CN101942501A - 高通量筛选结核分枝杆菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种高通量筛选结核分枝杆菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂的方法，是利用分子克隆技术从结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组中克隆了全长glmU基因，并对全glmU基因进行改造，只保留编码葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶的基因片段，同时建立了高表达葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶的大肠杆菌工程菌株。利用亲和层析技术从工程菌株中纯化得到葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶，建立了快速、准确测定葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶活性的方法，该酶活性测定方法是筛选葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂的分子模型，用于高通量筛选组合化合物库、中药及天然产物的结核分枝杆菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂。
Description
技术领域：
本发明涉及筛选抗结核药物的方法，尤其是一种高通量筛选结核分枝杆菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂的方法。
背景技术：
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起结核病(tuberculosis)的病原菌，据WHO报道，目前全球有近1/3的人已感染结核分枝杆菌，每年新发结核病人约9000万。由于多耐药(multi drug resistant，MDR)菌株及广泛耐药(extensive drug resistant，XDR)菌株的出现，现有一些一线及二线抗结核药物都无法有效地治愈结核病，导致每年约有200万人死亡，结核病已成为全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。
目前，新药研制已由过去大多数随机、偶然和被动的药物发现过程变为主动的以明确靶标为依据的新药开发过程，以细菌代谢途径中的酶或蛋白质作为靶标来筛选先导化合物，是目前研发新的抗生素的一种策略。研究表明，分枝杆菌与革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌相比，具有特殊的细胞壁结构，其核心结构由分枝菌酸、聚阿拉伯半乳糖及肽聚糖三种大分子所构成。分枝菌酸由含70-90碳原子的脂类分子组成，形成致密的低通透性外层，肽聚糖位于细胞壁的最内层并与细胞质膜相连。分枝菌酸与中层的聚阿拉伯糖(由呋喃型阿拉伯糖残基聚合而成)及聚半乳糖(由呋喃型半乳糖残基聚合而成)连接后再通过衔接二糖(L-鼠李糖-N-乙酰葡糖胺L-Rhamnose-N-GlcNAc)共价连接到肽聚糖大分子上。因此，衔接二糖是维持分枝杆菌细胞壁完整性的重要结构。
N-乙酰葡糖胺既是二糖衔接分子的组成成分，又是肽聚糖的组成成分，其糖基供体为UDP-N-乙酰葡糖胺。UDP-N-乙酰葡糖胺的生物合成途径包括由三种酶所催化的四步反应，其中以glmU基因编码的GlmU蛋白酶是双功能酶，其基因C端具有葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶活性，N端具有N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷转移酶活性，分别催化第三步的转乙酰反应及第四步的转尿苷反应。乙酰化作用将乙酰CoA中的乙酰基转移给葡糖胺-1-磷酸，生成N-乙酰葡糖胺-1-磷酸；转尿苷反应将UTP的α-磷酸转移给N-乙酰葡糖胺-1-磷酸，生成UDP-乙 酰葡糖胺。
现有技术构建了glmU基因敲除菌株，并通过测定其在允许温度和非允许温度条件下的生长曲线，确定glmU是分枝杆菌生长必需基因[1]，与Sassetti等人的高密度突变实验的结果一致[2]。GlmU蛋白是N-乙酰葡糖胺赖以存在的必要条件，亦是维持分枝杆菌细胞壁完整性的关键，尤其是葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶并不存在于人体细胞中，如以葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶为靶酶所研发的抗结核药物既能杀灭结核分枝杆菌又不会对人体产生毒副作用。但是，迄今为止还没有以葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶为抗结核药物的作用靶标，从已有组合化合物库及中药中筛选出有效的葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂的相关报道。
发明内容：
本发明是以参与结核分枝杆菌细胞壁中关键组分生物合成的葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶为对象，提供一种高通量筛选结核分枝杆菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂的方法。
本发明的技术解决方案是：一种高通量筛选结核分枝杆菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂的方法，其特征在于依次按如下步骤进行：
a.用分子克隆技术从结核分枝杆菌H37Rv基因组中克隆glmU基因，从glmU基因的5’端进行DNA序列删除，获得保留3’端的glmU基因片段glmU-C；
b.将基因片段glmU-C克隆到pET载体，构建出pET-glmU-C表达载体；
c.将pET-glmU-C表达载体转化到大肠杆菌中，构建出表达葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶的工程菌株MTGC08(Escherichia coli MTGC08)，保藏编号CGMCC3419；
d.将工程菌株MTGC08接种到卡那霉素的LB培养基中，在37℃培养4小时，用浓度为0.2mM的IPTG进行诱导表达GlmU-C蛋白；
e.收获细菌，超声破碎细胞，离心后取上清，采用组氨酸-Ni2+亲和层析技术纯化得到GlmU-C蛋白；
f.将2ug GlmU-C蛋白与pH 7.5的50mM Tris-HCl、0.4mM乙酰CoA及0.4mM葡糖胺-1-磷酸构成50μl的酶促反应体系，将被筛选物按0.1～5ug/ml浓度加入酶促反应体系中，在30℃孵育5分钟，加入50μl 6M盐酸胍终止反应，再加入50μl DTNB显色剂显色10分钟，用酶标仪检测405nm处的吸光度值；
g.将所测吸光度值与反应条件同f步骤、酶促反应体系中无被筛选物时测 得的GlmU-C蛋白在405nm处的标准吸光度值进行对比，筛选结核分枝杆菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂。
本发明是以结核分枝杆菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶为靶标所建立的筛选新型抗结核药物的方法，可在小体积反应体系中对葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶的活性进行测定，因此，可在96孔板中同时完成96个酶促反应，灵敏、快速准确地在现有组合化合物库、中药及天然物中筛选出葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂，制备抗结核药物。因葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶是N-乙酰葡糖胺赖以存在的必要条件，亦是维持结核分枝杆菌细胞壁完整性的关键，抑制葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶即抑制了衔接二糖的生物合成途径，从而破坏结核分枝杆菌细胞壁的完整性，导致细菌的死亡，具有高药效性；另外，在人体细胞中，UDP-乙酰葡糖胺的合成途径与结核分枝杆菌有所不同，不存在葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶，因此将编码GlmU双功能酶的glmU基因的5’端删除，只保留glmU基因的3’端，以编码只有葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶活性的GlmU-C蛋白。结核分枝杆菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶所催化的反应在人体细胞中不存在，以葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶为靶酶所研发的抗结核药物将对人体无害，克服了现有抗菌药物也杀害正常细胞的缺点。
菌株MTGC08保藏日期：2009-11-06。
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
菌株保藏代号：CGMCC 3419。
分类命名：大肠埃希氏菌 Escherichia coli
具体实施方式：
a.用分子克隆技术从结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组DNA(购自AmericanType Culture Collection，ATCC#为25618D-5)中克隆glmU基因，从glmU基因的5’端进行DNA序列删除，获得保留3’端的glmU基因片段glmU-C，该基因片段编码的C端GlmU蛋白是葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶结构域；
b.将基因片段glmU-C克隆到pET-29b(+)载体(购自Novagen公司，产品号为69872)，构建出pET-glmU-C表达载体；
c.将pET-glmU-C表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)(购自Novagen公司，产品号为69450)中，构建出表达葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶的工程菌株MTGC08(Escherichia coli MTGC08)，保藏编号CGMCC 3419(利用HPLC方法确定纯化的GlmU-C蛋白具有葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶活性)；
d.将工程菌株MTGC08接种到卡那霉素的LB培养基中，在37℃培养 4小时，用浓度为0.2mM的IPTG进行诱导表达GlmU-C蛋白；
e.收获细菌，超声破碎细胞，离心后取上清，采用组氨酸-Ni2+亲和层析技术纯化得到GlmU-C蛋白；
f.将2ug GlmU-C蛋白与pH 7.5的50mM Tris-HCl、0.4mM乙酰CoA及0.4mM葡糖胺-1-磷酸构成50μl的酶促反应体系，将被筛选物按0.1～5ug/ml浓度加入酶促反应体系中，在30℃孵育5分钟，加入50μl 6M盐酸胍终止反应，再加入50μl DTNB显色剂(购自Sigma公司，产品号为D8130)显色10分钟，用酶标仪检测405nm处的吸光度值；
g.将所测吸光度值与反应条件同f步骤、酶促反应体系中无被筛选物时测得的GlmU-C蛋白在405nm处的标准吸光度值(0.452)进行对比，筛选结核分枝杆菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂。
葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶活性测定原理如下列反应式(1)、(2)：
葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶催化葡糖胺-1-磷酸与乙酰CoA反应，产生乙酰葡糖胺-1-磷酸和SH-CoA。因5，5’-二巯基-2-硝基苯甲酸(DTNB)能够与含巯基的化合物或游离巯基发生化学反应，产生2-硝基-5-巯基苯甲酸(TNB)和二硫化物，其中TNB呈黄色，在405nm处有吸收峰。因SH-CoA的还原性巯基，所以可用5，5’-二巯基-2-硝基苯甲酸(DTNB)测定。通过测定反应物在 405nm处的光吸收值，确定葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶的活性。当酶促反应体系含有葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂，则反应物在405nm处的光吸收值降低。
参考文献：
1.Zhang W，Jones VC，Scherman MS，et al.Expression，essentiality，and amicrotiter plate assay for mycobacterial GlmU，the bifunctionalglucosamine-1-phosphate acetyltransferase and N-acetylglucosamine-1-phosphateuridyltransferase.Int J Biochem Cell Biol.2008，40(11)：2560-2571.
2.Sassetti CM，Boyd DH，Rubin EJ.Genes required for mycobacterial growthdefined by high density mutagenesis.Molecular Microbiology 2003，48(1)：77-84.
Claims (1)
1.一种高通量筛选结核分枝杆菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂的方法，其特征在于依次按如下步骤进行：
a.用分子克隆技术从结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组中克隆glmU基因，从glmU基因的5’端进行DNA序列删除，获得保留3’端的glmU基因片段glmU-C；
b.将基因片段glmU-C克隆到pET载体，构建出pET-glmU-C表达载体；
c.将pET-glmU-C表达载体转化到大肠杆菌中，构建出表达葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶的工程菌株MTGC08(Escherichia coli MTGC08)，保藏编号CGMCC3419；
d.将工程菌株MTGC08接种到卡那霉素的LB培养基中，在37℃培养4小时，用浓度为0.2mM的IPTG进行诱导；
e.收获细菌，破碎细胞，离心后取上清，采用组氨酸-Ni2+亲和层析技术纯化得到GlmU-C蛋白；
f.将2ug GlmU-C蛋白与pH 7.5的50mM Tris-HCl、0.4mM乙酰CoA及0.4mM葡糖胺-1-磷酸构成50μl的酶促反应体系，将被筛选物按0.1～5ug/ml浓度加入酶促反应体系中，在30℃孵育5分钟，加入50μl 6M盐酸胍终止反应，再加入50μl DTNB显色剂显色10分钟，用酶标仪检测405nm处的吸光度值；
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| CN108823098A (zh) * | 2018-06-30 | 2018-11-16 | 浙江工业大学 | 一种r-2-(4-羟基苯氧基)丙酸合成菌株的高通量筛选方法 |
| CN109456149A (zh) * | 2018-11-02 | 2019-03-12 | 大连医科大学 | 含芳香环基团的玫瑰烷型二萜、制备方法及在制备抗结核药物中的应用 |
| CN110787164A (zh) * | 2019-10-08 | 2020-02-14 | 天津国际生物医药联合研究院 | 奥替尼啶在抑制乙酰基转移酶和抗分枝杆菌感染中的应用 |
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2009
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