CN111374984A - 克洛索隆在抗结核分枝杆菌感染中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种针对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)中的甲硫氨酰氨肽酶(MetAP)的化合物，该化合物为克洛索隆，它对结核分枝杆菌中的甲硫氨酰氨肽酶具有显著的活性抑制作用。本发明提供的化合物能够用来制备针对结核分枝杆菌中甲硫氨酰氨肽酶的小分子抑制剂，可用于制备抗Mtb感染的药物。
Description
技术领域
本发明涉及制药领域，特别涉及克洛索隆在抗结核分枝杆菌感染中的应用。
背景技术
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)是引起结核(TB)的致病性细菌，主要通过呼吸道传播，能够引起咳嗽、胸痛、咯血、呼吸困难等症状。健康人感染结核菌并不一定发病，只有在机体免疫力下降时才发病。世界卫生组织(WHO)统计表明，全世界每年发生结核病800～1000万，每年约有300万人死于结核病，是造成死亡人数最多的单一传染病。1993年WHO宣布“全球结核病紧急状态”，认为结核病已成为全世界重要的公共卫生问题。
结核菌属分枝杆菌，于1882年由德国微生物学家Robert Koch发现。在显微镜下，结核菌为细长稍弯曲或直的杆菌。结核分枝杆菌是专性需氧菌，生长很缓慢，在固体培养基上，结核菌增代时间为18-20h，培养时间需8天以上至8周，在大部分培养基上菌落呈粗糙型。Mtb具有蜡质细胞壁，对干燥环境以及强酸强碱都具有极强的抵抗力，也不会被多种化学消毒剂渗透。结核菌实际上包括人型、牛型、鼠型和非洲型，为结核分枝杆菌复合群，其中人型、牛型和非洲型为致病菌。
结核病是一个全球性的健康问题，每年都能引起100多万人的死亡，近年来，在结核病的控制方面，由于抗生素的滥用及其联合用药，导致多种耐药菌株的出现，尤其是Mtb和HIV的协同感染已被证实是致死性的。近年来，来自TB高发国家的移民、HIV携带者和社会边缘人群(如药物成瘾者和囚犯)中TB的发病率也呈上升趋势，这些现状都使我们控制结核分枝杆菌的面临严峻的挑战。所以，我们迫切的需要寻找结核分枝杆菌中的新型靶点，进而针对这些靶点开发新型的抗结核分枝的药物。结核分枝杆菌编码的蛋白酶具有100多种，这些蛋白酶的结核分枝杆菌的生长周期中发挥着重要的作用，然而，对于蛋白酶的研究却很少。在蛋白的翻译过程中，氨肽酶是选择性的除去新合成蛋白质和肽的N-末端的蛋白酶，是维持许多病原体微生物生长必不可少的蛋白酶。甲硫氨酰氨肽酶(MetAP)能够除去每个活细胞中新合成蛋白质中的甲硫氨酸，而抑制这个功能对细胞生存是有害的。故MetAP是一个非常好的开发抗结核药物的靶点。因此，MetAP也成为一个关键的抗结核分枝杆菌的药物靶标，所以针对MetAP进行抑制剂筛选对结核分枝杆菌感染的相关的药物研发具有很大的意义。
克洛索隆，英文名是Clorsulon，主要用于治疗和预防牛肝片吸虫的成虫引起的胆管炎和肝炎。但迄今为止，克洛索隆在抗结核分枝杆菌感染中的应用未见报道。
发明内容
针对相关技术中的问题，本发明提供克洛索隆在抗结核分枝杆菌感染中的应用。
本发明提供了式I所示化合物(克洛索隆)或其光学异构体、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物在制备治疗结核分枝杆菌感染药物中的用途：
进一步地，克洛索隆是抑制结核分枝杆菌中甲硫氨酰氨肽酶的药物。
进一步地，克洛索隆是治疗结核分枝杆菌感染的药物。
本发明还提供了式I所示化合物或其光学异构体、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物在制备抑制结核分枝杆菌的药物中的用途：
其中，所述药物是抑制结核分枝杆菌中甲硫氨酰氨肽酶的药物。
本发明提供了一种治疗结核分枝杆菌感染的药物，它是以克洛索隆为活性成分，加上一种或多种药学上可接受的载体制备而成的制剂。
进一步地，所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。
更进一步地，所述药物是含有所述药物的注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂。
术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。
所述药学上可接受的辅料，它具有一定生理活性，但该成分的加入不会改变上述药物组合物在疾病治疗过程中的主导地位，而仅仅发挥辅助功效，这些辅助功效仅仅是对该成分已知活性的利用，是医药领域惯用的辅助治疗方式。若将上述辅助性成分与本发明药物组合物配合使用，仍然应属于本发明保护的范围。
本发明提供的以克洛索隆为活性成分的药物对结核分枝杆菌中的甲硫氨酰氨肽酶具有很好的活性抑制效果，可应用于抗结核分枝杆菌感染。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1是克洛索隆对结核分枝杆菌中的甲硫氨酰氨肽酶的抑制作用示意图；
图2是克洛索隆对结核分枝杆菌的抑菌效果图。
具体实施方式：
本发明所涉及克洛索隆CAS号为60200-06-8，购买于Selleck.cn公司。
实施例1、结核分枝杆菌中甲硫氨酰氨肽酶(MetAP)的表达与纯化
根据文献(Lu J P,Ye Q Z.Expression and characterization of Mycobacter-ium tuberculosis methionine aminopeptidase type 1a.[J].Bioorganic&MedicinalChemistry Letters,2010,20(9):2776-2779.)
(1)将含有编码MetAP基因的pET28a载体转化Escherichia coli BL21(DE3)的菌株，并用LB平板培养基(含50mg/L卡那霉素)筛选阳性克隆。
(2)在平板上挑取阳性克隆，37℃培养过夜后转入0.8L的LB培养基(含50mg/L卡那霉素)，当其在600nm波长处的吸光值(即OD600)达到0.6时，加入0.1mM IPTG(Isopropylβ-D-Thiogalactoside，异丙基硫代半乳糖苷)，在20℃培养18小时。
(3)用5000rpm离心10min收集细胞后高压破菌，破菌液用10000rpm离心30min后收集上清液。
(4)将上清液加入破菌buffer(50mM Hepes,0.5M NaCl,pH 8.0)预平衡的Ni-NTA亲和层析柱中，使目的蛋白与Ni充分结合，使目的蛋白充分富集。
(5)用含有20mM咪唑的破菌buffer洗掉未结合的杂蛋白，考马斯亮蓝G250检测流出液不变蓝时，说明大部分杂蛋白被冲洗干净。用含150mM咪唑的破菌buffer洗脱MetAP，然后用10kD的浓缩管浓缩换液，用阴离子交换层析进行纯化来获得具有电荷均一性的目的蛋白。
实施例2、MetAP的活性测定
采用纯度大于95％的Met-pNA作为底物；使用酶标仪进行测定，测定光吸收波长为405nm。
蛋白缓冲液的pH＝8.0，其组分为25mM Hepes、150mM NaCl、40μM Ni2+和10％甘油，用缓冲液配置MetAP(终浓度4μM)，加入溶解于DMSO(二甲基亚砜)的化合物(终浓度为20μM)，室温放置5min，迅速加入底物Met-pNA，底物浓度为200μM。654rpm震荡10s，检测吸光度值。每20s记录一次吸光值读数，共测定1200s。阴性对照不加备选样品，其它实验条件均相同。
以时间为X轴，吸光度值为Y轴可得酶活动力学曲线。通过酶标仪记录的酶反应的相关参数，根据吸光值以及反应时间，采用GraphPad Prism5软件分析酶促反应的速率。设定V0为不加抑制剂的酶促反应的初速度，Vi为加抑制剂的酶促反应的初速度。根据酶促反应速率，计算出每个化合物的抑制率Ir(Inhibition Rate,Ir)(1-Vi/V0)。
对化合物进行复筛，排除操作失误造成假阳性的可能。
实施例3、刃天青微孔板法测定化合物对结核分枝杆菌的最小抑菌浓度
(1)菌液培养
在超净台中按照1:200的比例接种50uL的MC2155的甘油菌于50mL的离心管中，按照比例加入7H9培养基，37℃220rpm振荡培养，至OD600＝1.2，(三周内可以重复使用)。加入在超净台中以1:100比例转接种子液到5mL 7H9液体培养基中，37℃220rpm振荡培养，至OD600＝0.5(对数期)。取菌液将其调整到OD600＝0.15，并稀释100倍使用。
(2)阳性化合物利福平的稀释
实验中以利福平作为阳性对照，梯度稀释依次为，64ug/ml、32ug/ml，16ug/ml、8ug/ml、4ug/ml、2ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0.25ug/ml，0.125ug/ml、0.0625ug/ml、0.03125ug/ml，一般保证第6个稀释梯度为该药对野生型菌株的最小抑菌浓度。
(3)药物克洛索隆的稀释
按2倍稀释梯度进行药物稀释，浓度依次是，512ug/ml、256ug/ml、128ug/ml、64ug/ml、32ug/ml，16ug/ml、8ug/ml、4ug/ml、2ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0.25ug/ml。
(4)向96孔板中加40μL 7H9(含有Tween-80与ADS)液体培养基，每个被检测菌株设3个药物平行，每一行加2μL同等浓度药物，再加稀释好的菌液40μL，轻轻摇动混匀，将其放置于37℃培养箱孵育48h.
(5)在超净台中加入8μL过滤除菌的0.02％(w/v)刃天青，继续孵育4h，于倒置放大镜上观察细菌生长情况，呈粉红色为阳性；呈蓝色则为阴性。所测得的MIC值为64μg/mL(0.114mM)。
以上结果表明，克洛索隆对结核分枝杆菌中甲硫氨酰氨肽酶以及结核分枝杆菌都具有很好的抑制效果，在制备抗结核分枝杆菌中甲硫氨酰氨肽酶的小分子抑制剂方面有很大应用潜力，可以应用于治疗结核分枝杆菌感染。
Claims (8)
1.式I所示化合物或其光学异构体、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物在制备治疗结核分枝杆菌感染药物中的用途：
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物是抑制结核分枝杆菌的药物。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述药物是抑制结核分枝杆菌中甲硫氨酰氨肽酶的药物。
4.式I所示化合物或其光学异构体、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物在制备抑制结核分枝杆菌的药物中的用途：
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述药物是抑制结核分枝杆菌中甲硫氨酰氨肽酶的药物。
6.一种治疗结核分枝杆菌感染的药物，其特征在于：它是以式I所示化合物为活性成分，加上一种或多种药学上可接受的载体制备而成的制剂。
7.根据权利要求6所述药物，其特征在于：所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。
8.根据权利要求1-7任一项所述药物，其特征在于：它是含有所述药物的注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂。
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