CN111387183A - 赖百当类化合物在防治作物青枯病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于作物病害的生物防治领域，针对现有作物青枯病防治技术防效不理想、环境污染、食品安全的问题，本发明提供顺‑冷杉醇在防治青枯病中的应用以及烟草赖百当类化合物在防治青枯病中的应用。本发明是通过提高作物的抗性来防治青枯病的，相对目前报道的生物来源制剂，具有有效浓度低，防效高、无毒、持久性和安全性的特点。

Description

赖百当类化合物在防治作物青枯病中的应用
技术领域
本发明属于作物病害的生物防治领域，尤其涉及赖百当类化合物在防治作物青枯病中的应用。
背景技术
作物青枯病是由青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的毁灭性土传细菌病害，俗称“作物温病”。该病原菌菌系复杂，寄主范围广，除危害多种茄科烟草、番茄、茄子、辣椒、马铃薯等作物外，还能侵染包括花生、桑树、油橄榄等在内的50多科近450多种植物。青枯病的防治是国内外农业科学领域研究的重点及难点。由于生产上抗性品种较少，虽然目前防治主要以化学防治为主，但目前使用的化学药剂(如铜制剂)防效均不理想，且存在极易产生抗药性、农药残留等风险。针对化学防治存在的弊端，对环境友好且符合现代农业可持续发展战略理念的生物防治方法已成为当今研究和开发的热点。生物防治中，研究较多的是利用微生物拮抗菌剂防治青枯病，但是，存在微生物菌剂在室内效果较好，田间效果比较差的状况。近年来，植物诱导抗性因具有广谱性,持久性和安全性等方面优点受到许多植保研究者的关注。利用诱导抗性防治青枯病已经在番茄和烟草等作物上有一些报道。2009年，浙江大学公开了1项利用壳聚糖提高番茄青枯病抗性的技术，利用的是壳聚糖的抗菌性，该技术存在壳聚糖的有效浓度较高、防治成本高、防效较低(10mg/mL土壤灌根条件下，防效为71.72％)的问题。
烟草赖百当类化合物是烟草腺毛分泌物的主要成分，主要包括顺-冷杉醇、赖百当烯-1,3-二醇、香紫苏醇等，以顺-冷杉醇含量最为丰富。烟草顺-冷杉醇等赖百当类化合物主要存在于香料烟、晒烟、雪茄烟中，少数烤烟品种如大白筋599也含有顺-冷杉醇。顺-冷杉醇在烟草花序以及腋芽中含量最高，可达鲜重的0.1％。烟草是开花期打顶作物，烟草生产中，烟花及腋芽被作为田间废弃物大部分进行掩埋处理，不仅造成资源浪费，还导致环境污染。有关烟草赖百当类化合物的研究主要集中在其对烟叶香气品质的贡献，利用烟草赖百当类化合物防治作物青枯病的研究还未见报道。
发明内容
针对现有作物青枯病防治技术防效不理想、环境污染、食品安全的问题，本发明提供一种应用赖百当类化合物防治作物青枯病的方法。
本发明一方面提供顺-冷杉醇在防治作物青枯病中的应用，顺-冷杉醇通过提高作物对青枯病诱导抗性起到防治青枯病的作用。
天然冷杉醇结构中包含4个手性中心以及2个反式双键，利用有机合成方法需要用昂贵手性催化剂控制立体构型。冷杉醇目核结构需要10步以上的反应，合成冷杉醇为消旋体，即2个手性构型的混合物。因此，通过化学合成手段生产冷杉醇，技术难度大，成本高。利用微生物合成天然冷杉醇已有报道，也存在产量较低，生物合成技术还处于实验室阶段。烟草大田生产烟花、烟杈等废弃资源是比较廉价的制备顺冷杉醇的原料，本发明还提供烟草赖百当类化合物在防治青枯病中的应用。烟草赖百当类化合物提取自含有冷杉醇的烟草，例如晒烟品种长叶柳、雪茄烟品种Oosikappal等。烟草赖百当类化合物主要活性成分是冷杉醇。
所述烟草赖百当类化合物的提取方法为：以含有顺-冷杉醇的烟草品种的新鲜花序、叶片或腋芽为原料，以无水乙醇为溶剂，采用浸提法提取原料表面的化合物，提取液经浓缩和纯化，得到烟草赖百当类化合物酊剂，酊剂减压浓缩，获得烟草赖百当类化合物浸膏。该方法能够将含有冷杉醇的烟草废弃物中的目标成分较好的保留，得到的提取物纯度高，方法简单，提取成本低，有利于推广应用。
所述溶剂的用量为原料体积的1.2-1.5倍，常温、常压条件下，轻轻搅动浸提2min-3min，连续提取2次；将提取液减压浓缩，浓缩液在2℃-8℃条件下静置，浓缩液中出现絮状沉淀，加入活性炭，搅拌吸附，然后将沉淀及活性炭与溶液分离，获得烟草赖百当类化合物酊剂，酊剂40℃减压浓缩得到烟草赖百当类化合物浸膏。
所述顺-冷杉醇或烟草赖百当类化合物防治的青枯病为茄科植物的青枯病，进一步的是番茄青枯病。
所述顺-冷杉醇或烟草赖百当类化合物在防治青枯病时采用绿色农药制剂的形式。
所述制剂为水乳剂或微乳剂。
所述制剂中顺-冷杉醇的浓度为0.5-1％。
防治青枯病的具体操作为：将制剂用水稀释成浓度10-25mg/L的施用液灌根，灌根用量为30-50mL/株。
本发明的有益效果：
(1)顺-冷杉醇和烟草赖百当类化合物均是通过提高作物的抗性来防治青枯病的，与目前的农药和生物来源制剂主要通过抑菌来防治植物病害的机理不同。
(2)相对目前报道的生物来源制剂，赖百当类化合物具有有效浓度低，防效高的特点。
(3)烟草赖百当类化合物作为天然来源的活性成分，通过提高作物对青枯病的抗性防治病害发生，具有无毒、持久性和安全性的特点。
(4)烟草赖百当类化合物含量丰富，生物产量高，提取技术简单，利用烟草赖百当类化合物防治作物青枯病害，具有原料来源丰富，生产成本低的优势。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例1
1.烟草赖百当类化合物提取
(1)原料选取：选择晒烟品种长叶柳，种植面积为667m2，开花期摘取烟花、烟杈为提取原料。
(2)浸提：上述原料不经过干燥和粉碎，新鲜状态下直接进行浸提。溶剂为无水乙醇，溶剂用量为原料体积的1.2倍，所有原料连续浸提2次，每次浸提时间为2min，提取液循环利用，提取完成后，将提取原料离心，回收附着在原料上的溶剂，并将所有提取液合并，过滤，获得120L提取液。
(3)浓缩：将提取液在50℃条件下减压浓缩至20L，回收溶剂。
(4)纯化：浓缩液在2℃条件下静置6小时，溶液中出现絮状沉淀，浓缩液加入200目活性炭50g，搅拌吸附60s，离心或过滤，将沉淀及活性炭与溶液分离，获得烟草赖百当类化合物酊剂，酊剂40℃减压浓缩得到烟草赖百当类化合物浸膏282g。
2.顺-冷杉醇含量检测
以上浸膏用70％的乙腈稀释，采用液相色谱方法检测浸膏冷杉醇含量。仪器条件为：色谱柱：BEH C18(1.7μm 2.1*50mm)；流动相：乙腈水溶液，水与乙腈的体积比为30:70；流速0.3mL/min；柱温为36℃；检测波长为273nm。经检测，提取物冷杉醇含量为10.8％。
3.制备提取物微乳制剂
根据如下配比将烟草赖百当提取物配制成微乳剂：冷杉醇1％(根据提取物目标化合物含量称取)，环己酮10％，异丁醇20％，搅匀，加入25％乳化剂3625，混合均匀，加水补足100％。
4.冷杉醇及烟草赖百当类提取物对青枯病菌的体外抑菌活性
4.1试验设计
用丙酮、吐温溶解冷杉醇对照品(SIGMA公司)，用无菌水分别将以上冷杉醇对照品溶液、烟草赖百当提取物微乳剂稀释，获得冷杉醇的浓度梯度为：10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL。分别以同浓度的丙酮、吐温及微乳剂配方助剂的无菌水稀释液为阴性对照，将72％的农用链霉素可湿性粉剂用无菌水稀释成200μg/mL作为阳性对照，每处理三次重复。
4.2菌株活化与冷杉醇抑菌活性测定
(1)菌种活化培养：供试菌株为青枯菌1号生理小种生物型Ⅲ，-80℃冷冻保存。试验前于NA(蛋白胨10g,牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH7.2)培养基上活化，30℃下培养48h后，12000r/min离心10min，去除上清液，配制浓度为107CFU/mL的菌液，接种待用。
(2)抑菌活性测定：将灭菌的NA培养基倒入培养皿中，待冷却、凝固后，用移液枪分别加入150μL相应的待试菌悬液，用无菌涂布棒将菌液涂布均匀。以无菌操作在涂有菌悬液的培养皿表面垂直放上四个牛津杯(内径6mm、外径8mm、高10mm的圆形小管)，在其中两个杯子中分别加入200μL待检样品，一个杯子中加入200μL阴性对照，一个杯子中加入200μL阳性对照。30℃下培养48h，观察牛津杯周围抑菌圈的有无及大小。抑菌圈采用十字交叉法测量。
4.3结果
由下表看出，不同浓度的冷杉醇对照品及烟草赖百当提取物处理，在青枯病菌培养基中均没有出现抑菌圈，说明冷杉醇对照品及烟草赖百当提取物对青枯病菌均没有抑制活性。
表1 不同处理方式的抑菌效果
Figure BDA0002475045430000041
5.温室盆栽青枯菌接种防效试验
温室温度条件：25-32℃。
5.1供试番茄准备
供试番茄品种为青岛地方感青枯病品种杠六九，番茄种子用5％的次氯酸钠灭菌，在30℃培养箱中催芽48h。将萌发的番茄种子播种到装有育苗基质的播种盘里，出苗后25天移栽至装有基质(190g/盆)的塑料盆中(直径12cm，高10cm)。
5.2冷杉醇灌根施用
移栽后，待番茄长至7-8片叶时，挑选长势一致的番茄植株，冷杉醇施用浓度共设3个处理(分别为10、20、30μg/mL)，每处理冷杉醇的灌根体积为30mL,以清水30mL处理作为对照。每处理10盆，3次重复。
5.3青枯菌接种
供试菌株为青枯菌1号生理小种生物型Ⅲ。冷杉醇灌根施用24h后，将预先繁殖的青枯菌配制成1×106cfu/mL的菌悬液,灌根接种,接种量为30mL/株。
5.4发病情况调查
番茄青枯病按发病严重程度分为5级，0级为叶片无症状；1级为植株1/4以下的叶片表现萎蔫症状；2级为植株1/4～1/2叶片表现萎蔫症状；3级为植株1/2以上叶片表现萎蔫症状；4级为全株萎蔫死亡。病情指数＝Σ(病级株数×代表数值)/(株数总和×发病最重级的代表数值)×100。防病效果(％)＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100。
接种10天后，番茄植株开始发病，14天进行第一次病情调查，21天进行第二次病情调查，结果见下表。
表2 烟草赖百当提取物对番茄青枯病的盆栽接种防效实验结果
Figure BDA0002475045430000051
实施实例2
1.烟草赖百当类化合物提取
选择雪茄烟品种Oosikappal，种植面积为667m2，开花期摘取烟花、烟杈为提取原料。提取方法同实施实例1。获得烟草赖百当类化合物浸膏295g。
2.冷杉醇含量检测
检测方法同实施实例1，经检测，获得提取物中冷杉醇含量为9.8％。
3.制备提取物乳化剂
制备油相：根据以下配比制备乳化剂油相：0.5％冷杉醇(根据提取物目标化合物含量称取)，20％溶剂150#，10％乳化剂3326，混合均匀；
制备水相：根据以下配比制备乳化剂水相：10％乙二醇，50％水，混合均匀；
制备水乳剂：将油相进行高速搅拌剪切，3000-10000转/分，期间分2-5次加入水相，完全加入后，剪切30s，得到烟草赖百当类化合物提取物水乳剂.
5.温室盆栽青枯菌接种防效试验
温室温度条件：25-32℃。
6.1供试番茄准备
同实施实例1。
6.2冷杉醇灌根施用
同实施实例1。
6.3青枯菌接种
同实施实例1。
6.4发病情况调查
同实施实例1接种10天后，番茄植株开始发病，14天进行第一次病情调查，21天进行第二次病情调查，结果见下表
表3 烟草赖百当提取物对番茄青枯病的盆栽接种防效实验结果
Figure BDA0002475045430000061
表1的抑菌实验结果和表2、表3的盆栽接种防效实验结果证明，顺-冷杉醇不是通过抑菌来防治青枯病的，而是通过提高作物对青枯病的抗性防治来防治病害发生的。表2和表3数据表明含冷杉醇的烟草赖百当提取物能够防治青枯病，特别是对茄科作物的青枯病防治效果非常好。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.顺-冷杉醇在防治作物青枯病中的应用。
2.烟草赖百当类化合物在防治作物青枯病中的应用，其特征在于，所述烟草赖百当类化合物中含有顺-冷杉醇、赖百当烯-1,3-二醇和香紫苏醇。
3.权利要求1或2所述的应用，其特征在于，防治的青枯病为茄科植物的青枯病。
4.权利要求1或2所述的应用，其特征在于，防治的青枯病为番茄青枯病。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述烟草赖百当类化合物的提取方法为：以含有顺-冷杉醇的烟草品种的新鲜花序、叶片或腋芽为原料，以无水乙醇为溶剂，采用浸提法提取原料表面的化合物，提取液经浓缩和纯化，得到烟草赖百当类化合物酊剂，酊剂减压浓缩，获得烟草赖百当类化合物浸膏。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述溶剂的用量为原料体积的1.2-1.5倍，常温、常压条件下，轻轻搅动浸提2min-3min，连续提取2次；将提取液减压浓缩，浓缩液在2℃-8℃条件下静置，浓缩液中出现絮状沉淀，加入活性炭，搅拌吸附，然后将沉淀及活性炭与溶液分离，获得烟草赖百当类化合物酊剂，酊剂40℃减压浓缩得到烟草赖百当类化合物浸膏。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用形式为绿色农药制剂。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述制剂为水乳剂或微乳剂。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述制剂中顺-冷杉醇的浓度为0.5-1％。
10.权利要求7的应用，其特征在于，将制剂用水稀释成浓度10-25mg/L的施用液灌根，灌根用量为30-50mL/株。
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