CN111387209B - 一种防控烟草病害的复合拮抗菌剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种防控烟草病害的复合拮抗菌剂及其应用。本发明基于前期发现的抗病物质和筛选的拮抗菌，通过开发“增效拮抗菌剂”充分发挥抗病增殖作用并实现防控技术简化，为烟叶生产发展提供技术支撑。研究发现所开发的增效拮抗菌剂对烟草种子萌发和生长具有促进作用；在盆栽条件下，增效拮抗菌剂能显著性增强土传病害烟草青枯病防治效果，施用增效拮抗菌剂组对青枯病的相对防治效果为60.87％；对黑胫病相对防效为60.32％。从最大叶长、最大叶宽、株高、茎直径等数据分析，增效拮抗菌剂能显著促进烟株生长。

Description

一种防控烟草病害的复合拮抗菌剂及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种防控烟草病害的复合拮抗菌剂及其应用。
背景技术
由于湖北省主栽的烟草品种较为单一，遗传上同质化趋势日益明显，导致病原物选择压力增大，不断产生致病力更强的种群或小种；过量施用化肥和农药，烟田土壤中有益微生物减少，生态多样性遭到严重破坏，为病原菌提供了赖以生存的寄主和繁殖场所，次要病害逐渐上升为主要病害，复合侵染现象日益严重。上述问题的出现，致使土传病害、赤星病已成为武陵秦巴生态区主要的烟草病害。
目前，针对这两大类病害防治，项目组前期进行了微生物生防菌剂的研发，筛选获得了一些拮抗菌，取得了一定的防治成效，但由于土壤和生态环境的复杂性，许多拮抗微生物在田间的定殖和扩繁困难，从而降低甚至丧失应有的生防功能。因此，挖掘、拓展新的具有作物亲和性、地域性、适应性强的功能性菌种，研制形成良好抗逆性(耐干燥、耐酸碱、耐盐分、耐储藏、耐低温、耐高温)的生防菌剂至关重要。本研究针对以上问题，基于前期发现的抗病物质和筛选的拮抗菌，以期通过开发“增效拮抗菌剂”充分发挥抗病增殖作用并实现防控技术简化，为烟叶生产发展提供技术支撑。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种防控烟草病害的复合拮抗菌剂及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一种防控烟草病害的复合拮抗菌剂，包括复合拮抗菌和增效成分，所述增效成分包括壳聚糖、万寿菊根茎水提物和氨基寡糖素。
进一步地，所述复合拮抗菌为四种芽孢杆菌混合的芽孢粉，所述四种芽孢杆菌分别为ZM9，DH9，ZH2和YH-22，按质量比ZM9:DH9:ZH2:YH-22＝1:1:1:1混合(各菌株均为本实验室筛选，且已经在文章[Bo Wua,Xiao Wang,Liang Yang,Huan Yang,Heng Zeng,YiminQiu,Chang jun Wang,Jun Yu,Jinping Li,Dihong Xu,Zhili He,Shouwen Chen.Effectsof Bacillus amyloliquefaciens ZM9 on bacterial wilt and rhizosphere microbialcommunities of tobacco.Applied Soil Ecology 103(2016)1–12.]披露。
进一步地，复合拮抗菌剂是将混匀后的复合拮抗菌与壳聚糖，万寿菊根茎水提取物和氨基寡糖素按照，芽孢粉:壳聚糖:万寿菊根茎提取物:氨基寡糖素＝1:1:1:1混合而成。
如上述的一种防控烟草病害的复合拮抗菌剂在制备促进烟草和/或番茄种子萌发的试剂，或制备调控烟草和/或番茄植株高度的试剂中的应用。
如上述的一种防控烟草病害的复合拮抗菌剂在制备促进烟株生长的试剂中的应用。
进一步地，所述烟株生长包括烟草的株高、叶片长宽和茎秆直径中的至少一种。
如上所述的一种防控烟草病害的复合拮抗菌剂在制备青枯病害防治试剂中的应用。
如上所述的一种防控烟草病害的复合拮抗菌剂在制备黑胫病害防治试剂中的应用。
如上所述的一种防控烟草病害的复合拮抗菌剂在改善烟田土壤理化性质中的应用。
如上述的一种防控烟草病害的复合拮抗菌剂在改善烟草根际土壤中的微生物群落丰富度中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
1.增效拮抗菌剂对烟草种子萌发和生长具有促进作用
分析了增效拮抗菌剂施用方式对烟草种子萌发和生长的影响，结果表明，不同浓度增效拮抗菌剂(100％、75％、50％、25％)对烟草种子发芽均有一定促进效果。施用100％、75％、50％、25％浓度增效拮抗菌剂的种子发芽促进率相较于对照分别增加了10.43％、6.16％、3.32％，4.74％。相较于对照，加入增效拮抗菌剂发酵液后的烟草长势增加，增长率为57.197％。
2.增效拮抗菌剂显著性增强青枯病害防治效果
为了检测增效拮抗菌剂对土传病害青枯病的防治效果，在盆栽条件下，统计分析了土壤中青枯菌病原菌丰度变化、青枯病发病率、病情指数、相对防治效果。结果表明，增效拮抗菌剂能显著抑制土传病害烟草青枯病发生，增效拮抗菌剂组的平板菌落数显著低于对照及其他处理；增效拮抗菌剂显著性增强土传病害烟草青枯病防治效果，施用增效拮抗菌剂组的青枯发病率、病情指数均显著低于对照组，较对照分别降低了72％、27.19％。综合5次重复实验，增效拮抗菌剂能显著性增强土传病害烟草青枯病防治效果，施用增效拮抗菌剂组的青枯相对防治效果高达60.87。
3.增效拮抗菌剂显著性增强黑胫病害防治效果
为了检测增效拮抗菌剂对土传病害黑胫病的防治效果，在盆栽条件下，统计分析了黑胫病发病率、病情指数、相对防治效果。结果表明，增效拮抗菌剂能显著抑制土传病害烟草黑胫病的发生，施用增效拮抗菌剂组的黑胫发病率、病情指数均显著低于对照组，较对照分别降低76％、24.22％。综合5次重复实验，施用增效拮抗菌剂组的黑胫相对防治效果高达60.32％。
4.增效拮抗菌剂显著性促进烟株生长
为了检测增效拮抗菌剂对烟株的促生效果，在盆栽条件下，统计分析了烟株移栽后7天、14天、21天、28天、35天、42天的农艺性状。结果表明，增效拮抗菌剂能显著促进烟株生长，施用增效拮抗菌剂组的最大叶长、最大叶宽、株高、茎直径均高于对照组。
5.增效拮抗菌剂对烟草青枯病大田防效
为了检测增效拮抗菌剂对土传病害青枯病的防治效果，在田间，于移栽后统计分析了烟株青枯病发病情况，结果表明，增效拮抗菌剂相较于其他处理对烟草青枯病的抑制率最高。防效为67.13％。施用增效拮抗菌剂组的青枯发病率、病情指数均低于对照组，较对照分别降低了19.70％、15.16％。
6.增效拮抗菌剂对烟草青枯病烟田土壤理化性状指标
分析了不同烟叶种植时期和不同处理条件下碱解氮、速效磷、速效钾、pH、有机质、全氮、交换性钙、交换性镁、有效铁、有效锰、有效铜和有效锌等烟草根际土壤的理化性质，结果表明，增效拮抗菌剂(T1)施用后速效磷急剧上升，达到96.70mg/kg，速效钾和有效锌的含量也明显增加，而且有机质、交换性钙、有机质和交换性镁也小幅度增加，但未达显著水平。pH、全氮和有效铜等维持稳定；复合拮抗菌(T2)和增效成分壳聚糖(T3)处理后的各项烟草根际土壤的理化性质指标均不及增效拮抗菌剂。综上可知，增效拮抗菌剂的施用能够显著改善青枯病烟田土壤理化性质，维持土壤稳态。
7.增效拮抗菌剂对烟草青枯病土壤微生物群落的影响
青枯病为主要的细菌性土传病害，增效拮抗菌剂施用后，烟草根际土壤微生物群落多样性、物种丰度以及微生物多样性与土壤微理化性状和病原菌丰度等的相关性发生了一系类变化。施用增效拮抗菌剂(T1)后根际土壤特有的OTUs为904个，相较于施用复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)的OTUs分别增加了43.69％和26.33％。土壤有益菌的数量存在T1＞T2＞T3＞CK的趋势，增效拮抗菌剂处理后，在烟草移栽后期，烟草根际土壤中的微生物群落丰富度增加。通过土壤微生物和土壤理化性质的相关性分析可知，土壤有益菌和病害拮抗菌在增效拮抗菌的处理下呈现出显著正相关的生长趋势，极大地抑制了农作物的土壤有害菌的传播。
8.增效拮抗菌剂对烟草黑胫病土壤微生物群落的影响
进行了不同烟叶种植时期和不同处理条件下，烟草根际土壤微生物群落多样性、物种丰度以及土壤理化性质参数与土壤微生物的相关性分析等。结果表明，在烟草种植后期，土壤有益菌和病害拮抗菌在增效拮抗菌的处理下呈现出显著正相关的生长趋势。增效拮抗菌剂处理后，T1组的物种丰富度最高，说明增效拮抗菌剂的施用，增加了烟草根际微生物的多样性。在烟草移栽后期，CK的群落多样性差异最明显，其次是T2处理，T3处理的群落多样性低于T1处理，说明菌剂的施用后，拮抗黑胫病的土壤微生物群落趋于稳定。
附图说明
图1是不同菌剂处理后烟草和番茄生长情况a：对照组烟草发芽生长情况；b：增效拮抗菌处理后烟草发芽生长情况；c:番茄经增效拮抗菌处理(左)和不处理(右)条件生长情况；
图2是不同处理条件下土壤青枯病病原菌丰度统计；(a,b,c和d分别为CK,T1,T2和T3处理组土壤青枯病病原菌丰度)；
图3是不同处理条件下青枯病发病率和病情指数；(a:发病率统计结果；b:病情指数统计结果)；
图4是不同处理条件下黑胫病发病率和病情指数；(a:发病率统计结果；b:病情指数统计结果)；
图5是不同时间不同处理下烟草的农艺性状分析(CK为对照，T1为增效拮抗菌剂，T2为复合拮抗菌；a:最大叶长，b:最大叶宽，c:株高，d:茎直径；t1:移栽后7天，t2：移栽后14天，以此类推)；
图6是拮抗烟草青枯病的烟田土壤理化性质(a,b,c,d,e,f,g,h,I,j,k,l分别为碱解氮、速效磷、速效钾、pH、有机质、全氮、交换性钙、交换性镁、有效铁、有效锰、有效铜和有效锌的含量)；
图7是拮抗烟草黑胫病的烟田土壤理化性质(a,b,c,d,e,f,g,h,I,j,k,l分别为碱解氮、速效磷、速效钾、pH、有机质、全氮、交换性钙、交换性镁、有效铁、有效锰、有效铜和有效锌的含量)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明披露了一种防控烟草病害的复合拮抗菌剂及其应用，本发明的增效拮抗菌成分包括：复合拮抗菌(ZM9，DH9，ZH2和YH-22芽孢杆菌芽孢粉，具有抑制烟草青枯病和黑胫病特性)；增效成分包括壳聚糖，万寿菊根茎水提取物和氨基寡糖素。其中芽孢杆菌芽孢粉质量比：ZM9:DH9:ZH2:YH-22＝1:1:1:1，混合均匀后按照：芽孢粉:壳聚糖:万寿菊根茎提取物:氨基寡糖素＝1:1:1:1。壳聚糖和氨基寡糖素为sigma公司纯品；万寿菊根茎水提取物：本实验室将万寿菊根茎经水提取后，低温旋转干燥后的粉末物质，具体包括：将万寿菊根茎50℃烘干后机械粉碎，用5倍量的水冷浸24h和48h，然后合并24h和48h提取液并在50℃下减压浓缩干燥成粉末物质，置于4℃保存备用(赵慧,&张扬。万寿菊根提取物不同剂型对黄瓜枯萎病菌的抑制作用。甘肃农业,2012,(007),93-94.)。具体如下各实施例所示。
实施例1增效拮抗菌剂对烟草种子萌发的影响
将增效拮抗菌剂滤液设置为100％、75％、50％、25％和0％5个质量体积比浓度梯度，分别取10mL浸泡番茄和烟草种子72小时，然后置于光照培养箱培养，进行种子发芽测试，每个处理设3个重复，以芽长为指标，以0％浓度为对照，通过公式来计算各个浓度对作物种子发芽的促进率或抑制率。
促进率(抑制率)％＝(处理组芽长平均值-对照芽长平均值)/对照组芽长平均值×100％。
结果如下表及图1所示，增效拮抗菌剂对种子发芽有一定促进效果，施用100％、75％、50％、25％浓度增效拮抗菌剂的种子发芽促进率相较于对照分别增加了10.43％、6.16％、3.32％，4.74％。番茄烟草种子发芽促进率相较于对照分别增加了10.42％、9.06％、7.70％，5.44％
表1增效拮抗菌剂发酵液对种子萌发影响(mm)
Figure BDA0002501277660000051
表2增效拮抗菌剂发酵液对番茄子萌发影响(mm)
Figure BDA0002501277660000052
将增效拮抗菌剂滤液与灭菌水配置成100％、75％、50％、25％和0％5个浓度梯度(体积百分比)的液体，分别取10mL，浇灌移栽后15天番茄和烟苗，30天后分别随机抽取不同浓度处理后苗株15株，测定株高求平均值。由表2可知，相较于对照组，加入增效拮抗菌剂后烟草和番茄的株高增加，其中烟草的株高增长率为57.197％，番茄的株高增长率为63.325％。
表2增效拮抗菌剂发酵液对烟苗和番茄生长的影响实验数据(单位：mm)
Figure BDA0002501277660000053
实施例2增效拮抗菌剂在青枯病害防治、黑胫病害防治及促进烟株生长方面的应用
本实施例中涉及的烟草品种：云烟87；土壤：恩施宣恩。本发明中涉及的组别包括：CK：不采用任何处理；T1：增效拮抗菌(复合拮抗菌芽孢粉:壳聚糖:万寿菊水提物:氨基寡糖素＝1:1:1:1)；T2：复合拮抗菌(ZM9:DH9:ZH2:YH-22＝1:1:1:1)；T3:增效成分(壳聚糖:万寿菊:氨基寡糖素＝1:1:1)。
本发明本实施例涉及的测试分析指标及方法
(1)土壤中青枯菌丰度变化：分别称取增效拮抗菌，复合拮抗菌和增效成分1g，用水100mL配置成1％(质量体积比)的悬液，分别取30mL浇灌移栽15天后的烟苗，30天后分别取不同处理后的烟苗土壤1g，加水50mL稀释并取土壤悬浊液100μl，稀释涂布于NA培养基中，置于30℃培养36h，平板计数青枯菌的数量。每个处理设3个重复，每个重复10株烟草，共计做了5次试验。
(2)青枯病发病情况：在烟苗盆栽时在土壤中接种青枯菌病原菌(RalstoniaSolanacearum HF-1-1,由实验室从恩施青枯病发病土壤中筛选，并保存，且已在文章[杨小琼,余君,周文,李程,李春黎,王昌军,孙敬国,陈守文,杨勇.邻苯二甲酸二丁酯降解菌对烟草青枯病的抑制作用[J/OL].烟草科技:1-14[2020-05-17]一文中披露)，青枯菌病原菌接种量为1mL(1.00×1010CFU/mL)，在烟草移栽时，量取300mL预先配置好的增效拮抗菌剂、复合拮抗菌和增效成分悬液(浓度为1％，质量体积比)与稳根水一起施用，，施用剂量均最终量为300mg/株，移栽45天后开始统计青枯病发病率。病级统计按照GB/T 23222-2008执行。
(3)黑胫病发病情况：在烟苗移栽15天后，用手术刀在烟苗茎基部刮一伤口，深度至髓部，将烟草黑胫病菌(Phytophthora parasiticavarnicotianae,由实验室从恩施黑胫病发病土壤中筛选，并保存，且已在[苏宁,张修国.中国不同地区烟草寄生疫霉(Phytophthora parasitica var.nicotianae)菌株的随即多态性DNA扩增分析(英文)[J].河北农业大学学报,2001(02):71-76.]一文中披露)饼贴于伤口处，并用脱脂棉保湿。复合菌剂和增效拮抗菌剂用量均为300mg/株，病原菌接种后7天后开始统计发病率，病情指数及相对防治效果。病级统计按照GB/T 23222-2008执行。
发病率＝(发病株数/调查总株数)×100％
病情指数＝[∑(各级病株或叶数×该病级值)/(调查总株数或叶数×最高级值)]×100
相对防治效果＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％
(4)烟草农艺性状分析：选取盆栽移栽后60天内的烟苗测量烟株的高度，茎秆直径，最大叶片的长宽。每个处理烟株为10株，重复5次。
结果如下：
1、土壤中青枯菌病原菌丰度变化
平板菌落数统计结果显示：对照组、复合菌剂组、增效菌剂和增效成分组青枯菌菌落个数分别为342.33±19.29、195.67±21.73、150.33±14.29和201.86±18.97(图2，a,b,c和d)。T2组青枯菌菌落个数显著少于CK组(T-test，p＝0.001)，T1组青枯菌菌落个数显著少于T2(T-test，p＝0.047)和T3组(T-test，p＝0.032)。
2、青枯病发病率统计分析
烟苗移栽15d后开始统计青枯菌的发病情况，经过5次重复试验，共计统计烟草150株，CK组青枯病发病131株，发病率为87.33％±0.79(图3)；T1组中青枯病发病23株，发病率为15.33％±0.88；T2组青枯病发病31株，发病率为20.67％±1.59；T3组青枯病发病66株，发病率为44.00％±1.08。T1组青枯病发病率显著低于CK组(T-test，p<0.001)，比CK组发病率降低72％。T2组青枯病发病率显著低于CK(T-test，p<0.001)，T1分别比T2组和T3组降低5.34％和28.67％。CK组青枯病病情指数为44.67±4.08；T1组青枯病病情指数为17.48±3.96；T2组中青枯病病情指数为20.74±2.81；T3组中青枯病病情指数为28.52±5.74。T1组青枯病病情指数显著低于CK组，比CK组降低27.19％，T1分别比T2组和T3组降低11.04％和3.26％。
表3不同处理条件下青枯病发病率和病情指数显著分析
Figure BDA0002501277660000071
经过5次重复试验发现，T1的青枯发病率及病情指数显著低于其它处理和对照，对比分析青枯防治效果，T1>T2>T3>CK。
3、黑胫病发病率统计分析
烟苗移栽15d后开始统计黑胫病的发病情况，经过5次重复试验，共计统计烟草150株，CK组黑胫病发病132株，发病率为88.00％±0.86(图4)；T1组中黑胫病发病18株，发病率为12.00％±1.22；T2组黑胫病发病38株，发病率为25.33％±1.16；T3组黑胫病发病64株，发病率为42.67％±1.34。T1组、T2组、T3组黑胫病发病率均显著低于CK组(T-test，p<0.001)，T1组比CK组发病率降低76.00％。CK组黑胫病病情指数为40.14±2.79；T1组黑胫病病情指数为15.93±1.50；T2组中黑胫病病情指数为22.59±3.79。T3组中黑胫病病情指数为28.37±3.83。T1组比CK组病情指数降低24.22％。按照5次重复的结果统计，T1组、T2组、T3组防效显著高于CK的防效(T-test，p＝0.001)。
表4不同处理条件下黑胫病发病率和病情指数显著分析
Figure BDA0002501277660000072
Figure BDA0002501277660000081
经过5次重复试验发现，T1(复合拮抗菌)的黑胫发病率及病情指数显著低于其它处理和对照，其次是T2，对比分析黑胫防治效果得，T1>T2>T3>CK。
4、烟草农艺性状分析
从烟草的株高、最大叶片长宽和茎秆直径四个方面综合分析了在CK、T1处理和T2处理下烟草的农艺性状。如图5可知，增效拮抗菌剂的施用整体提高了烟草的株高、叶片长宽和茎秆直径，复合拮抗菌的施用对烟草的生长促进作用较小，但T1处理和T2处理对烟草的生长均强于CK。T1处理和T2处理的株高分别为318.875±31.102mm和304.5±42.55mm，相较于CK分别提高了16.484％和11.233％；CK的最大叶片长度为226.33±15.78mm，T1和T2处理分别提高了11.673％和7.97％；CK、T1处理和T2处理的最大叶片宽度为111.417±23.747mm、119.625±13.403mm和116.75±15.798mm；CK的茎秆直径为6.417±0.70mm，相较于T1和T2处理分别提高了14.17％和3.247％。综上可知，烟叶农艺性状T1＞T2＞CK，增效拮抗菌剂的施用提高了烟草的农艺性状，达到了增产的目的。
结果表明，增效拮抗菌剂能显著促进烟株生长，施用增效拮抗菌剂组的最大叶长、最大叶宽、株高、茎直径均高于对照组。
实施例3增效拮抗菌剂的大田应用评价
1、实验方法
本实施例的试验地点：田间试验设置在宣恩椒园凉风重病区。
分组试验设计：
设置大区试验，烟株全生育期内不使用杀菌剂；其它田间管理按常规进行。
CK：对照，不施用菌剂和增效成分。
T1：增效拮抗菌与米糠按照1:1配比后，发酵3天后，与培嫁土按照1:1混匀，以不成团为宜,在烟苗移栽时和移栽后30～40d分别围蔸施用，使用量为300mg/株。
T2：复合拮抗菌与米糠按照1:1配比后，发酵3天后，与培嫁土按照1:1混匀，在烟苗移栽时和移栽后30～40d围蔸施用,使用量为300mg/株。
T3：壳聚糖等与米糠按照1:1配比混合后，再与培嫁土按照1:1混匀，在烟苗移栽时和移栽后30～40d分别施用一次，使用量为300mg/株。
烟株根际土壤样品采集：于烟叶移栽后50天(S期)、75天(Q期)和100天(E期)，采集T1、T2、T3和CK烟株根际土壤，同一处理的土壤样品均匀混合，剔除石粒和植物残渣等杂物，将土壤样品置于干冰中带回实验室，于-80℃冰箱保存，用于DNA提取。
烟草发病情况统计分析：病级调查按照GB/T 23222-2008执行。根据每个等级表中植物的数量，计算病情指数(DI)为DI＝∑(r×n)/(N×9)×100，其中r为疾病严重程度等级表，n为r级受感染烟草的数量，N为检测烟草的总数。
发病率＝(发病株数/调查总株数)×100％
病情指数＝[∑(各级病株或叶数×该病级值)/(调查总株数或叶数×最高级值)]×100
相对防治效果＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％
土壤微理化性质分析：
分析不同处理条件下的烟草土壤理化性质(主要包括：碱解氮，总氮，有机质，pH，有效磷，有效钾，可交换钙、镁，有效铁，锰、铜和锌)。
土壤有机质：马弗炉灼烧差重法；
土壤pH：电位测定法；
土壤全氮：浓H2SO4-H2O2消化凯氏定氮法(国标NY 525-2012)；
土壤全磷：浓H2SO4-H2O2消化分光光度法(国标NY 525-2012)；
土壤全钾测定：浓H2SO4-H2O2消化火焰光度法(国标NY 525-2012)；
土壤速效钾测定：CH3COONH4浸提-火焰光度计测定法(鲍士旦，2000)
土壤缓效钾测定：HNO3浸提-火焰光度计测定法(鲍士旦，2000)
土壤酸性土阳离子交换量的测定：BaCl2---MgSO4强迫交换法。
2、实验结果
2.1不同处理对烟草青枯病发病情况的影响
移栽后对烟株发病情况进行了调查。与CK比较，增效拮抗菌剂(T1)对烟草青枯病的防效为67.13％，而复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)对烟草青枯病的防效分别为54.32％和50.42％，均高于对照(CK)。增效拮抗菌剂对烟草青枯病的防效最高。
表5不同处理烟草青枯病发生情况
Figure BDA0002501277660000091
2.2、烟草青枯病菌土壤理化性质分析
不同烟叶种植时期和不同处理条件下碱解氮、速效磷、速效钾、pH、有机质、全氮、交换性钙、交换性镁、有效铁、有效锰、有效铜和有效锌的含量测定结果表明，S期、Q期和E期的T2和T3处理的碱解氮含量很低，不足10mg/kg，随着种植时间的增加，CK的碱解氮含量稍有降低，从84.75mg/kg降到63.62mg/kg，E时期T1处理的碱解氮含量急剧上升达到97.48mg/kg；S期、Q期和E期的T2和T3处理的速效磷含量很低，不足10mg/kg，而在E期T1处理的98.67mg/kg，三个时期的CK下速效磷含量变化不大；三个时期的CK下速效钾含量变化不大，T1处理下速效钾含量随着烟草种植时间的增加显示出先降低后增加的趋势，T2处理下速效钾含量稍有下降，而T3处理下速效钾的含量从S期的412.3mg/kg上升到Q期的598.47mg/kg再到E期的605.23mg/kg。
三个时期的CK和T1处理下pH基本无变化，而在Q期T2处理下的pH稍有下降，T3处理的pH随着种植时间的增加稍有下降；三个时期的CK和T3处理下，有机质含量变化不明显，E期的T1处理下有机质含量稍有上升，为2.15％，T2处理下随着烟草种植时间的增加，有机质含量先增加后减少；Q期T3处理下全氮含量最高，三个时期的CK下全氮含量维持稳定，T1处理下的全氮含量呈现先减少后增加的趋势；CK的交换性钙随着烟草种植时间的增加达到1820.23mg/kg，Q期的T3处理下交换性钙的含量最高；CK和T3处理下交换性镁的含量随着烟草种植时间的增加而增加，分别达到133.67mg/kg和150.58mg/kg，T2处理下交换性镁的含量呈现先减少后增加的趋势；CK下有效镁的含量从S期的35.28mg/kg降低到Q期的22.18mg/kg，随后又上升到E期的29.47mg/kg，T1处理下有效镁的含量从S期的33.12mg/kg降低到Q期的20.61mg/kg后趋于稳定；T2处理下E期的有效锰含量最高，达到72.49mg/kg，T3处理下有效锰的含量在Q期有所上升，而T1处理下有效锰的含量从S期的46.49mg/kg下降到E期的21.03mg/kg；随着烟草种植时间的增加，CK、T1处理和T3处理下有效铜的变化不大，趋于稳定，而T2处理呈现出先先上升后下降的趋势；三个时期的CK下有效锌的含量基本保持不变，T1处理下的有效锌含量从4.03mg/kg下降到Q时期的2.5mg/kg，随后又急剧上升到5.4mg/kg，T1处理下有效锌含量从S期下降到Q期后，在E期趋于稳定，而在T3处理下，Q期的有效锌含量最高，达到6.05mg/kg(图6)。
2.3、烟草青枯病菌土壤微生物群落多样性分析
土壤微生物OTU聚类和物种注释分析
细菌：通过高通量测序检测了CK，增效拮抗菌剂(T1)，复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)防治烟草青枯病的土壤细菌群落。结果表明，施用增效拮抗菌剂，烟株在S期、Q期和E期的土壤细菌群落原始总序列数分别为72554±1960.369条、75406±3180.801条和63539±10885.01条，通过对总序列数进行质控过滤、优化，得到序列有效率分别为90.508％，88.745％和86.607％，平均片段长度分别为254bp，253bp和256bp；施用复合拮抗菌，烟株移栽的S期、Q期和E期土壤细菌群落原始总序列数分别为75053±4879.904条、68100±2488.129条和68603±7700.215条，序列有效率分别为88.960％，91.189％和85.710％，平均片段长度分别为255bp，253bp和254bp；施用壳聚糖，烟株在S期、Q期和E期的土壤细菌群落原始总序列数分别为70530±4204.274条，77877±2639.858条和75528±1899.172条，得到序列有效率分别为89.727％，84.550％和86.996％，平均片段长度分别为254bp，253bp和254bp。
真菌：通过高通量测序检测了CK，增效拮抗菌剂(T1)，复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)防治烟草青枯病的土壤真菌群落。结果表明，施用增效拮抗菌剂，烟株在S期、Q期和E期的土壤真菌群落原始总序列数分别为69598±6533.52条、75456±3358.87条和63305±17930.31条，通过对总序列数进行质控过滤、优化，得到序列有效率分别为86.084％，84.841％和85.319％，平均片段长度分别为246bp，228bp和190bp；施用复合拮抗菌，烟株移栽的S期、Q期和E期土壤真菌群落原始总序列数分别为68912±11744.992条、75618±1799.842条和77521±3763.669条，序列有效率分别为87.006％，88.331％和85.751％，平均片段长度分别为221bp，226bp和272bp；施用壳聚糖，烟株在S期、Q期和E期的土壤真菌群落原始总序列数分别为68851±11714.006条，71358±4127.151条和73104±2482.381条，得到序列有效率分别为84.890％，87.409％和87.971％，平均片段长度分别为236bp，231bp和254bp。
共有及特有微生物类群分析(Venn图分析)
细菌：通过Venn图分析了对照组(CK)，施用增效拮抗菌剂(T1)，复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)共有和特有的OTUs，结果表明；烟株在S期对照组(CK)，施用增效拮抗菌剂(T1)，复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)防治烟草青枯病的土壤样本中共检测出8086个OTUs，其中它们共有的OTUs为3259个，施用增效拮抗菌剂(T1)特有的OTUs为590个，施用复合拮抗菌(T2)特有的OTUs为528个，施用壳聚糖(T3)特有的OTUs为695个；烟株在Q期对照组(CK)，施用增效拮抗菌剂(T1)，复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)防治烟草青枯病的土壤样本中共检测出8356个OTUs，其中它们共有的OTUs为3346个，施用增效拮抗菌剂(T1)特有的OTUs为721个，施用复合拮抗菌(T2)特有的OTUs为454个，施用壳聚糖(T3)特有的OTUs为543个；烟株在E期对照组(CK)，施用增效拮抗菌剂(T1)，复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)防治烟草青枯病的土壤样本中共检测出9589个OTUs，其中它们共有的OTUs为3842个，施用增效拮抗菌剂(T1)特有的OTUs为904个，施用复合拮抗菌(T2)特有的OTUs为509个，施用壳聚糖(T3)特有的OTUs为666个。
真菌：通过Venn图分析对照组(CK)，施用增效拮抗菌剂(T1)，复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)共有和特有的OTUs，结果表明；烟株在S期对照组，施用增效拮抗菌剂(T1)，复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)防治烟草青枯病的土壤样本中共检测出2962个OTUs，其中它们共有的OTUs为421个，施用增效拮抗菌剂(T1)特有的OTUs为346个，施用复合拮抗菌(T2)特有的OTUs为403个，施用壳聚糖(T3)特有的OTUs为467个；烟株在Q期对照组(CK)，施用增效拮抗菌剂(T1)，复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)防治烟草青枯病的土壤样本中共检测出2366个OTUs，其中它们共有的OTUs为563个，施用增效拮抗菌剂(T1)特有的OTUs为246个，施用复合拮抗菌(T2)特有的OTUs为254个，施用壳聚糖(T3)特有的OTUs为242个；烟株在E期对照组(CK)，施用增效拮抗菌剂(T1)，复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)防治烟草青枯病的土壤样本中共检测出2491个OTUs，其中它们共有的OTUs为321个，施用增效拮抗菌剂(T1)特有的OTUs为761个，施用复合拮抗菌(T2)特有的OTUs为125个，施用壳聚糖(T3)特有的OTUs为196个。
物种相对丰度分析
细菌：对增效拮抗菌剂(T1)，复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)防治烟草青枯病的相对丰度排名前10位的土壤细菌门进行了分析。结果表明，T1，T2和T3这三个处理中变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、芽单胞菌门(Cemmatimonadetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、奇古菌门(Thaumarchaeota)、绿弯菌门(Chloroflexi)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、厚壁菌门(Firmicutes)等10个细菌门的相对丰度较高，位于前10，其中变形菌门(Proteobacteria)在这三个处理中的相对丰度都是最高的。
对烟株移栽的S期不同处理条件下土壤细菌群落的门水平物种的相对丰度进行分析，其中T1，T2和T3处理后变形菌门(Proteobacteria)相对丰度分别占51％、51％和53％，均高于CK对照组(47％)；酸杆菌门(Acidobacteria)相对丰度在四个组中所占比例相同；CK对照组的放线菌门(Actinobacteria)相对丰度为13％，高于T1(10％)、T2(8％)和T3(7％)；芽单胞菌门(Cemmatimonadetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、奇古菌门(Thaumarchaeota)、绿弯菌门(Chloroflexi)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、厚壁菌门(Firmicutes)和其他门的相对丰度差异不大。
对烟株移栽的Q期不同处理条件下土壤细菌群落的门水平物种的相对丰度进行分析，其中CK，T1和T2三个组的变形菌门(Proteobacteria)相对丰度分别占总物种丰度的47％，46％和50％，均低于T3对照组(52％)；酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、芽单胞菌门(Cemmatimonadetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、奇古菌门(Thaumarchaeota)、绿弯菌门(Chloroflexi)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、厚壁菌门(Firmicutes)和其他门的相对丰度差异不大。
对烟株移栽的E期不同处理条件下土壤细菌群落的门水平物种的相对丰度进行分析，其中CK，T2和T3三个组的变形菌门(Proteobacteria)相对丰度分别占总物种丰度的35％，34％和36％和均低于T1组(37％)，且变形菌门的丰度在烟苗的生长过程中逐渐减少；酸杆菌门(Acidobacteria)的丰度在四个组中的丰度差异不大，且其丰度随着烟草的生长，所占比例有所增加；放线菌门(Actinobacteria)、芽单胞菌门(Cemmatimonadetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、奇古菌门(Thaumarchaeota)、绿弯菌门(Chloroflexi)疣微菌门(Verrucomicrobia)、厚壁菌门(Firmicutes)和其他门的相对丰度差异不大。
在烟叶生长的三个时期，发现鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)，黄杆菌属(Flavobacterium)，嗜盐海洋粘细菌(Haliangium)，链霉菌属(Streptomyces)，芽孢杆菌属(Bacillus)，胶质类芽孢杆菌属(Paenibacillus)，细链孢菌属(Catenulispora)，金黄杆菌属(Chryseobacterium)，红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)，放线菌属(Actinospica)，乳梭菌属(Lachnoclostridium)，葡萄球菌属(Staphylococcus)等12个烟草青枯菌土壤拮抗菌属，其中鞘脂单胞菌属在S期、Q期和E期三个时期的丰度均最高，且随着烟苗的种植时间的增加逐渐减少；嗜盐海洋粘细菌的丰度在三个时期的变化不明显，但在E时期相对丰度有所提高；链霉菌属在E时期的相对丰度所占比例有所增加。
在烟叶生长的三个时期，发现鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)，不动杆菌属(Acinetobacter)，新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium)，假单胞菌属(Pseudomonas)，溶菌属(Lysobacter)，寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)，根瘤菌属(Bradyrhizobium)，类固醇杆菌属(Steroidobacter)，微小杆菌属(Microvirga)，单核杆菌属(Solirubrobacter)，大单胞菌属(Chthonomonas)，颗粒菌属(Granulicella)，生丝微菌属(Hyphomicrobium)，甲基杆菌(Methylobacterium)，固氮螺菌属(Azospirillum)，嗜冷杆菌属(Psychrobacter)等16个土壤益生菌属。鞘氨醇单胞菌在S期、Q期和E期三个时期均最高；动杆菌属在E期相对丰度占比有所增加；T1组的假单胞菌属和寡养单胞菌属在E期的丰度占比比S期和Q期期高。
真菌：对增效拮抗菌剂(T1)，复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)防治烟草青枯病的相对丰度排名前10位的土壤真菌门进行了分析。结果表明，T1，T2和T3这三个处理中梳霉门(Kickxellomycota)、隐真菌门(Rozellomycota)、芽枝霉门(Blastocladiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、油壶菌门(Olpidiomycota)、毛霉门(Mucoromycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、被孢霉门(Mortierellomycota)、子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)等10个真菌门的相对丰度较高，位于前10，其中子囊菌门(Ascomycota)和被孢霉门(Mortierellomycota)在这三个处理中的相对丰度都是最高的。
对烟株移栽的S期不同处理条件下土壤真菌群落的门水平物种的相对丰度进行分析，其中子囊菌门(Ascomycota)在四个处理中所占比例相对较高，在T1，T2，T3和CK组所占比例分别为21％，42％，14％和9％；被孢霉门(Mortierellomycota)在T3和CK组的占比依次为2％和3％，显著性低于T1(7％)和T2组(23％)；壶菌门(Chytridiomycota)在T1和CK组的占比均为6％，在T2组的占比最低，为2％；梳霉门(Kickxellomycota)、隐真菌门(Rozellomycota)、芽枝霉门(Blastocladiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、油壶菌门(Olpidiomycota)、毛霉门(Mucoromycota)、担子菌门(Basidiomycota)等真菌门的相对丰度占比较低。
对烟株移栽的Q期不同处理条件下土壤真菌群落的门水平物种的相对丰度进行分析，其中子囊菌门(Ascomycota)和被孢霉门(Mortierellomycota)在四个处理中所占比例相对较高。子囊菌门(Ascomycota)在T1，T2，T3和CK组所占比例分别为39％，43％，29％和31％；被孢霉门(Mortierellomycota)在T1和T3组的相对丰度均为28％，在T2和CK组的占比分别为20％和25％；担子菌门(Basidiomycota)在T1，T2和T3组所占比例分别为5％，9％和4％，均低于CK组(14％)；壶菌门(Chytridiomycota)在CK组的占比为1％，显著低于其余三组。梳霉门(Kickxellomycota)、隐真菌门(Rozellomycota)、芽枝霉门(Blastocladiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、油壶菌门(Olpidiomycota)、毛霉门(Mucoromycota)等真菌门的相对丰度占比较低。
图对烟株移栽的E期不同处理条件下土壤真菌群落的门水平物种的相对丰度进行分析，其中子囊菌门(Ascomycota)的相对丰度在T1组最高49％，显著性高于T2组(8％)，T3组(17％)和CK组(26％)；担子菌门(Basidiomycota)在T2组占比最高为28％，显著性高于其余三组；被孢霉门(Mortierellomycota)在T1组，T2组和T3组的相对丰度所占比例为5％，6％和4％，显著性低于CK组(21％)。梳霉门(Kickxellomycota)、隐真菌门(Rozellomycota)、芽枝霉门(Blastocladiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、油壶菌门(Olpidiomycota)、毛霉门(Mucoromycota)和壶菌门(Chytridiomycota)的相对丰度极低。
Alpha多样性指数分析
细菌：通过了不同处理微生物Alpha多样性指数(包括chao1，shannon和simpson)的动态变化。结果表明：chao1值T1>T2>T3>CK,说明增效拮抗菌剂处理后土壤微生物种总数显著性提高；从群落多样性Shannon和Simpson指数分析结果表明，T1的Shannon和Simpson指数值最高，相对比较，Shannon和Simpson指数值T1>T2>T3>CK，由于Shannon和Simpson指数值越大，说明群落多样性越高。由此可见，增效拮抗菌剂显著的提高了土壤中微生物的种类；总而言之，在烟叶移栽后50天(S期)，T1和T2的物种多样性较T3和CK更均匀，且CK组内物种丰度差异最大；在烟叶移栽后75天(Q期)，T1和CK的群落多样性很均匀，而T2差异不明显，T3组的群落多样性差异最明显；在烟叶移栽后的100天(E期)，四个处理的物种丰富度差异相较于前两个时期不明显，说明经菌剂处理后，在烟草移栽后期，烟草根际土壤中的微生物群落多样性趋于平稳，差异不明显。
真菌：通过了不同处理微生物Alpha多样性指数(包括chao1，shannon和simpson)的动态变化。结果表明：chao1值T1>T3>T2>CK,说明增效拮抗菌剂处理后土壤微生物种总数显著性提高；从群落多样性Shannon和Simpson指数分析结果表明，T1的Shannon和Simpson指数值最高，Shannon和Simpson指数值T1>T3>T2>CK，说明增效拮抗菌剂显著的提高了土壤中真菌的种类；在烟叶移栽后50天(S期)，T1、T2和T3的物种多样性比CK更均匀，且CK组内物种丰度差异最大；在烟叶移栽后75天(Q期)，T2的群落多样性很均匀，T1和T3组的群落多样性差异最明显；在烟叶移栽后的100天(E期)，T1的真菌群落多样性最高且趋于均匀，而CK的真菌群落多样性较低且差异显著，说明经增效拮抗菌剂处理后，在烟草移栽后期，烟草根际土壤中的真菌群落多样性趋于平稳，差异不明显。
物种组成均一性分析(Rank Abundance曲线分析)
细菌：不同处理条件下，在拮抗烟草青枯病的烟草根际土壤中细菌的RankAbundance曲线说明随着烟草种植时间的增加，T1处理的物种丰富程度增加，均匀度也随之增加，可知增效拮抗菌剂加入后，烟草根际土壤中的微生物丰度更加均匀，T2处理和T3处理的物种丰富度和均匀度均低于T1处理，且CK的烟草根际土壤中的微生物多样性和均匀度程度最低。
真菌：不同处理条件下，在拮抗烟草青枯病的烟草根际土壤中真菌的RankAbundance曲线说明随着烟草种植时间的增加，T1处理的物种丰富程度增加，均匀度也随之增加，可知增效拮抗菌剂加入后，烟草根际土壤中的微生物丰度更加均匀，T2处理和T3处理的物种丰富度和均匀度均低于T1处理，且CK的烟草根际土壤中的微生物多样性和均匀度程度最低。
Beta多样性指数分析
细菌：利用非度量多维标定法(Non-MetricMulti-Dimensional Scaling,NMDS)将多维空间的样本进行简化，CK的样本较为分散，在低维空间进行定位、分析和归类，通过样本的分布可以看出组间或组内差异：对于拮抗青枯病的烟田土壤，stress＝0.115，说明所取土样具有很好的代表性。在烟草种植过程中，S时期、Q时期和E时期分布差异较大，显示出明显的分布区域性，说明增效拮抗菌剂和复合菌剂的加入对烟草根际土壤的微生物群落结构影响较大。在同一时期的不同处理中，S时期和Q时期的分布跨度较小，说明细菌群落结构差异不明显；E时期的不同处理分布跨度大，说明此时烟草根际微生物群落结构差异明显。
拮抗青枯病的烟草移栽S期的T1处理与烟草移栽的E期的CK之间呈极显著差异，以及Q时期的T1处理和CK呈极显著差异说明增效拮抗菌剂的施用，对烟草根际土壤的微生物种群影响较大；S时期的T3处理和Q时期的CK、E时期的CK之间均呈极显著差异，说明增效成分壳聚糖的施用对烟草根际微生物的群落结构影响较大；E时期的T2处理和T3处理与Q时期的CK显著性差异，以及E时期的T2处理和CK显著性差异，说明复合拮抗菌的施用对烟草土壤的物种丰度也有的影响。综合以上可知增效拮抗菌剂、复合菌剂和增效成分的施用对烟草根际土壤微生物群落均有一定程度的影响。
真菌：利用非度量多维标定法(Non-MetricMulti-Dimensional Scaling,NMDS)将多维空间的样本进行简化，CK的样本较为分散，在低维空间进行定位、分析和归类，通过样本的分布可以看出组间或组内差异：对于拮抗青枯病的烟田土壤，stress＝0.146，说明所取土样具有很好的代表性。在烟草种植过程中，S时期、Q时期和E时期分布差异较大，显示出明显的分布区域性，说明增效拮抗菌剂，复合菌剂和壳聚糖的加入对烟草根际土壤的真菌群落结构影响较大。在同一时期的不同处理中，E时期的分布跨度较小，说明细菌群落结构差异不明显；S时期和E时期的不同处理分布跨度大，说明此时烟草根际微生物群落结构差异明显。
拮抗青枯病的烟草移栽S期的T2处理与烟草移栽的Q期的T1处理之间呈显著差异，以及E时期的T1处理和CK呈极显著差异说明在烟草种植后期，增效拮抗菌剂的施用，对烟草根际土壤的真菌种群影响较大且T1的真菌群落相对丰度明显高于CK处理；Q时期的T1处理和E时期的T2处理、E时期的T2处理之间均呈极显著差异，说明增效拮抗菌剂和复合拮抗菌对烟草根际微生物的群落结构影响差异较大；E时期的T1处理与Q时期的T3处理呈显著性差异，说明增效成分壳聚糖的施用对烟草土壤的物种丰度也有的影响。综合以上可知增效拮抗菌剂、复合菌剂和增效成分的施用对烟草根际土壤微生物群落均有一定程度的影响。
微生物种群主成分分析(PCoA分析)
细菌：利用PCoA(Principal co-ordinates analysis)分析，将拮抗烟草青枯病的土壤细菌OTUs组成反映在二维坐标图上，以解释不同样品土壤细菌OTUs组成的差异。结果表明，PC1和PC2的贡献率分别为52.60％和11.45％，累计贡献率为64.05％。在烟草移栽的S期，T1处理、T2处理、T3处理和CK在PC1和PC2形成坐标轴的正方向，说明此时土壤细菌群落结构差异不明显；在烟草移栽的Q期，T1处理、T2处理、T3处理和CK在PC1和PC2形成坐标轴的右下方，说明此时土壤细菌群落结构差异不明显，而Q时期和S时期的土壤物种丰度差异明显；在烟草移栽的E期，T1处理、T2处理、T3处理和CK在PC1和PC2形成坐标轴的负坐标轴方向，在PC2轴上的跨度较大，说明此时土壤细菌群落结构差异明显，其中T1处理在PC2轴上的跨度最小，说明随着烟草种植时间的增加，增效拮抗菌剂使烟草根际土壤微生态更加稳定。总体来看，S时期、Q时期和E时期的土壤微生物群落结构差异较大。
真菌：利用PCoA(Principal co-ordinates analysis)分析，将拮抗烟草青枯病的土壤细菌OTUs组成反映在二维坐标图上，以解释不同样品土壤细菌OTUs组成的差异。结果表明，PC1和PC2的贡献率分别为59.91％和11.41％，累计贡献率为71.32％。在烟草移栽的S期，T1处理、T3处理和CK在PC1和PC2形成坐标轴的正方向，而T2处理在PC1轴的负方向，各个样本分布分散，说明此时T1处理、T2处理、T3处理和CK的土壤真菌群落结构差异较明显；在烟草移栽的Q期，T1处理、T2处理、T3处理和CK在PC1轴的负方向，且各个样本紧密分布，说明此时土壤细菌群落结构差异不明显，而Q时期和S时期的土壤中真菌的相对丰度差异明显；在烟草移栽的E期，T2处理、T3处理和CK在PC1和PC2形成坐标轴的负坐标轴方向，而T1处理在PC1轴的负方向和PC2轴的正方向，T1处理和其余三组的分布跨度较大，说明此时土壤真菌群落结构差异明显，说明随着烟草种植时间的增加，增效拮抗菌剂对烟草根际土壤微生态的影响最大。总体来看，S时期、Q时期和E时期的土壤微生物群落结构差异较大。
群落组成结构相似性分析(PCA分析)
细菌：将拮抗烟草青枯病的土壤经PCA分析发现，在烟草移栽的S期、Q期和E期三个不同的时期，微生物群落结构发生了较大变化。烟草根际土壤物种丰度E时期＞Q时期＞S时期。在烟草移栽的S期，T2和T3处理在坐标轴上的分布比CK和T1的分布跨度较大，其中CK的跨度最小，说明此时物种差异最小；在烟草移栽的Q期，T1处理、T2处理、T3处理和CK的土壤微生物群落差异不明显；在烟草移栽的E期，相较于T2处理、T3处理和CK，T1处理的分布较广，说明在这个时期烟草根际土壤微生物群落结构差异最大。
真菌：将拮抗烟草青枯病的土壤经PCA分析发现，在烟草移栽的S期、Q期和E期三个不同的时期，微生物群落结构发生了较大变化。烟草根际土壤真菌相对丰度E时期＞S时期＞Q时期。在烟草移栽的S期，T1、T2和T3处理在坐标轴上的分布比CK的分布跨度大，CK的跨度最小，说明此时增效拮抗菌剂、复合拮抗菌和增效成分壳聚糖的加入对烟草根际土壤真菌群落产生一定的影响；在烟草移栽的Q期，T1处理、T2处理、T3处理和CK的样本在PC1轴的正方向和PC2轴的负方向，且分布紧密，说明此时土壤微生物群落差异不明显；在烟草移栽的E期，四个处理的样本分布较广，说明在这个时期烟草根际土壤微生物群落结构差异最大。
差异物种丰度分布(MetaStat分析)
Metastat丰度差异分析是基于各分类学水平样品序列数的统计信息，可以比较某一特定物种在两个(组)样品之间丰度的差异情况，在统计学上是否存在显著性差异。对拮抗烟草土壤中的12种属水平微生物进行MetaStat差异性分析，比较固氮螺菌属(Azospira)，Oligoflexales，Dorea，厚壁菌门(Fastidiosipila)，阿里叶柄均属(Alistipes)，颤杆菌属(Oscilibacter)，热微菌属(Tepimicrobium)，唐菖蒲伯克霍尔德菌属(Agaricicola)，Lentimicrobiaceae，聚磷菌(Candidatus)，优杆菌属(Anaearovcrax)和肠杆菌属(commensalibacter)丰度的差异情况时，增效拮抗菌(T1)与CK,复合拮抗菌(T2),壳聚糖(T3)进行丰度差异性分析，其中Oligoflexales,聚磷菌(Candidatus)这两个菌属存在显著性差异，Dorea，阿里叶柄均属(Alistipes)，颤杆菌属(Oscilibacter)这三个菌属存在极显著性差异，而固氮螺菌属(Azospira)，厚壁菌门，热微菌属(Tepimicrobium)，唐菖蒲伯克霍尔德菌属(Agaricicola)，Lentimicrobiaceae(Fastidiosipila)，优杆菌属(Anaearovcrax)和肠杆菌属(commensalibacter)这七个菌属无显著性差异。说明施用增效拮抗菌剂后，显著性地改变了Oligoflexales,聚磷菌(Candidatus)，Dorea，阿里叶柄均属(Alistipes)，颤杆菌属(Oscilibacter)这五个菌属的丰度，增效拮抗菌剂可能是通过改变土壤微生物的丰度来降低青枯病的发病率。
2.4、不同处理对烟草黑胫病发生的影响
移栽后对烟株发病情况进行了调查，结果见表6。相较于CK，增效拮抗菌剂(T1)对烟草黑胫病的防效为64.19％，而复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)对烟草青枯病的防效分别为49.23％和29.75％，均高于对照(CK)。因此增效拮抗菌剂对烟草黑胫病的防效最高。
表6不同处理烟草黑胫病发生情况
Figure BDA0002501277660000181
Figure BDA0002501277660000191
2.5、烟草黑胫病菌土壤理化性质分析
对各处理烟草根际土壤理化性质进行测定，得到不同烟叶种植时期和不同处理条件下碱解氮、速效磷、速效钾、pH、有机质、全氮、交换性钙、交换性镁、有效铁、有效锰、有效铜和有效锌的含量变化。S期、Q期和E期的CK和T1处理的碱解氮含量相对较低，不足100mg/kg，而T2和T3处理的含量相对较高，各个时期的含量均高于120mg/Kg，随着种植时间的延长，各个时期的碱解氮含量变化不大，CK和T1碱解氮的含量维持在85mg/Kg左右，T2处理的碱解氮含量维持在120mg/Kg左右，而T3处理的碱解氮含量最高，维持在140mg/Kg。S期、Q期和E期的CK中速效磷的含量随着种植时间的延长含量逐渐降低，从78.23mg/Kg降到55.68mg/Kg；而T1处理中速效磷的含量随着种植时间的延长含量反而逐步上升，从46.35mg/Kg升到82.12mg/Kg；T2和T3处理中速效磷的含量随着种植时间的延长含量无明显变化，T2处理的速效磷含量维持在60mg/Kg左右，T3处理的速效磷含量维持在105mg/Kg左右。
CK中，速效钾的含量在各个种植时期的变化不大，其维持在490mg/Kg左右；T1处理中速效钾的含量随着种植时间的延长，其含量呈现先下降后上升的趋势，而T3处理中速效钾的含量变化与T1处理恰好相反，呈现出先上升后下降的趋势；T2处理的速效钾含量变化表现为住不下降的趋势。CK，T1和T2三个处理中的pH值在三个种植时期中均无明显差异，总体趋势表现为CK的pH值最高，维持在6.3左右，T1和T2处理的pH值变化基本一致，维持在5.9左右；；T3处理的pH值随着种植时间的延长呈现出逐步下降的趋势，pH值始终在5.8以下。CK，T2和T3处理中有机质的含量在各个种植时期中变化不大，CK中有机质的含量维持在2％左右，T2处理中有机质的含量维持在2.5％左右，T3处理中有机质的含量维持在3％左右；T1处理中有机质的含量随着种植时间的延长呈现出逐步上升的趋势。CK中全氮的含量在各个种植时期中含量基本保持不变，维持在0.12％左右，而T1处理中全氮的含量随着种植时间的延长，表现为先下降后上升的趋势，T2和T3处理中全氮的含量变化恰好与T1处理的相反，表现为先上升后下降的趋势。交换性钙的含量在CK和T1处理中表现为先下降后上升的趋势，两者在对应的各个时期的含量也很接近；T2和T3处理中交换性钙的含量在各个时期中基本保持不变，T2处理中交换性钙的含量维持在1600mg/Kg左右，而T3处理中交换性钙的含量维持在1500mg/Kg左右。
在CK下交换性镁的含量在S期和Q期维持稳定，分别为110.37mg/kg和109.48mg/kg，最后在E期上升至124.71mg/kg，T1处理下的交换性镁的含量在Q期最低93.58mg/kg，随着烟草的生长，T3处理在CK下下的交换性镁的含量逐渐增加，分别为105.38mg/kg、122.69mg/kg和145.61mg/kg，T2处理下三个时期的交换性镁的含量维持稳定；T3处理下有效铁的含量从S期的42.28mg/kg降低至Q期的32.46mg/kg，最后又上升至36.70mg/kg，随着烟草种植时间的增加，T1处理下有效铁的含量逐渐降低，从S期的38.57mg/kg降低至Q期的29.51mg/kg，最后降低至E期的19.37mg/kg，T2处理和T3处理下的在S期和Q期有效铁的含量维持稳定，分别为32.14mg/kg和31.02mg/kg，最后分别上升至E期的48.58mg/kg和45.98mg/kg；CK下S期的有效锰含量为44.69mg/kg，Q期稍有下降，为36.19mg/kg，E期又增加至41.58mg/kg，随着烟草种植时间的增加，T1处理下的有效锰含量逐渐下降，从S期的44.02mg/kg下降至33.52mg/kg最后到E期23.65mg/kg，T2处理下S期和Q期的有效锰维持稳定36.02mg/kg，在E期上升至54.29mg/kg，T3处理下S期和Q期的有效锰维持稳定35.88mg/kg，在E期上升至51.72mg/kg；三个时期CK、T1处理和T3处理的有效铜含量维持稳定，且均在0.75mg/kg以上，而T2处理的有效铜含量呈现先增加后减少的趋势，从S期的1.095mg/kg上升至Q期的1.112mg/kg，最后下降至E期的0.923mg/kg；三个时期的CK下有效锌含量基本不变，T1处理的有效锌含量从S期的3.862mg/kg下降至Q期的2.379mg/kg，最后在E期增加至5.288mg/kg，T2处理下有效锌含量从S期的3.769mg/kg，下降至Q期的2.644mg/kg，最后在E期维持稳定，T2处理下Q期的有效锌含量最高5.012mg/kg，而在S期和E期差异不明显，且在烟草生长过程中呈现先增加后减少的趋势。(图7)
2.6、烟草黑胫病菌土壤微生物群落多样性分析
土壤微生物OTU聚类和物种注释分析
细菌：通过高通量测序检测了增效拮抗菌剂(T1)，复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)防治烟草黑胫病的土壤细菌群落。结果表明，施用增效拮抗菌剂，烟株移栽的S期、Q期和E期土壤细菌群落原始总序列数分别69,459±3131.101条、72,534±3518.886条和70,305±2124.900条，通过对总序列数进行质控过滤、优化，得到序列有效率分别为91.451％，87.345％和88.255％，平均片段长度分别为255bp，253bp和254bp；施用复合拮抗菌，S期、Q期和E期土壤细菌群落原始总序列数分别为74,638±417.230条、74,936±3161.683条和75,370±3657.893条，序列有效率分别为90.077％，88.617％和92.696％，平均片段长度分别为254bp，253bp和255bp；施用壳聚糖，烟株S期、Q期和E期土壤细菌群落原始总序列数分别为70,530±4204.274条，77,877±2639.858条和75528±1899.172条，得到序列有效率分别为95.145％，98.145％和96.111％，平均片段长度分别为254bp，253bp和254bp。
真菌：通过高通量测序检测了增效拮抗菌剂(T1)，复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)防治烟草黑胫病的土壤真菌群落。结果表明，施用增效拮抗菌剂，烟株移栽的S期、Q期和E期土壤真菌群落原始总序列数分别71579±9059.169条、78885±5478.050条和72295±13920.477条，通过对总序列数进行质控过滤、优化，得到序列有效率分别为84.329％，83.959％和80.881％，平均片段长度分别为251bp，224bp和247bp；施用复合拮抗菌，S期、Q期和E期土壤真菌群落原始总序列数分别为76113±5474.089条、76819±2540.871条和67377±17485.907条，序列有效率分别为82.510％，85.311％和78.768％，平均片段长度分别为254bp，225bp和247bp；施用壳聚糖，烟株S期、Q期和E期土壤真菌群落原始总序列数分别为71562±12679.234条，78741±3646.222条和78598±4548.411条，得到序列有效率分别为78.397％，85.797％和86.285％，平均片段长度分别为237bp，231bp和254bp。
共有及特有微生物类群分析(Venn图分析)
细菌：通过Venn图分析了对照组(CK)，施用增效拮抗菌剂(T1)，复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)共有和特有的OTUs，结果表明；S期的对照组(CK)，施用增效拮抗菌剂(T1)，复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)防治烟草青枯病的土壤样本中共检测出8151个OTUs，其中它们共有的OTUs为3176个，施用增效拮抗菌剂(T1)特有的OTUs为621个，施用复合拮抗菌(T2)特有的OTUs为516个，施用壳聚糖(T3)特有的OTUs为666个；Q期的对照组(CK)，施用增效拮抗菌剂(T1)，复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)防治烟草青枯病的土壤样本中共检测出8159个OTUs，其中它们共有的OTUs为3271个，施用增效拮抗菌剂(T1)特有的OTUs为500个，施用复合拮抗菌(T2)特有的OTUs为542个，施用壳聚糖(T3)特有的OTUs为635个；E期的对照组(CK)，施用增效拮抗菌剂(T1)，复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)防治烟草青枯病的土壤样本中共检测出10121个OTUs，其中它们共有的OTUs为3856个，施用增效拮抗菌剂(T1)特有的OTUs为615个，施用复合拮抗菌(T2)特有的OTUs为766个，施用壳聚糖(T3)特有的OTUs为695个。
真菌：通过Venn图分析了对照组(CK)，施用增效拮抗菌剂(T1)，复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)共有和特有的OTUs，结果表明；S期的对照组(CK)，施用增效拮抗菌剂(T1)，复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)防治烟草青枯病的土壤样本中共检测出283个OTUs，其中它们共有的OTUs为97个，施用增效拮抗菌剂(T1)特有的OTUs为23个，施用复合拮抗菌(T2)特有的OTUs为10个，施用壳聚糖(T3)特有的OTUs为24个；Q期的对照组(CK)，施用增效拮抗菌剂(T1)，复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)防治烟草青枯病的土壤样本中共检测出314个OTUs，其中它们共有的OTUs为134个，施用增效拮抗菌剂(T1)特有的OTUs为9个，施用复合拮抗菌(T2)特有的OTUs为22个，施用壳聚糖(T3)特有的OTUs为21个；E期的对照组(CK)，施用增效拮抗菌剂(T1)，复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)防治烟草青枯病的土壤样本中共检测出309个OTUs，其中它们共有的OTUs为111个，施用增效拮抗菌剂(T1)特有的OTUs为14个，施用复合拮抗菌(T2)特有的OTUs为33个，施用壳聚糖(T3)特有的OTUs为9个。
物种相对丰度分析
细菌：对增效拮抗菌剂(T1)，复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)防治烟草黑胫病的相对丰度排名前10位的土壤细菌门进行了分析。结果表明，T1，T2和T3这三个处理中变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、芽单胞菌门(Cemmatimonadetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、奇古菌门(Thaumarchaeota)、厚壁菌门(Firmicutes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)等10个细菌门的相对丰度较高，位于前10，其中变形菌门(Proteobacteria)在这三个处理中的相对丰度都是最高的。
对烟株移栽的S期的不同处理条件下拮抗烟草黑胫病的土壤细菌群落的门水平前10物种的相对丰度进行分析，其中T1，T2和T3三个实验组的变形菌门(Proteobacteria)相对丰度均占总物种丰度的53％，均低于CK对照组(61％)；酸杆菌门(Acidobacteria)相对丰度在T1,T2和T3三个实验组中比例分别为10％，11％，10％，均高于CK对照组(8％)；放线菌门(Actinobacteria)相对丰度在四个组中所占比例大致相同；芽单胞菌门(Cemmatimonadetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、奇古菌门(Thaumarchaeota)、绿弯菌门(Chloroflexi)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、厚壁菌门(Firmicutes)和其他门的相对丰度差异不明显。
对烟株移栽的Q期不同处理条件下拮抗烟草黑胫病的土壤细菌群落的门水平前10物种的相对丰度进行分析，其中T2，T3和T4三个实验组的变形菌门(Proteobacteria)相对丰度分别占总物种丰度的51％，52％和51％，均低于T1组(56％)；T1组的酸杆菌门(Acidobacteria)相对丰度为8％，低于T2(10％),T3(13％)和CK(13％)三个实验组；放线菌门(Actinobacteria)相对丰度在四个组中所占比例大致相同；芽单胞菌门(Cemmatimonadetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、奇古菌门(Thaumarchaeota)、绿弯菌门(Chloroflexi)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、厚壁菌门(Firmicutes)和其他门的相对丰度差异不明显。
对烟株移栽的E期不同处理条件下拮抗烟草黑胫病的土壤细菌群落的门水平前10物种的相对丰度进行分析，其中四个实验组从移栽后50天到移栽后75天的变形菌门(Proteobacteria)相对丰度所占比例无太大变化，到移栽后100天其丰富度均下降至36％左右；酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、芽单胞菌门(Cemmatimonadetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、奇古菌门(Thaumarchaeota)、绿弯菌门(Chloroflexi)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、厚壁菌门(Firmicutes)和其他门的相对丰度差异不明显。
在烟苗的三个生长时期，发现鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)，嗜盐海洋粘细菌(Haliangium)，黄杆菌属(Flavobacterium)，寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)，链霉菌属(Streptomyces)，芽孢杆菌属(Bacillus)，胶质类芽孢杆菌属(Paenibacillus)，金黄杆菌属(Chryseobacterium)，红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)，细链孢菌属(Catenulispora)，放线菌属(Actinospica)，葡萄球菌属(Staphylococcus)，乳梭菌属(Lachnoclostridium)，短小双孢菌属(Microbispora)等14个烟草黑胫病土壤拮抗菌属。其中鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)在烟草移栽的S期、Q期和E期三个时期的相对丰度均为最高；嗜盐海洋粘细菌在Q期占比最高；施用增效拮抗菌剂后，在E期嗜盐海洋粘细菌、寡养单胞菌属、链霉菌属相对丰度的占比有所增加。
在烟苗的三个生长时期，发现不动杆菌属(Acinetobacter)，假单胞菌属(Pseudomonas)，寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)，缓生根瘤菌属(Bradyrhizobium)，溶菌属(Lysobacter)，类固醇杆菌属(Steroidobacter)，中生根瘤菌属(Mesorhizobium)，微枝形杆菌属(Microvirga)，单核杆菌属(Solirubrobacter)，衣藻属(Chthonomonas)，颗粒菌属(Granulicella)，生丝微菌属(Hyphomicrobium)，(Gaiellales)，红球菌属(Rhodococcus)，甲基杆菌属(Methylobacterium)，微双孢菌属(Microbispora)，固氮螺菌属(Azospirillum)，嗜冷菌属(Psychrobacter)等18个烟草黑胫病的土壤益生菌属，其中假单胞菌属(Pseudomonas)在S期和Q期相对丰度最高，不动杆菌属(Acinetobacter)和假单胞菌属(Pseudomonas)与其他菌属相比在E期相对丰度所占比例较高。
真菌：对增效拮抗菌剂(T1)，复合拮抗菌(T2)和壳聚糖(T3)防治烟草黑胫病的相对丰度排名前10位的土壤细菌门进行了分析。结果表明，T1，T2和T3这三个处理中单毛壶菌门(Monoblepharomycota)、隐真菌门(Rozellomycota)、芽枝霉门(Blastocladiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、油壶菌门(Olpidiomycota)、毛霉门(Mucoromycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、被孢霉门(Mortierellomycota)、子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)等10个真菌门的相对丰度较高，位于前10，其中子囊菌门(Ascomycota)在这三个处理中的相对丰度都是最高的。
对烟株移栽的S期的不同处理条件下拮抗烟草黑胫病的土壤真菌群落的门水平前10物种的相对丰度进行分析，四个处理组的真菌门相对丰度差异显著，其中子囊菌门(Ascomycota)在四个处理中的相对丰度都是最高的；壶菌门(Chytridiomycota)相对丰度在T1,T2，T3和CK组中比例分别为11％，10％，4％和10％；油壶菌门(Olpidiomycota)相对丰度在T1,T2和T3中的比例分别为6％，1％和5％，显著性低于CK组(16％)；被孢霉门(Mortierellomycota)在T1，T2和T3组中所占比例均为2％。单毛壶菌门(Monoblepharomycota)、隐真菌门(Rozellomycota)、芽枝霉门(Blastocladiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、毛霉门(Mucoromycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和担子菌门(Basidiomycota)的相对丰度占比极低。
对烟株移栽的Q期的不同处理条件下拮抗烟草黑胫病的土壤真菌群落的门水平前10物种的相对丰度进行分析，四个处理组的真菌门相对丰度差异显著，其中子囊菌门(Ascomycota)在四个处理中的相对丰度都是最高的，其相对丰度在T1,T2，T3和CK组中比例分别为39％，41％，29％和48％；油壶菌门(Olpidiomycota)相对丰度在T1,T2中的比例分别为4％和10％，高于T3(1％)和CK组(2％)；被孢霉门(Mortierellomycota)在T1，T2和T3组中所占比例分别为20％，19％和29％显著高于CK组(6％)；壶菌门(Chytridiomycota)的相对丰度在T1,T2和T3组分别为2％，2％和7％，低于CK组(12％)；担子菌门(Basidiomycota)在四个处理组中占比相同，均为4％。单毛壶菌门(Monoblepharomycota)、隐真菌门(Rozellomycota)、芽枝霉门(Blastocladiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)和毛霉门(Mucoromycota)的相对丰度占比极低。
对烟株移栽的E期的不同处理条件下拮抗烟草黑胫病的土壤真菌群落的门水平前10物种的相对丰度进行分析，四个处理组的真菌门相对丰度差异显著，其中子囊菌门(Ascomycota)在T2，T3和CK组的相对丰度分别为37％，17％和32％，低于T1组(44％)；被孢霉门(Mortierellomycota)在T1和T3组中所占比例均为5％，在T2和CK组所占比例均为7％；的相对丰度在T1,T2和T3组分别为2％，2％和7％，低于CK组(12％)；担子菌门(Basidiomycota)在CK组中所占比例最高，为9％。单毛壶菌门(Monoblepharomycota)、隐真菌门(Rozellomycota)、芽枝霉门(Blastocladiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、毛霉门(Mucoromycota)和壶菌门(Chytridiomycota)的相对丰度占比极低。
Alpha多样性指数分析
细菌：分析了不同处理微生物Alpha多样性指数(包括chao1，shannon和simpson)的动态变化。结果表明：chao1值T1<T2<T3<CK,说明增效接抗菌剂处理后土壤微生物细菌种总数显著性降低；从群多样性Shannon和Simpson指数分析结果表明，CK的Shannon和Simpson指数值最高，相对比较，Shannon和Simpson指数值T1<T2<T3<CK，由于Shannon和Simpson值越大，说明群落多样性越高。由此可见，增效接抗菌剂显著的降低了土壤中微生物种细菌的种类；总而言之，在烟叶移栽后50天(S期)，T1和T2的物种多样性较T3和CK更均匀，且CK组内物种丰度差异最大；在烟叶移栽后75天(Q期)，T1和CK的群落多样性很均匀，而T2差异不明显，T3组的群落多样性差异最明显；在烟叶移栽后的100天(E期)，四个处理的物种丰富度差异相较于前两个时期不明显，说明经菌剂处理后，在烟草移栽后期，烟草根际土壤中的微生物群落多样性趋于平稳，差异不明显。因此，从另一个侧面说明，增效拮抗菌剂在调节黑胫病土壤中的细菌类群的组成均以性方面发挥了重要作用，但是由于黑胫病是土传真菌病还，土壤中细菌类群的调整有利于抑制黑胫病病原菌。
真菌：分析了不同处理微生物Alpha多样性指数(包括chao1，shannon和simpson)的动态变化。结果表明：chao1值T1<T2<T3<CK,说明增效接抗菌剂处理后土壤微生物真菌种总数显著性降低；从群落多样性Shannon和Simpson指数分析结果表明，T2的Shannon和Simpson指数值最高，相对比较，Shannon和Simpson指数值T1<T3<CK<T2，由于Shannon和Simpson值越大，说明群落多样性越高。由此可见，增效接抗菌剂在一定程度上降低了土壤中微生物种真菌的种类；总而言之，在烟叶移栽后50天(S期)，T1和T2的物种多样性较T3和CK更均匀，且CK组内物种丰度差异最大；在烟叶移栽后75天(Q期)，四个组的群落多样性都很均匀；在烟叶移栽后的100天(E期)，T1，T3和CK处理的物种丰富度差异相较于前两个时期不明显，说明经菌剂处理后，在烟草移栽后期，烟草根际土壤中的微生物群落多样性趋于平稳，差异不明显。因此，从另一个侧面说明，增效拮抗菌剂在调节黑胫病土壤中的真菌类群的组成均以性方面发挥了重要作用。
物种组成均一性分析(Rank abundance曲线分析)
细菌：不同处理条件下，在拮抗烟草黑胫病的烟草根际土壤中细菌的RankAbundance曲线说明随着烟草种植时间的增加，T1处理中物种丰富程度增加，均匀度也随之增加，可知增效拮抗菌剂加入后，烟草根际土壤中的微生物丰度更加均匀，T2处理和T3处理的物种丰富度和均匀度均低于T1处理，且CK中烟草根际土壤中的微生物多样性和均匀度程度最低。综上可知，增效拮抗菌剂的施用有利于土壤微生态环境的稳定。
真菌：不同处理条件下，在拮抗烟草黑胫病的烟草根际土壤中真菌的RankAbundance曲线说明随着烟草种植时间的增加，T1处理中物种丰富程度增加，均匀度也随之增加，可知增效拮抗菌剂加入后，烟草根际土壤中的微生物丰度更加均匀，T2处理和T3处理的物种丰富度和均匀度均低于T1处理，且T3处理和CK中烟草根际土壤中的真菌多样性和均匀度程度均较低。综上可知，增效拮抗菌剂的施用更加有利于土壤微生态环境的稳定。
Beta多样性指数分析
细菌：利用非度量多维标定法(Non-MetricMulti-Dimensional Scaling,NMDS)将多维空间的样本进行简化，CK的样本较为分散，在低维空间进行定位、分析和归类，通过样本的分布可以看出组间或组内差异：对于拮抗黑胫病的烟田土壤，stress＝0.115，说明所取土样具有很好的代表性。在烟草种植过程中，S时期、Q时期和E时期分布差异较大，显示出明显的分布区域性，说明增效拮抗菌剂、复合菌剂和增效成分的加入对烟草根际土壤的微生物群落结构影响较大。在同一时期的不同处理中，S时期和Q时期的分布跨度较小，说明细菌群落结构差异不明显；E时期的不同处理分布跨度大，说明此时烟草根际微生物群落结构差异明显。
拮抗黑胫病的烟草S期的T2处理与烟草移栽的E期的CK和T1之间呈极显著差异，与Q时期的CK显著差异，说明复合拮抗菌的施用，对烟草根际土壤的微生物种群有一定的影响，T1处理和T2处理对土壤物种丰度的影响存在差异；S时期的CK与E时期的CK显著差异，说明随着烟草种植时间的增加，烟草根际土壤的微生物种群发生了变化；Q时期T1处理和T2处理显著性差异，说明增效拮抗菌剂的施用和复合拮抗菌的施用对烟草根际土壤微生物丰度影响不同。
真菌：利用非度量多维标定法(Non-MetricMulti-Dimensional Scaling,NMDS)将多维空间的样本进行简化，CK的样本较为分散，在低维空间进行定位、分析和归类，通过样本的分布可以看出组间或组内差异：对于拮抗黑胫病的烟田土壤，stress＝0.148，说明所取土样具有很好的代表性。在烟草种植过程中，S时期、Q时期和E时期分布差异较大，显示出明显的分布区域性，说明增效拮抗菌剂、复合菌剂和增效成分壳聚糖的加入对烟草根际土壤的微生物群落结构影响较大。S期的各个样本在MDS1轴的负方向和MDS2轴的负方向，不同处理组分布较为分散；Q期的各个样本在MDS1轴的正方向和MDS2轴的负方向，不同处理组分布较为紧密；E时期的各个样本分布在MDS2轴的正方向，不同处理分布跨度大。综上可知，随着烟草种植时间的增加，增效抗菌剂的施用对烟草根际真菌的群落结构有明显的影响，多样性增加。
微生物种群主成分分析(PCoA分析)
细菌：利用PCoA(Principal co-ordinates analysis)分析，将拮抗烟草黑胫病的土壤细菌OTUs组成反映在二维坐标图上，以解释不同样品土壤细菌OTUs组成的差异。结果表明，PC1和PC2的贡献率分别为38.81％和25.64％，累计贡献率为64.45％。在烟草移栽的S期，T1处理、T2处理、T3处理和CK在PC1和PC2形成坐标轴的负方向，而且分布较为集中，说明此时土壤细菌群落结构差异不明显；在烟草移栽的Q期，T1处理分布在PC1坐标轴的负方向和PC2坐标轴的正方向，而T2处理、T3处理和CK分布在PC1坐标轴的负方向和PC2坐标轴的负方向且分布较为集中，说明在Q时期T1处理和T2处理、T3处理与CK的微生物结构差异较大；在烟草移栽的E期，四个处理占据了PC2坐标轴的正负两个方向，且跨度较大，此时不同处理下土壤细菌群落结构差异较大。
真菌：利用PCoA(Principal co-ordinates analysis)分析，将拮抗烟草黑胫病的土壤细菌OTUs组成反映在二维坐标图上，以解释不同样品土壤细菌OTUs组成的差异。结果表明，PC1和PC2的贡献率分别为59.17％和10.96％，累计贡献率为70.13％。在烟草移栽的S期，四个处理均在PC1轴的正方向，而且在PC2轴分布较为分散，说明此时土壤真菌群落结构差异明显；在烟草移栽的Q期，四个处理均分布在PC1轴的负方向，且分布较为集中，说明在Q时期四个处理组的真菌群落结构趋于稳定；在烟草移栽的E期，四个处理占据了PC1轴的负方向和PC2坐标轴的正方向，且分布紧密，说明此时土壤真菌群落结构更加稳定。Q期和E期的样本距离较近，与S期的样本距离较远，表明随着烟草种植时间的增加，烟草根际的真菌群落结构变得更稳定。
群落组成结构相似性分析(PCA分析)
细菌：将拮抗烟草黑胫病的土壤经PCA分析发现，在烟草移栽的S期、Q期和E期三个不同的时期，微生物群落结构发生了变化，而S时期和Q时期的分布跨度较近，说明从S期到Q期，土壤微生物群落变化不大，S时期和E时期的分布跨度较大，说明从烟草移栽的S期到E期，烟草根际物种丰度发生了较大的变化；S时期和Q时期的不同处理在坐标轴上的分布较集中，说明微生物群落结构变化不显著；E时期的不同处理在坐标轴上的分布相较于S时期和Q时期跨度大，说明此时微生物群落结构变化明显。
真菌：将拮抗烟草黑胫病的土壤经PCA分析发现，在烟草移栽的S期、Q期和E期三个不同的时期，微生物群落结构发生了变化，而S时期和Q时期的分布跨度较近，说明从S期到Q期，土壤微生物群落变化不大，E时期的分布跨度较大，说明从烟草移栽的S期到E期，烟草根际物种丰度发生了较大的变化；S时期和Q时期的不同处理在坐标轴上的分布较集中，说明微生物群落结构变化不显著；E时期的不同处理在坐标轴上的分布相较于S时期和Q时期跨度大，说明此时真菌群落结构变化明显，且其相对丰度比另外三组高。

Claims (1)

1.一种防控烟草病害的复合拮抗菌剂在制备黑胫病害防治试剂中的应用，所述防控烟草病害的复合拮抗菌剂包括复合拮抗菌和增效成分，所述复合拮抗菌为四种芽孢杆菌混合的芽孢粉，所述四种芽孢杆菌分别为ZM9，DH9，ZH2和YH-22，按质量比ZM9:DH9:ZH2:YH-22=1:1:1:1混合；所述增效成分包括壳聚糖、万寿菊根茎水提物和氨基寡糖素；复合拮抗菌剂是将混匀后的复合拮抗菌与壳聚糖，万寿菊根茎水提取物和氨基寡糖素按照芽孢粉:壳聚糖:万寿菊根茎提取物:氨基寡糖素=1:1:1:1混合而成。
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