CN110787164A

CN110787164A - 奥替尼啶在抑制乙酰基转移酶和抗分枝杆菌感染中的应用

Info

Publication number: CN110787164A
Application number: CN201910953038.3A
Authority: CN
Inventors: 刘祥; 赵欣; 杨海涛; 陈榕; 朱倩; 张晶
Original assignee: TIANJIN INTERNATIONAL JOINT ACADEMY OF BIOMEDICINE; Nankai University
Current assignee: TIANJIN INTERNATIONAL JOINT ACADEMY OF BIOMEDICINE; Nankai University
Priority date: 2019-10-08
Filing date: 2019-10-08
Publication date: 2020-02-14

Abstract

本申请的实施例提供了奥替尼啶在乙酰基转移酶抑制剂以及抗结核分枝杆菌的感染中的应用，该奥替尼啶的结构式为：

实验表明，奥替尼啶可较好的抑制乙酰基转移酶并且对结核分枝杆菌及临床结核分枝杆菌广泛耐药菌株499、421具有显著的抑制效果。

Description

奥替尼啶在抑制乙酰基转移酶和抗分枝杆菌感染中的应用

技术领域

本发明涉及药学技术领域，具体地，涉及奥替尼啶在抑制乙酰基转移酶和抗分枝杆菌感染中的应用。

背景技术

结核病(TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tubercuosis，Mtb)引起的传染病，主要通过呼吸道传播，能够引起咳嗽、胸痛、咯血，呼吸困难等症状，健康人感染结核菌并不一定发病，只有在机体免疫力下降时才发病。据世界卫生组织估计，虽然全球对结核病的感染进行大力度的遏制，但每年仍有1040万新患者患上结核病(TB)，每年导致全球约150万人死亡。1993年WHO宣布“全球结核病紧急状态”，认为结核病已成为全世界重要的公共卫生问题。

结核菌于1882年由德国微生物学家Robert Koch发现。在显微镜下，结核菌为细长稍弯曲或直的杆菌。结核分枝杆菌是专性需氧菌，生长很缓慢，在固体培养基上，结核菌增代时间为18-20h，培养时间需8天以上至8周，在大部分培养基上菌落呈粗糙型。Mtb具有蜡质细胞壁，对干燥环境以及强酸强碱都具有极强的抵抗力，也不会被多种化学消毒剂渗透。结核菌实际上包括人型、牛型、鼠型和非洲型，为结核分枝杆菌复合群，其中人型、牛型和非洲型为致病菌。

多药耐药和广泛耐药是制约抗菌药物临床使用的关键因素。抗结核药物也同样存在这些现象。最近的流行病学调查显示，在肺结核感染病例中有超过40％的结核菌对至少一种二线药物耐药。耐药结核病的治疗所需治疗周期长于普通患者，治疗费用也是普通患者的100倍。因此，发现并研发新的抗结核药物对患者及其家庭、社会都有重要意义。结核分枝杆菌编码的蛋白酶具有100多种，这些蛋白酶对结核分枝杆菌的生长周期中发挥着重要的作用，然而，对于蛋白酶的研究却很少。

发明内容

申请人在研究中发现，乙酰基转移酶Eis是一个关键的抗结核分枝杆菌的药物靶标，所以针对乙酰基转移酶酶进行抑制剂筛选对结核分枝杆菌感染的相关的药物研发具有很大的意义。

在现有研究中，奥替尼啶，英文名是Octenidine dihydrochloride，是一种抗菌剂，它的作用与季铵类化合物类似，但其具有更广的抗菌谱，常被用于皮肤、粘膜和开放性伤口的消毒。但迄今为止，奥替尼啶在抗结核分枝杆菌感染中的应用未见报道。

基于此，本申请提供了一种奥替尼啶在乙酰基转移酶的抑制剂中的应用，其特征在于，所述奥替尼啶的结构式为：

本发明还提供了上述奥替尼啶在抗结核分枝杆菌的感染中的应用。

在上述应用中，所述奥替尼啶对所述结核分枝杆菌的最低抑菌浓度为1.56μg/mL。

在上述应用中，所述结核分枝杆菌包括人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌和非洲型结核分枝杆菌。

本发明还提供了上述奥替尼啶在抗结核分枝杆菌的耐药菌株中的应用。

在上述应用中，所述奥替尼啶对所述结核分枝杆菌的耐药菌株的最低抑菌浓度为0.78μg/mL。

本发明还提供了一种抗分枝杆菌的感染的药物，其特征在于，包括：奥替尼啶以及一种或多种药学上可接受的载体。

在上述药物中，所述一种或多种药学上可接受的载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂和增效剂中的一种或多种。

在上述药物中，所述药物的剂型为注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂。

在上述药物中，述药物的的给药方式包括口服、经皮、静脉或肌肉注射。

本发明可以实现以下优势：

本发明提供了奥替尼啶在乙酰基转移酶eis的抑制剂以及抗结核分枝杆菌中的应用，实验表明，奥替尼啶可较好的抑制乙酰基转移酶并且对结核分枝杆菌及临床结核分枝杆菌广泛耐药菌株499、421具有显著的抑制效果。

附图说明

图1是奥替尼啶对结核分枝杆菌中的乙酰基转移酶的抑制作用示意图。

图2是奥替尼啶对结核分枝杆菌中的乙酰基转移酶的IC50的测定示意图。

具体实施方式

为了更好地说明本发明，下面将详细描述本发明的具体实施方式，但不以任何方式限制本发明。

本发明提供了一种奥替尼啶在乙酰基转移酶抑制剂中的应用，其特征在于，该奥替尼啶的结构式为：

实验表明，乙酰基转移酶可较好的抑制乙酰基转移酶，此外，乙酰基转移酶Eis是一个关键的抗结核分枝杆菌的药物靶标，因此，本发明又提供了一种奥替尼啶在抗结核分枝杆菌和抗结核分枝杆菌的耐药菌株的感染中的应用以及与结核分枝杆菌感染的相关的药物。

具体实施例如下：

1.结核分枝杆菌中的乙酰基转移酶(Eis)的表达与纯化

根据文献(Chen W,Biswas T,Porter VR,Tsodikov OV,Garneau-Tsodikova S(2011)Unusual regioversatility of acetyltransferase Eis,a cause of drugresistance in XDR-TB.Proc Natl Acad Sci USA 108:9804–9808)来表达和纯化乙酰基转移酶(Eis)

(1)将含有编码Eis基因的pET28a载体转化Escherichia coli BL21(大肠杆菌)(DE3)的菌株，并用LB平板培养基(含50mg/L卡那霉素)筛选阳性克隆。

(2)在LB平板培养基上挑取阳性克隆，37℃培养过夜后转入0.8L的LB培养基(含50mg/L卡那霉素)，当其在600nm波长处的吸光值(即，OD600)达到0.6时，加入0.1mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-Thiogalactoside)，在16℃培养16小时。

(3)用5000rpm离心10min收集细胞后高压破菌；破菌液用10000rpm离心30min后收集上清液。

(4)将上清液加入破菌buffer(缓冲液)(50mM Tris-HCl(三(羟甲基)氨基甲烷),150mM NaCl(氯化钠),pH 8.0)预平衡的Ni(镍)-NTA(氮川三乙酸)亲和层析柱中，使目的蛋白与Ni充分结合，使目的蛋白充分富集。

(5)用含有10mM咪唑的破菌buffer洗掉未结合的杂蛋白，考马斯亮蓝G250检测流出液不变蓝时，说明大部分杂蛋白被冲洗干净。用含300mM咪唑的破菌buffer洗脱Eis蛋白酶，然后用30kD的浓缩管浓缩换液，用凝胶过滤层析色谱进行纯化来获得具有均一性较好的目的蛋白。

2.Eis的活性测定

采用纯度大于93％的乙酰辅酶A(购自sigma)，纯度99.4％的新霉素B(购自陶素)作为底物；反应检测剂DTNB(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸))(购自希恩思)；吸光度测定的仪器为Varioskan flash全波长扫描式多功能读数仪，测定波长为412nm。

蛋白缓冲液组分为50mM Tris-HCl,150mM NaCl，5％甘油，pH＝8.0，用缓冲液配置Eis(终浓度250nM)，底物新霉素B(NEO)225.3μM，加入溶解于DMSO(二甲基亚砜)的化合物(终浓度为20μM)，室温放置5min，迅速(例如，时间小于1秒)加入另一种底物乙酰辅酶A和DTNB，底物浓度分别为172.8μM和0.5mM。每30s记录一次荧光读数，共测定3600s，在412nm处检测吸光度。阴性对照不加备选样品，其它实验条件均相同。

以时间为X轴，吸光度为Y轴可得酶活动力学曲线。通过酶标仪记录的酶反应的相关参数，根据吸光度以及反应时间，采用GraphPad Prism5软件分析前480s的酶促反应的速率。设定V0为不加抑制剂的酶促反应的初速度，Vi为加抑制剂的酶促反应的初速度。根据酶促反应速率，计算出每个化合物的剩余活性Ra(Residual Activity,Ra)(Vi/V0)以及抑制率Ir(Inhibition Rate,Ir)(1-Vi/V0)。

对于抑制率＞80％的化合物进行复筛，排除操作失误造成假阳性的可能。

3、化合物奥替尼啶IC50的测定

在测定IC50时，我们首先配置实验所需的蛋白Eis终浓度为80nM，再用95％的DMSO配置底物奥替尼啶，使其终浓度为20μM。首先根据初筛结果粗略的设定13个抑制剂浓度(一般是通过梯度稀释得到)，奥替尼啶的浓度分别是12.8mM、6.4mM、3.2mM、1.6mM、0.8mM、0.4mM、0.2mM、0.1mM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、0μM。之后与之前的操作基本一样，先将蛋白加入酶标板中与抑制剂在37℃孵育5min后，迅速加入底物，记录时间与吸光度变化曲线。通过Graphpad prism 5.0软件得到蛋白酶反应初速率，并拟合化合物浓度与抑制率的量效关系曲线，得出IC50值。

4、微孔板阿尔玛蓝显色法测定化合物对Mycobacterium tuberculosis(结核分支杆菌)及耐药临床菌株的最小抑菌浓度

刮取罗氏培养基(购自济南赛尔生物科技有限公司)上生长3周左右的新鲜菌落置于磨菌瓶中研磨均匀，稀释菌悬液并比浊至1麦氏，再以1：20比例用7H9培养基(购自济南赛尔生物科技有限公司)稀释菌液。向预制含有不同浓度奥替尼啶的96孔板的每孔中加入100μL菌液，37℃培养7～9天(d)，再向微孔板中加入20μL阿尔玛蓝和50μL 5％Tween-80(失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚)的预混显色液，37℃继续培养24h后观察96孔板颜色变化。判定标准：蓝色孔为无菌生长，粉色孔为有菌生长，蓝色孔的最低药物浓度记为能抑制结核分枝杆菌生长的MIC(最低抑菌浓度)，测定结果见下表1：

表1奥替尼啶和卡那霉素对结核分枝杆菌及临床广泛耐药菌株(XDR-TB)499、421的MIC

从上表1中可以看出，奥替尼啶在抑制结核分枝杆菌H37Rv时，MIC为1.56μg/mL,，二线抗结核药物卡那霉素在H37Rv上的MIC为2.5μg/mL，而奥替尼啶在临床耐药菌株499、421上的MIC均为0.78μg/mL，卡那霉素均为5μg/mL。相比之下，奥替尼啶比临床上使用的一些药物(例如，卡那霉素)在结核分枝杆菌及其耐药菌株上具有更好的抑菌效果。

综上，奥替尼啶在抗结核分枝杆菌感染中具有较大的应用价值，在制备抗结核分枝杆菌抑制剂等药物方面有较大的应用潜力，有望成为抗结核分枝杆菌感染的潜在药物。

以上所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常用的方法。

以上仅为本发明的具体实施方式，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种奥替尼啶在乙酰基转移酶抑制剂中的应用，其特征在于，所述奥替尼啶的结构式为：

2.根据权利要求1所述的奥替尼啶在抗结核分枝杆菌的感染中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述奥替尼啶对所述结核分枝杆菌的最低抑菌浓度为1.56μg/mL。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述结核分枝杆菌包括人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌和非洲型结核分枝杆菌。

5.根据权利要求1所述的奥替尼啶在抗结核分枝杆菌的耐药菌株中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述奥替尼啶对所述结核分枝杆菌的耐药菌株的最低抑菌浓度为0.78μg/mL。

7.一种抗分枝杆菌的感染的药物，其特征在于，包括：奥替尼啶以及一种或多种药学上可接受的载体。

8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述一种或多种药学上可接受的载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂和增效剂中的一种或多种。

9.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂。

10.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药物的的给药方式包括口服、经皮、静脉或肌肉注射。