术尚不成熟，且色谱柱分离能力小，其他成分也未分离出来。

CN105777477公开了一种提取高纯度角鲨烯的方法，具体为将植物脱臭馏出物或初步提纯物溶解于极性/非极性溶剂的上相溶剂中，而后通过高速逆流色谱进行分离得到角鲨烯产品。该方法对设备要求极高，高速逆流色谱，难以适用于大规模的工业化生产，而且未能充分利用色谱分离对其他充分进行分离。

CN1077778277公开了一种回收角鲨烯、维生素E和/或甾醇的方法，具体为混合物极性/非极性吸附，得到含角鲨烯的液相，其固相与极性混合分离后再次结晶得到甾醇或维生素E。该方法对原料的要求较高，只适合某种成分含量较高的原料，对同时含多种成分的原料，难以实现单独的分离。而且该法获得产品含量较低。

CN103288571公开了一种混合生育酚中角鲨烯的分离提取方法，具体为硅胶柱层析然后用混合溶剂进行洗脱，并分段收集。该方法对原料要求较高，生育酚和角鲨烯含量要高，且硅胶层析处理量有限，且需要分段收集，操作繁琐。

CN103804337公开了一种多级逆流液-液萃取法提取维生素E和角鲨烯的工艺，具体为以植物油脂精炼时的脱臭馏出物为原料，经过酯化反应、甘油解反应、短程蒸馏、多级逆流液-液萃取，除去极性溶剂得到维生素E，非极性溶剂冷析得到甾醇，而后除去非极性溶剂得到角鲨烯。该方法涉及到蒸馏高温，对热敏性成分极易造成破坏。

CN101830770公开了一种从植物油脱臭馏出物中提取角鲨烯的方法，具体为皂化、二级分子蒸馏、结晶回收甾醇、溶剂反复萃取分离角鲨烯和维生素E。该方法涉及到二级分子蒸馏，高温极易造成热敏成分降解，同时同一萃取反复萃取难以进一步提高的角鲨烯的含量及维生素E，直接导致分离的成分含量不高。

CN105949025公开了一种吸附分离植物油脱臭馏出物中角鲨烯的方法，具体为将植物油脱臭馏出物用D101进行吸附后，用脱附剂进行洗脱，浓缩干燥即得。由于D101是广谱性吸附树脂，对各种尤其是黄酮类、皂苷类吸附效果好，故而该方法得到产品成分复杂，含量低。

CN110283034公开了一种从植物油脱臭馏出物中获取高纯度角鲨烯的方法，具体为将植物油脱臭馏出物进行酯化和酯交换反应，取剩余液进行分离，阴离子交换树脂分离角鲨烯，皂化，结晶，得到角鲨烯。该方法中阴离子交换树脂处理量有限，且反复多次设计到反应条件剧烈的环境，高温强碱等，如脱臭、酯化、蒸馏、皂化等工艺，直接会导致目标成分降解。

CN102089263公开了一种植物油的脱臭馏出物和/或物理精炼冷凝物中所有的角鲨烯、甾醇和维生素E的提取方法。具体为将原料的脂肪酸、甘油酯等转化，分步蒸馏、结晶分离得到维生素E，酯转化蒸馏达到角鲨烯，结晶得到甾醇。该方法涉及到分步蒸馏，其反复多次高温对热敏成分直接造成破坏，影响收率。

上述方法中有的反复多次涉及到高温，及强碱条件，对各热敏成分破坏大，有的则只是针对角鲨烯进行分离，其他成分则未进行分离，直接造成浪费，有的对原料要求较为苛刻，应用范围狭窄，还有对工艺的设备要求高，处理能力也极其有效，不适合规模化生产。

在罗汉果籽仁中同时高收率，高纯度的提取制备角鲨烯，维生素E及甾醇，未见有文献报道。

因此，开发一种从罗汉果籽仁中制备角鲨烯、维生素E及甾醇的方法，同时对罗汉果籽仁中其它高附加值的成分进行有效分离，实现罗汉果籽仁的资源化再利用，延长罗汉果周边产品线，提高罗汉果相关产品的经济价值具有重要的研究意义和经济价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种针对罗汉果籽仁为原料，制备高含量角鲨烯的同时，可同时分离出多种活性成分的适于工业化的生产方法，且所得的各种活性成分含量高、收率高，实现罗汉果籽仁的资源化再利用，延长罗汉果周边产品线，提高罗汉果相关产品的经济价值。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种从罗汉果籽仁中制备角鲨烯、维生素E及甾醇的方法，包括以下步骤：

(1)萃取：将罗汉果籽仁破碎、干燥，加入有机溶剂进行萃取，得到萃取液。

(2)皂化：将萃取液回收有机溶剂后，加入碱性醇溶液，进行皂化，取不皂化物。

(3)析晶1：向不皂化物中加入醇/石油醚混合溶剂，恒温搅拌，过滤，回收石油醚，得到析出物A和母液A。

(4)析晶2：将析出物A加入酮/水的混合溶剂，恒温搅拌，过滤，回收丙酮，得到析出物B和母液B，将得到的析出物B用冷水淋洗，干燥后即得到角鲨烯。

(5)析晶3：将步骤3得到的母液A冷却，得到析出物C和母液C，将得到的析出C用冷醇淋洗，干燥后即得到甾醇。

(6)析晶4：将步骤5得到的母液C加入水，恒温搅拌，而后回收醇，冷却，得到析出物D，分离析出物D，冷水淋洗并干燥，即得维生素E。

罗汉果籽仁是由制备罗汉果甜味剂浸提后的残渣，为新鲜罗汉果或不限于烘烤干燥方式的干罗汉果的籽仁中的任意一种，其中角鲨烯、维生素E及甾醇的含量较低，其中角鲨烯、维生素E及甾醇的质量含量分别为0.5-1％、0.1-0.3％和0.4-1.2％，回收难度大，成本高，一般作为废弃物进行处理，造成资源的浪费。

步骤(1)中，所述破碎为过10～30目，所述干燥为微波干燥、鼓风干燥或自然晒干中的任意一种。罗汉果的深加工主要分为鲜果和干果两种，其鲜果为主，主要直接以水为溶媒进行提取甜味剂罗汉果皂苷，其产生大量的提取渣基本上都直接作肥料处理，且其籽仁未经破碎处理，其大量未被水浸提的脂溶性物质被白白浪费。而干果则以整果形式销售，其籽相对较难收集。但无论何种果实得到籽仁，其都是经过水提而得到的，其脂溶性物质都被很好的保留在籽仁中。所以，籽仁经过适当的破碎之后，其脂溶性物质就能很好的通过有机溶剂浸提出来。

优选地，步骤(1)中，所述有机溶剂为低极性有机溶剂，选自石油醚、正己烷中的至少一种，有机溶剂的体积用量为罗汉果籽仁的重量的3～10倍(L/kg)萃取方式为回流，温度为40～80℃，萃取时间为2～8h。油脂、角鲨烯、维生素E及甾醇等脂溶性物质能很好的被有机溶剂浸提出来，且适当的温度既能提高浸出率，也能在较低的温度下尽量减少活性物质的破坏。

优选地，步骤(2)中，所述回收有机溶剂的方式为减压蒸馏，至无明显有机溶剂气味，即得到罗汉果油脂。具体减压蒸馏是在-0.05至-0.2MPa压力下，在40-80℃下减压蒸馏，优选在-0.08至-0.1MPa压力下，在50-60℃下减压蒸馏。

优选地，步骤(2)中，皂化方式为向得到的罗汉果油脂加入碱性醇溶液，恒温回流皂化。所述碱性醇溶液为碱性无机物和乙醇的溶液，比如氢氧化钠和/或氢氧化钾与90-100％乙醇的混合物，混合物中氢氧化钠和/或氢氧化钾的质量分数为5～15％。进一步优选地，所述碱性醇溶液的体积加入量为油脂体积的5～10倍(V/V)，皂化温度为80～95℃，时间为1～4h。

萃取液中含有大量的油脂，其油脂可与碱发生水解反应而生产高级脂肪酸钠盐及甘油，向反应液中加入醇是为了促进油脂的溶解性，加快反应速度，促使反应更为完全。油脂皂化后，其中尚有一些物质如固醇、高分子醇、碳氢化合物、色素和脂溶性维生素等不溶于水而溶于有机溶剂中，这些物质统称为不皂化物。

优选地，步骤(2)中，不皂化物的分离方式为向皂化液中加入有机溶剂，并充分搅拌混合后，静置分层，取上层有机溶剂相，并置于低温静置，析出沉淀，除去沉淀，回收有机溶剂后，即得到不皂化物。

进一步优选地，所述不皂化物分离所用有机溶剂为石油醚和正己烷中的至少一种，低温为-4～10℃，所述除去沉淀的方式为离心或过滤，所述回收有机溶剂方式为减压蒸馏。皂化后的反应液中加入有机溶剂，且充分搅拌，是为了更好的将皂化反应液中脂不溶性物质进行分离，将萃取相进行低温静置，是为了促进未充分分离的杂质进行再次析出，进一步分离。

优选地，步骤(3)中，不皂化物加入醇/石油醚的混合溶剂，优选为乙醇/石油醚(沸程30-60℃)混合溶剂，乙醇与石油醚的体积比例为1:3～5，乙醇与石油醚混合溶剂加入量为不皂化物的5～8倍(V/V)。

进一步的，步骤(3)中恒温为10～50℃，时间为4～12h，回收石油醚为减压蒸馏，压力为-0.1～-0.5Mpa，温度为30～60℃，石油醚回收至无明显煤油气味。

优选地，步骤(3)中，所述析出物A的分离包括但不限于过滤、离心中的任何一种方式，譬如减压抽滤、蝶式离心、卧式离心等。

优选地，步骤(4)中，所述酮/水的混合溶剂为丙酮/水混合溶剂，其体积加入量为析出物A质量的15～30倍(L/kg)，丙酮与水的体积比例为1:3～5，恒温为30～55℃，时间为4～12h，回收丙酮为减压蒸馏，真空度为-0.1～-0.5Mpa，温度为40～80℃，丙酮回收至无明显有机溶剂气味。

优选地，步骤(4)中，所述析出物A的分离包括但不限于过滤、离心中的任何一种方式，譬如减压抽滤、蝶式离心、卧式离心等。

优选地，步骤(4)中，所述冷水温度为0～10℃，淋洗至淋洗液无明显气味和颜色。干燥为真空减压干燥，真空度为-0.1～-0.5Mpa，温度为60～80℃。

向得到粗角鲨烯的结晶中再次加入丙酮水溶液，角鲨烯等脂溶性及水溶性物质再次复溶，而后再次对丙酮进行回收，其角鲨烯由于不溶于水而再次结晶析出，实现第二次结晶，进一步提高了含量。同时用冷水对结晶进行洗涤，也是为了洗掉附在结晶上的其他杂质，同时不影响角鲨烯的收率。

所以，将粗角鲨烯通过以上有机相结晶和水相结晶，分别将绝大多数的脂溶性和水溶性杂质实现到了有效分离，实现了高含量角鲨烯的纯化。且两次结晶过程中都在相对条件较为温和的条件进行，有效的避免高温对角鲨烯、维生素E及甾醇的高温破坏。

优选地，步骤(5)中，所述冷却温度为-4～4℃，静置时间为4～12h，所述析出物C的分离为但不限于过滤、离心中的任何一种方式，譬如减压抽滤、蝶式离心、卧式离心等。

优选地，步骤(5)中，所述冷醇为温度为-4～4℃的乙醇，淋洗至淋洗液无明显颜色。干燥为真空减压干燥，真空度为-0.1～-0.5Mpa，温度为60～80℃。

冷却结晶也是获得高含量物质的主要手段，将含有甾醇的母液A通过冷却，即可从溶解于醇相的甾醇析晶出来，将析晶分离出来后，用冷醇再淋洗后，即可得到含量较高的甾醇。

优选地，步骤(6)中，所述水的体积加入量为母液C体积的0.5～5倍，恒温搅拌的温度为30～60℃，回收乙醇为减压蒸馏，真空度为-0.1～-0.5Mpa，温度为50～90℃，回收至无明显有机溶剂气味。

优选地，步骤(6)中，所述冷却为温度0～10℃，所述析出物D的分离为但不限于过滤、离心中的任何一种方式，譬如减压抽滤、蝶式离心、卧式离心等。

母液C为醇相，其含有大量的维生素E等醇溶性物质，加入一定的水，使其混溶后，回收乙醇至无醇味，其水不溶性物质维生素E则会开始析晶出来，分离出析晶并用冷水淋洗后，即可得到含量较高的维生素E。

本发明方法的原理是：

通过有机溶剂浸提罗汉果籽仁，将含有目标物质角鲨烯、维生素E及甾醇与其他油脂一起浸提出来，而后通过皂化，将油脂除去，目标物质等留在不皂化物中，对不皂化物再次进行萃取，将目标物萃取至萃取液中，即加入乙醇和低沸程石油醚的混合物，而后再除去石油醚后，不溶于乙醇的角鲨烯实现第一次结晶而析出，而维生素E及甾醇等则溶于乙醇而实现的分离。将第一次结晶的粗角鲨烯再次溶于丙酮与水的混合物中，在除去丙酮后，不溶于水的角鲨烯再次结晶析出，从而实现二次纯化。

所以，将粗角鲨烯通过以上有机相结晶和水相结晶，分别将绝大多数的脂溶性和水溶性杂质实现了有效分离，实现了高含量角鲨烯的纯化。且两次结晶过程中都在相对条件较为温和的条件进行，有效的避免高温对角鲨烯、维生素E及甾醇的高温破坏。

将含有维生素E及甾醇的乙醇溶液进行冷却静置，即可将甾醇冷却析晶，从而得到含量较高的甾醇。而其乙醇母液加入水，回收乙醇后，其不溶于水的维生素E则会析出结晶，从而实现了维生素E的分离。

整个工艺除了浸提和皂化在相对较高条件进行，其余工艺都在较低的温度，且无反应剧烈的条件下进行，对目标活性物质的破坏极小，对设备的腐蚀性也非常小。且结晶是获得高含量物质的主要手段之一，通过结晶工艺，条件温和，含量高，品相好。

本发明方法的有益效果如下：

一、本发明所得产品，三种主要成分的含量和收率都较高，具体而言，罗汉果角鲨烯的含量≥95％，收率≥85％；罗汉果维生素E的含量≥95％，收率≥80％；罗汉果角鲨烯的含量≥90％，收率≥75％。

二、本发明方法提供了一种从罗汉果籽仁中制备角鲨烯、维生素E及甾醇的方法，可以通过多次分步结晶的方法，实现角鲨烯、维生素E及甾醇的有效分离，是对罗汉果废弃物籽仁的一种综合利用方法。

三、本发明方法整个工艺除了浸提和皂化在相对较高条件进行，其余工艺都在较低的温温度，且无反应剧烈的条件下进行，对目标活性物质的破坏极小，对设备的腐蚀性也非常小。且结晶是获得高含量物质的主要手段之一，通过结晶工艺，条件温和，含量高，品相好。

四、本发明的方法是一种适合工业化大规模推广的生产方法，工艺过程可操作性强，成本低，含量和收率高，还实现了罗汉果渣资源的高效综合利用，适宜于工业化生产。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

本发明实施例所使用的罗汉果籽仁由华诚生物资源股份有限公司提供，其中，鲜果籽仁是由制备罗汉果甜味剂浸提后的废弃物，其籽仁中角鲨烯、维生素E及甾醇的质量含量分别为0.64％、0.24％和0.59％；干籽仁是由鲜罗汉果通过微波干燥获得，其籽仁中角鲨烯、维生素E及甾醇的质量含量分别为0.93％、0.38％和1.01％。本发明实施例所使用的原料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。

本发明实施例中，采用高效液相(HPLC)外标法测定罗汉果角鲨烯、维生素E的含量，气-质联用测定甾醇的含量。

实施例1

(1)萃取：取罗汉果鲜果籽仁20kg，利用破碎机粉碎，至全部过20目筛网，后置于60℃鼓风干燥箱内干燥8h，加入80L石油醚，搅拌均匀，置于60℃温度进行回流浸提8h后，板框压滤得到萃取液。

(2)皂化：将步骤(1)得到的萃取液在真空度为-0.08Mpa、温度60℃条件回收有机溶剂，得到3.53L油状物。向油状物中加入20L、氢氧化钠浓度为10wt％的氢氧化钠乙醇(95％)混合物中，在温度为90℃持续搅拌的条件下，皂化4h，得皂化液。向皂化液中加入8L石油醚，搅拌均匀后静置4h，取上层有机相冷却至0℃并静置2h，过滤得到液体后在真空度为-0.08Mpa、温度60℃条件回收有机溶剂，得到2.75L油状不皂化物。

(3)析晶1：向2.72L不皂化物中加入13.6L的乙醇石油醚混合物(石油醚沸程为30～60℃，乙醇：石油醚体积比为1:3)，在恒温30℃条件下搅拌6h，过滤，然后真空度为-0.09Mpa、温度30℃条件回收石油醚，将浓缩液冷却至室温，过滤分别收集析出物和母液。

(4)析晶2：向步骤3得到的326.2g析出物加入8L丙酮与水的混合物(丙酮与水的体积比为：1:3)，并置于50℃恒温搅拌4h，过滤，而后在然后真空度为-0.09Mpa、温度40℃条件回收丙酮，将浓缩液冷却至室温后，过滤得到析出结晶，用0℃水淋洗结晶后，在真空度为-0.1Mpa、温度60℃条件干燥，即得120.63g角鲨烯产品。

(5)析晶3：向步骤3得到的母液冷却至0℃，并静置10h结晶，离心得到析晶，并用0℃乙醇淋洗至无色后，置于在真空度为-0.1Mpa、温度60℃条件干燥，即得101.37g甾醇产品。

(6)析晶4：向步骤5得到的母液中加入2L水，并置于40℃恒温搅拌4h，而后在真空度为-0.09Mpa、温度60℃条件回收乙醇，并浓缩至20brix，将浓缩液冷却至室温后析晶，过滤得到结晶，用0℃水淋洗结晶后，在真空度为-0.1Mpa、温度65℃条件干燥，即得43.67g维生素E产品。

经检测计算得到：角鲨烯产品含量为98.30％，收率为92.64％；维生素E产品含量为95.30％，收率为86.71％；甾醇产品含量为92.91％，收率为79.81％。

实施例2

(1)萃取：取罗汉果干果籽仁20kg，利用破碎机粉碎，至全部过8目筛网，加入120L石油醚，搅拌均匀，置于50℃温度进行回流浸提8h后，板框压滤得到萃取液。

(2)皂化：将步骤(1)得到的萃取液在真空度为-0.1Mpa、温度50℃条件回收有机溶剂，得到3.71L油状物。向油状物中加入25L、氢氧化钠浓度为10％的氢氧化钠乙醇(95％)混合物中，在温度为80℃持续搅拌的条件下，皂化2h，得皂化液。向皂化液中加入6L正己烷，搅拌均匀后静置6h，取上层有机相冷却至4℃并静置8h，过滤得到液体后在真空度为-0.1Mpa、温度50℃条件回收有机溶剂，得到2.83L油状不皂化物。

(3)析晶1：向2.85L不皂化物中加入22.8L的乙醇石油醚混合物(石油醚沸程为30～60℃，乙醇：石油醚体积比为1:5)，在恒温10℃条件下搅拌12h，过滤，然后真空度为-0.1Mpa、温度50℃条件回收石油醚，将浓缩液冷却至室温，过滤分别收集析出物和母液。

(4)析晶2：向步骤3得到的342.6g析出物加入6L丙酮与水的混合物(丙酮与水的体积比为：1:5)，并置于55℃恒温搅拌6h，过滤，而后在然后真空度为-0.1Mpa、温度35℃条件回收丙酮，将浓缩液冷却至室温后，过滤得到析出结晶，用10℃水淋洗结晶后，在真空度为-0.1Mpa、温度55℃条件干燥，即得176.27g角鲨烯产品。

(5)析晶3：向步骤3得到的母液冷却至0-4℃，并静置8h结晶，离心得到析晶，并用4℃乙醇淋洗至无色后，置于在真空度为-0.1Mpa、温度55℃条件干燥，即得176.83g甾醇产品。

(6)析晶4：向步骤5得到的母液中加入1L水，并置于50℃恒温搅拌5h，而后在真空度为-0.1Mpa、温度50℃条件回收乙醇，并浓缩至15brix，将浓缩液冷却至室温后析晶，过滤得到结晶，用4℃水淋洗结晶后，在真空度为-0.1Mpa、温度50℃条件干燥，即得68.02g维生素E产品。

经检测计算得到：角鲨烯产品含量为98.42％，收率为93.27％；维生素E产品含量为95.83％，收率为85.77％；甾醇产品含量为91.90％，收率为80.45％。

实施例3

(1)萃取：取罗汉果鲜果籽仁20kg，利用破碎机粉碎，至全部过16目筛网，后置于80℃鼓风干燥箱内干燥4h，加入100L正己烷，搅拌均匀，置于60℃温度进行回流浸提8h后，板框压滤得到萃取液。

(2)皂化：将步骤(1)得到的萃取液在真空度为-0.09Mpa、温度55℃条件回收有机溶剂，得到3.46L油状物。向油状物中加入30L、氢氧化钠浓度为12％的氢氧化钠乙醇(95％)混合物中，在温度为85℃持续搅拌的条件下，皂化4h，得皂化液。向皂化液中加入8L正己烷，搅拌均匀后静置3h，取上层有机相冷却至20℃并静置4h，过滤得到液体后在真空度为-0.09Mpa、温度55℃条件回收有机溶剂，得到2.68L油状不皂化物。

(3)析晶1：向2.68L不皂化物中加入17L的乙醇石油醚混合物(石油醚沸程为30～60℃，乙醇：石油醚体积比为1:4)，在恒温50℃条件下搅拌4h，过滤，然后真空度为-0.09Mpa、温度50℃条件回收石油醚，将浓缩液冷却至室温，过滤分别收集析出物和母液。

(4)析晶2：向步骤3得到的323.7g析出物加入5L丙酮与水的混合物(丙酮与水的体积比为：1:4)，并置于30℃恒温搅拌12h，过滤，而后在然后真空度为-0.08Mpa、温度50℃条件回收丙酮，将浓缩液冷却至室温后，过滤得到析出结晶，用0℃水淋洗结晶后，在真空度为-0.1Mpa、温度60℃条件干燥，即得120.06g角鲨烯产品。

(5)析晶3：向步骤3得到的母液冷却至4℃，并静置10h结晶，离心得到析晶，并用-4℃乙醇淋洗至无色后，置于在真空度为-0.1Mpa、温度60℃条件干燥，即得100.35g甾醇产品。

(6)析晶4：向步骤5得到的母液中加入0.5L水，并置于30℃恒温搅拌8h，而后在真空度为-0.08Mpa、温度60℃条件回收乙醇，并浓缩至20brix，将浓缩液冷却至室温后析晶，过滤得到结晶，用2℃水淋洗结晶后，在真空度为-0.08Mpa、温度60℃条件干燥，即得43.39g维生素E产品。

经检测计算得到：角鲨烯产品含量为97.82％，收率为91.75％；维生素E产品含量为95.31％，收率为86.35％；甾醇产品含量为92.13％，收率为78.35％。

实施例4

其他步骤和操作和实施例1一致，区别在于步骤(3)中加入的乙醇石油醚混合物中，乙醇：石油醚的体积比为1：2。最终所得产品角鲨烯产品含量为96.23％，收率为83.52％；维生素E产品含量为92.28％，收率为84.62％；甾醇产品含量为89.53％，收率为76.16％。

实施例5

其他步骤和操作和实施例1一致，区别在于步骤(3)中加入的乙醇石油醚混合物中，乙醇：石油醚的体积比为1：6。最终所得产品角鲨烯产品含量为93.63％，收率为91.38％；维生素E产品含量为93.61％，收率为82.26％；甾醇产品含量为87.35％，收率为72.60％。

实施例6

其他步骤和操作和实施例1一致，区别在于步骤(3)中加入的乙醇石油醚混合物用量为10L。最终所得产品角鲨烯产品含量为91.57％，收率为88.63％；维生素E产品含量为94.73％，收率为78.83％；甾醇产品含量为89.62％，收率为71.32％。

实施例7

其他步骤和操作和实施例1一致，区别在于步骤(3)中加入的乙醇石油醚混合物用量为25L。最终所得产品角鲨烯产品含量为97.24％，收率为89.52％；维生素E产品含量为92.15％，收率为83.38％；甾醇产品含量为91.63％，收率为73.52％。

对比例1

其他步骤和操作和实施例1一致，区别在于步骤(3)中加入的乙醇石油醚混合物替换为乙醚/石油醚混合溶剂，乙醚和石油醚体积比1:3。最终所得产品角鲨烯产品含量为86.35％，收率为81.24％；维生素E产品含量为88.73％，收率为75.85％；甾醇产品含量为86.45％，收率为63.37％。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细制备方法，但本发明并不局限于上述详细制备方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细制备方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种从罗汉果籽仁中制备角鲨烯、维生素E及甾醇的方法，包括以下步骤：

(1)萃取：将罗汉果籽仁破碎、干燥，加入有机溶剂进行萃取，得到萃取液；

(2)皂化：将萃取液回收有机溶剂得到罗汉果油脂，加入碱性醇溶液，进行皂化，取不皂化物；

(3)析晶1：向不皂化物中加入醇/石油醚混合溶剂，恒温搅拌，过滤，回收石油醚，得到析出物A和母液A；

(4)析晶2：将析出物A加入酮/水混合溶剂，恒温搅拌，过滤，回收酮，得到析出物B和母液B，将得到的析出物B用冷水淋洗，干燥后即得到角鲨烯；

(5)析晶3：将步骤3得到的母液A冷却，得到析出物C和母液C，将得到的析出物C用冷醇淋洗，干燥后即得到甾醇；

(6)析晶4：将步骤5得到的母液C加入水，恒温搅拌，而后回收醇，冷却，得到析出物D，分离析出物D，冷水淋洗并干燥，即得维生素E。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述有机溶剂为低极性有机溶剂，选自石油醚、正己烷中的至少一种，有机溶剂的体积用量为罗汉果籽仁重量的3～10倍(L/kg)萃取方式为回流，温度为40～80℃，萃取时间为2～8h。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，皂化方式为向得到的罗汉果油脂加入碱性醇溶液，恒温回流皂化。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述碱性醇溶液为碱性无机物和乙醇的溶液，所述碱性醇溶液的体积加入量为油脂体积的5～10倍(V/V)，皂化温度为80～95℃，时间为1～4h；优选地，所述碱性醇溶液为氢氧化钠和/或氢氧化钾与90-100％乙醇的混合物，混合物中氢氧化钠和/或氢氧化钾的质量分数为5～15％。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，不皂化物的分离方式为向皂化液中加入有机溶剂，并充分搅拌混合后，静置分层，取上层有机溶剂相，并置于低温静置，析出沉淀，除去沉淀，回收有机溶剂后，即得到不皂化物。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述醇/石油醚混合溶剂为乙醇/石油醚(沸程30-60℃)混合溶剂，乙醇与石油醚的体积比例为1:3～5，乙醇与石油醚混合溶剂加入量为不皂化物的5～8倍(V/V)。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中恒温为10～50℃，时间为4～12h。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述酮/水的混合溶剂为丙酮/水混合溶剂，其体积加入量为析出物A质量的15～30倍(L/kg)，丙酮与水的体积比例为1:3～5，恒温为30～55℃，时间为4～12h。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述冷却温度为-4～4℃，静置时间为4～12h，所述冷醇为温度为-4～4℃的乙醇，淋洗至淋洗液无明显颜色。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述水的体积加入量为母液C体积的0.5～5倍，恒温搅拌的温度为30～60℃；和/或

所述冷却为温度0～10℃；

所述淋洗为冷水，温度为0～4℃。