CN111373033A

CN111373033A - 脯氨酸羟化酶及其相关用途、方法和产品

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Publication number: CN111373033A
Application number: CN201880075605.3A
Authority: CN
Inventors: M·伯尼茨-杜拉特; H·伊丁; D·韦茨尔; A·辛兹曼
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2017-11-23
Filing date: 2018-11-20
Publication date: 2020-07-03
Also published as: WO2019101722A1; TW201932595A; JP7289836B2; AR113907A1; US10968469B2; EP3714046A1; JP2021503904A; US20190153491A1

Abstract

本发明涉及蛋白质作为羟化酶的用途，包含该蛋白质的宿主细胞，该蛋白质或宿主细胞在羟基‑哌可酸(HPA)生产中的用途，生产和纯化HPA的方法，生产该蛋白质的方法、突变体蛋白质和编码该突变体蛋白质的核酸，以及包含编码该蛋白质的核酸的载体。

Description

脯氨酸羟化酶及其相关用途、方法和产品

感谢政府支持：本发明是在美国卫生和公共服务部(Department of Health andHuman Services)授予的合同号HHSO100201600038C的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

本发明涉及蛋白质作为羟化酶的用途，包含该蛋白质的宿主细胞，该蛋白质或宿主细胞在羟基-哌可酸(HPA)生产中的用途，HPA的生产方法，生产该蛋白质、突变体蛋白质和编码该突变体蛋白质的核酸，以及包含编码该蛋白质的核酸的载体的方法。

环状羟基氨基酸是研发新候选治疗药物的适当结构单元。这些化合物本身就是肽合成中的β-转角诱导剂和良好的酶抑制剂。实际上，由于主要作为酶抑制剂的这类化合物某些代表的潜在生物活性，羟基氨基酸的立体选择性合成在近数十年是一个正迅速发展的领域。特别是构象受限的羟基氨基酸，例如羟基化的哌可酸是非常令人感兴趣的靶分子。例如，化合物(2S,4R)-4-羟基-哌可酸是已从Calliandra pittieri和Stophantus scandeus中分离得到的天然产物，并且顺式5-羟基取代的哌可酸骨架是在微生物并还在植物的生物碱中经常发现的(常山碱(febrifugine)、pseudoconhidrine)。此外，证明从Baphiaracemosa种子分离的三羟基-哌可酸具有特定的人肝脏β-葡萄糖苷酶抑制活性。

5-羟基-哌可酸(HPA)是用于合成药理活性化合物的通用结构单元，例如用于具有作为β-内酰胺酶抑制剂潜力的二氮杂双环辛烷衍生物(参见例如美国专利申请US 2016/0264573或PCT公开书WO 02/10172)。

在现有技术，5-羟基-哌可酸衍生物及其类似物的不同化学合成方法是已知的，例如由D-葡萄糖开始，N-Boc保护的顺式-(2R,3S)-3-羟基-哌可酸的立体选择性合成。然而，羟基-哌可酸的化学合成，特别是区域或立体选择性合成，通常是无效、复杂且昂贵的。因此，本发明人旨在提供基于特定酶的使用来生产和纯化5-羟基-哌可酸，特别是顺式-5-羟基-哌可酸的替代方法。

在本发明中，已经鉴定了两种蛋白质，其出人意料地显示羟化酶活性。具体地讲，可以表明两种称为PH05和PH12的酶以哌可酸羟化酶活性特别是L-哌可酸羟化酶活性，以及对5-HPA的良好区域选择性和对顺式-5-HPA特别是(2S,5S)-顺式-5-HPA的立体选择性为特征(参见实施例)。

因此，第一方面，本发明涉及蛋白质作为羟化酶的用途，其中所述蛋白质包含：

-SEQ ID NO:1的多肽或其具有哌可酸羟化酶活性的功能活性变体，其中该功能活性变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少75％的序列同一性；和/或

-SEQ ID NO:2的多肽或其具有哌可酸羟化酶活性的功能活性变体，其中该功能活性变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％的序列同一性。

酶是大分子生物催化剂，通常是蛋白质，并可加速化学反应。酶可作用的分子是底物，并且酶将底物转化为产物。像所有催化剂一样，酶通过降低其活化能来提高反应速率。

羟化酶是能够催化将羟基(-OH)引入化合物的反应的酶。羟基化通常是有机化合物的氧化降解的第一步。通常将羟化酶基于待被羟基化的化合物进行分类。本发明羟化酶使脯氨酸羟化；因此，将该酶称为脯氨酸羟化酶。脯氨酸羟化酶是α-酮戊二酸依赖性双加氧酶，该酶将其活性位点的Fe²⁺用于羟化反应。双加氧酶或氧转移酶将分子氧用于羟基化反应，并将分子氧(O₂)的两个原子引入反应产物中。用脯氨酸羟化酶，通常将第一个氧转移到共底物α-酮戊二酸中，其被转化为琥珀酸，并将第二个氧原子转移到脯氨酸中。通常将抗坏血酸(维生素C)用于使铁还原为其还原形式(Fe(II))。

根据本发明，将根据本发明的本文定义的蛋白质用作羟化酶。所述意指在允许羟基化的条件下，蛋白质与待被羟基化的底物接触，并且发生羟基化。该蛋白质包含如本文所定义的SEQ ID NO:1或2的多肽或其变体。

将SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的多肽称为野生型，其显示脯氨酸羟化酶活性，并因此可将其用作羟化酶。

SEQ ID NO:1的多肽源自棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)(绛红小单胞菌(Micromonospora purpurea))，并且其具有下述氨基酸序列：

棘孢小单孢菌是革兰氏阳性、产芽孢、通常需氧的细菌菌株，其形成分支的菌丝体并以腐生形式存在于土壤和水中。该物种以产生烯二炔类抗生素卡利奇霉素(calicheamicins)而闻名。科学分类如下：

界：细菌

门：放线菌门(Actinobacteria)

目：放线菌目(Actinomycetales)

科：小单孢菌科(Micromonosporaceae)

属：小单孢菌属(Micromonospora)

种：棘孢菌(echinospora)

SEQ ID NO:2的多肽源自Kordia jejudonensis，并具有下述氨基酸序列：

Kordia jejudonensis是革兰氏染色阴性、需氧、不产芽孢、无鞭毛、非滑行和杆状的细菌菌株，是从韩国济州岛海水和淡水泉交汇带分离出来的(Park等人，2014，Int JSyst Evol Microbiol 64：657-662)。科学分类如下：

界：细菌

门：拟杆菌门(Bacteroidetes)

目：黄杆菌目(Flavobacteriales)

科：黄杆菌科(Flavobacteriaceae)

属：Kordia

种：jejundanensis

SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的多肽显示哌可酸羟化酶活性。所述意指这些多肽能够将哌可酸(PA)特别是L-哌可酸(L-PA)羟基化为羟基-哌可酸(HPA)，优选5-羟基-哌可酸(5-HPA)，如下述流程图1所示：

流程1：

根据本发明，所述蛋白质包含SEQ ID NO:1和/或2多肽(野生型)或其功能活性变体，其中所述功能活性变体的至少一个氨基酸不同于野生型，但具有哌可酸羟化酶活性，即其能够将哌可酸(PA)特别是L-哌可酸(L-PA)羟基化为羟基-哌可酸(HPA)，优选5-羟基-哌可酸(5-HPA)。由于其酶活性，也可将所述变体在本发明中用作羟化酶。根据本发明，具有哌可酸羟化酶活性的功能活性变体分别与SEQ ID NO:1和2的多肽具有至少75％和75％的序列同一性。

酶活性是酶的活性的一个量度。酶活性的SI单位是开特(1开特＝1mol s^-1)。一个更实用和常用的值是酶单位(U)＝1μmol min^-1。1U相当于16.67纳开特。将一个U定义为每分钟催化1微摩尔底物转化的酶的量。测量活性的条件通常是标准化的：通常取25℃或30℃的温度，以及产生最大底物转化率的pH值和底物浓度。酶的比活性是每毫克总蛋白中酶的活性(以μmol min^-1mg^-1表示)。其是在给定条件下、给定时间内，就每毫克总蛋白，酶形成的产物的量。比活性等于反应速率乘以反应体积除以总蛋白的质量。SI单位是开特kg^-1，但更实用的单位是μmol min^-1mg^-1。比活性是在特定(通常饱和)底物浓度下酶持续合成能力的一种量度，并且对于纯酶来说，比活性通常是恒定的。如果已知酶的分子量，则可根据比活性计算活性酶的周转数或μmol产物sec^-1μmol^-1。可将周转数视为每个酶分子每秒完成催化循环的次数。

所述活性可在酶分析中测定，该酶分析测量底物随时间的消耗量或产物随时间的产生。存在大量不同的测量底物和产物浓度的方法，并且许多酶可以用本领域技术人员已知的几种不同方法进行分析。在本发明中，将所关注的蛋白质在有利于羟化的条件(例如O₂、Fe²⁺、α-酮戊二酸和任选的抗坏血酸存在下)和时间下与PA，特别是L-PA一起孵育。将合适的条件和时间在实施例中给出。

包括羟化酶活性特别是哌可酸羟化酶活性的酶活性测定方法是本领域技术人员众所周知的。还在实施例中描述了示例性方法。

在本发明的优选实施方案中，SEQ ID NO:1的多肽的功能活性变体具有SEQ IDNO:1的多肽(即相应的野生型)的至少5％的哌可酸羟化酶活性，更优选至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，还更优选至少75％，甚至更优选至少80％，最优选至少90％的SEQ ID NO:1的多肽的哌可酸羟化酶活性。

在本发明的另一优选实施方案中，SEQ ID NO:2的多肽的功能活性变体具有SEQID NO:2的多肽(即相应的野生型)的至少5％的哌可酸羟化酶活性，更优选至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％，还更优选至少75％，甚至更优选至少80％，最优选至少90％的SEQ ID NO:2的多肽的哌可酸羟化酶活性。

此外，功能活性变体的特征在于：与SEQ ID NO:1和2的多肽分别具有至少75％和75％的确定的序列同一性。本文所用的术语“至少X％同一的”或“至少X％序列同一性”意指根据本发明变体的序列具有下述氨基酸序列，所述氨基酸序列特征在于：在100个氨基酸的延伸范围内，至少X个氨基酸残基与相应野生型序列即SEQ ID NO:1或2的序列相同。例如，可以将根据本发明的序列同一性通过序列比较形式的序列比对方法确定。序列比对方法在本领域是众所周知的，并包括多种程序和比对算法，例如Pearson和Lipman(1988)中描述的。并且，NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)可从多个来源包括国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和互联网上获得，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。相对于SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列，根据本发明的突变体的同一性百分比通常利用具有标准设置的NCBI Blast blastp来表征。或者，可以利用具有标准设置的软件GENEious来确定序列同一性。

根据本发明的变体可以包含一个或多个氨基酸缺失，特别是小的(例如至多10个氨基酸)N-和/或C-末端缺失；一个或多个添加，特别是小的(例如至多10个氨基酸)N-和/或C-末端添加；一个或多个替换，特别是一个或多个保守氨基酸替换或其组合。保守氨基酸替换指用具有相似侧链的不同残基替换残基，因此通常涉及用相同或相似定义的氨基酸类内的氨基酸替换多肽中的氨基酸。作为示例而非限制性的，具有脂肪族侧链的氨基酸可被另一种脂肪族氨基酸替代，例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有羟基侧链的氨基酸被另一种具有羟基侧链的氨基酸替代，例如丝氨酸和苏氨酸；具有芳香侧链的氨基酸被另一种具有芳香侧链的氨基酸替代，例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸；具有碱性侧链的氨基酸被另一种具有碱性侧链的氨基酸替代，例如赖氨酸和精氨酸；具有酸性侧链的氨基酸被另一种具有酸性侧链的氨基酸替代，例如天冬氨酸或谷氨酸；以及将疏水性或亲水性氨基酸分别用另一种疏水性或亲水性氨基酸替换。保守氨基酸替换的例子包括下文所列的那些：

在本发明的一实施方案中，根据本发明的变体可以包含至多50个、40个、30个、20个，尤其是10个添加、缺失和/或替换。

在一优选实施方案中，SEQ ID NO:1的多肽的功能活性变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少80％的序列同一性，优选与SEQ ID NO:1的多肽具有至少85％的序列同一性，更优选与SEQ ID NO:1的多肽具有至少90％的序列同一性，最优选与SEQ ID NO:1的多肽具有至少95％的序列同一性；或者其中SEQ ID NO:2的多肽的功能活性变体与SEQ ID NO:2的亲本多肽具有至少80％的序列同一性，优选与SEQ ID NO:2的多肽具有至少85％的序列同一性，更优选与SEQ ID NO:2的多肽具有至少90％的序列同一性，最优选与SEQ ID NO:2的多肽具有至少95％的序列同一性。可根据上文详述确定序列同一性。更优选地，SEQ ID NO:1的多肽的功能活性变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少96％的序列同一性，优选与SEQ ID NO:1的多肽具有至少97％的序列同一性，更优选与SEQ ID NO:1的多肽具有至少98％的序列同一性，最优选与SEQ ID NO:1的多肽具有至少99％的序列同一性；或者其中，SEQ ID NO:2的多肽的功能活性变体与SEQ ID NO:2的亲本多肽具有至少96％的序列同一性，优选与SEQID NO:2的多肽具有至少97％的序列同一性，更优选与SEQ ID NO:2的多肽具有至少98％的序列同一性，最优选与SEQ ID NO:2的多肽具有至少99％的序列同一性。

SEQ ID NO:1的多肽的功能活性变体优于SEQ ID NO:2的多肽的功能活性变体。

最优选地，该蛋白质包含SEQ ID NO:1或2的多肽或者由SEQ ID NO:1或2的多肽构成，甚至更优选地包含SEQ ID NO:1的多肽或者由SEQ ID NO:1的多肽构成。

可将含有SEQ ID NO:1或2的多肽或其功能活性变体的蛋白质用作羟化酶，即作为催化将羟基(-OH)引入化合物的酶。为此，将待被羟基化的化合物与蛋白质在有利于羟基化的条件(例如，O₂、Fe²⁺、α-酮戊二酸和任选的抗坏血酸存在下)和时间下一起孵育。待被羟基化的化合物优选是哌可酸(PA)特别是L-哌可酸(L-PA)，且产物是羟基-哌可酸(HPA)，尤其是5-羟基-哌可酸(5-HPA)，特别是顺-5-羟基-哌可酸(顺-5-HPA)，甚至更特别是(2S,5S)-顺-5-羟基-哌可酸((2S，5S)-顺-5-HPA)。

根据所述，用作羟化酶的蛋白质能将哌可酸(PA)特别是L-哌可酸(L-PA)羟基化为羟基-哌可酸(HPA)，特别是5-羟基-哌可酸(5-HPA)。在某些实施方案中，可能需要产生异构体或立体专一性产物。因此，用作羟化酶的蛋白质更特别能够将哌可酸(PA)羟基化为顺-5-羟基-哌可酸(顺-5-HPA)，甚至更特别是(2S,5S)-顺-5-羟基-哌可酸((2S,5S)-顺-5-HPA)。

在另一优选实施方案中，蛋白质特征如下：

i)对于5-HPA的区域选择性至少为90％，尤其是至少为95％，更优选至少为99％；

ii)对于顺-5-HPA的立体选择性至少为90％，尤其是至少为95％，更优选至少为99％；和/或

iii)转换率至少为60％，优选至少为70％，更优选至少为75％，最优选至少为95％。

如上所述，羟基化PA特别是L-PA可能是需要的，尤其是以获得具有特定专一性的产品。

在一实施方案中，旨在区域选择性地羟基化PA。具体地讲，产生5-HPA而不是例如3-羟基-哌可酸(3-HPA)或其混合物会是合乎需要的。因此，特征为5-HPA区域选择性至少90％，尤其是至少95％，更优选至少99％的蛋白质是优选的。

文中所用的术语“至少X％区域选择性”意指根据本发明生产的100个HPA分子中，至少X个分子为5-HPA。为了测定区域选择性的百分比，可以就羟基在碳环中的位置分析酶反应中产生的HPA分子，并且可以测定化合物的量，例如通过HPLC分析(参见实施例)。

在另一实施方案中，预期立体选择性地羟基化PA，特别是L-PA。特别是，产生顺式-5-HPA，而不是例如反式-5-HPA或其混合物会可能合乎需要的。因此，特征为对顺式-5-HPA的立体选择性为至少90％、尤其是至少95％、更优选至少99％的蛋白质是优选的。

文中所用的术语“至少X％立体选择性”意指根据本发明生产的100个5-HPA分子中，至少X个分子是顺式-5-HPA。为了测定立体选择性的百分比，可以就构型分析酶反应中产生的5-HPA分子，并且可以测定化合物的量，例如通过HPLC分析(例如根据实施例中详述的)。

还在另一实施实施中，可预期获得高产率的产物。具体地讲，产生大量5-HPA，尤其是顺式-5-HPA可能是合乎需要的。因此，特征为至少60％、优选至少70％、更优选至少75％、最优选至少95％的转化率的蛋白质是优选的。

文中所用的术语“至少X％的转化率”意指对于100个底物(例如PA)，根据本发明产生至少X个产物。为了测定转化率，可以测定酶反应的产物和/或底物的数量，例如通过HPLC分析(例如根据实施例中详述的)。通常，反应前的底物数量是已知的，并且可以与得到的产物数量进行比较。或者，可以测定反应后的底物数量，并通过从反应之前的底物数量中减去反应后的底物数量来计算产物数量。

另一方面，本发明涉及一种宿主，其包含蛋白质，该蛋白质含有：

a.如上文所定义的SEQ ID NO:1的多肽或编码该多肽的核酸，其中所述细胞不是棘孢小单孢菌细胞，特别不是小单孢菌属细胞，更特别不是小单孢菌科细胞，仍更特别不是Micromonosporales细胞，甚至更特别不是放线菌门细胞，尤其不是细菌细胞；或者

b.上文所定义的SEQ ID NO:2的多肽或编码所述多肽的核酸，其中所述细胞不是Kordia jejudonensis细胞，特别不是Kordia细胞，更特别不是黄杆菌科细胞，还更特别不是黄杆菌目细胞，甚至更特别不是拟杆菌门细胞，尤其不是细菌细胞；或者

c.蛋白质，其包含(i)上文所定义的多肽SEQ ID NO:1和至少一个其他氨基酸或(ii)上文所定义的多肽SEQ ID NO:1的功能活性变体或者编码该蛋白质的核酸，特别是其中所述细胞不是棘孢小单孢菌细胞，特别不是小单孢菌属细胞，更特别不是小单孢菌科细胞，仍更特别不是Micromonosporales细胞，甚至更特别不是放线菌门细胞，尤其不是细菌细胞；或

d.蛋白质，其包含(i)上文所定义的多肽SEQ ID NO:2和至少一个其他氨基酸或(ii)上文所定义的多肽SEQ ID NO:2的功能活性变体或者编码该蛋白质的核酸，特别是其中所述细胞不是Kordia jejudonensis细胞，特别不是Kordia细胞，更特别不是黄杆菌科细胞，还特别不是黄杆菌目细胞，甚至更特别不是拟杆菌门细胞，尤其不是细菌细胞。

宿主细胞是其中已引入外源分子(即非天然存在于该细胞中的分子)的细胞。在本发明中，所述分子可以是氨基酸或能够在细胞中表达以产生相应蛋白质的核酸。

如上文所述，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2序列的多肽分别来源于天然存在的有机体，特别是棘孢小单孢菌和Kordia jejudonensis。

一旦将SEQ ID NO:1序列的多肽或SEQ ID NO:2序列的多肽转移到除天然包含所关注多肽的细胞之外的细胞，即获得根据本发明的宿主细胞。

并且，只要蛋白质的至少一个氨基酸与SEQ ID NO:1序列的多肽和SEQ ID NO:2序列的多肽不同，就不再将其视为天然存在的蛋白质，并且可将其引入任何细胞中，以获得根据本发明的宿主细胞。与天然存在的SEQ ID NO:1和2的多肽的差异可通过添加至少一个氨基酸获得。替代地或另外地，它可以是上文所定义的多肽SEQ ID:1和2的变体。

宿主细胞可以另外包含或替代地包含编码本文所述多肽或蛋白质的核酸，可将其引入宿主细胞。

本发明的宿主细胞可以是除上述情况以外的任何一种适合于在重组DNA技术中应用的生物体，并且包括但不限于适合于表达一种或多种重组蛋白的各种细菌和酵母菌株。宿主细胞的实例包括例如各种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或大肠杆菌(E.coli)菌株。多种大肠杆菌细菌宿主细胞是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于BL21(DE3)、DH5-α、HB101、MV1190、JM109、JM101或XL-1蓝等菌株，其可从多个供应商处采购，包括例如New England Biolabs(MA，USA)、Stratagene(CA,USA)、Promega(WI,USA)或Qiagen(Hilden,Germany)。在实施例中还描述了特别合适的宿主细胞，即大肠杆菌BL21(DE3)细胞。可以用作宿主细胞的枯草芽孢杆菌菌株包括例如1012野生型：leuA8 metB5 trpC2hsdRM1和168Marburg:trpC2(Trp-)，例如可从MoBiTec(德国)购买它们。

将氨基酸或核酸序列引入宿主细胞的方法在本领域是众所周知的，并且包括下述技术例如转化特别是化学转化、转染、脂质体法、细胞转染剂(cytofectin)、粒子珠轰击、电穿孔、微量注射或病毒感染。宿主细胞可以是瞬时转染或稳定转化的细胞系。

在另一实施方案中，宿主细胞是真核细胞，特别是动物细胞(包括人类)、植物细胞或真菌细胞。所述宿主细胞的示例包括CHO细胞；HeLa细胞；肝细胞；CV-1细胞；P19细胞；NT2/D1细胞；小鼠L细胞；非洲绿猴肾细胞例如COS-7细胞或其他COS细胞；人类胚胎肾细胞，例如HEK 293；DG44细胞，ltk细胞，小鼠NIH 3T3细胞和酵母细胞。

在另一优选实施方案中，宿主细胞是原核细胞，其中根据本发明上文定义的蛋白质、多肽或核酸非天然存在。原核细胞可以是古生菌(Archaea)细胞或细菌细胞，特别是选自以下门的细胞：酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、产水菌门(Aquificae)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、衣原体门(Chlamydiae)、网团菌门(Dictyoglomi)、纤维杆菌门(Fibrobacteres)、梭杆菌门(Fusobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、Lentisphaerae、浮霉菌门(Planctomycetes)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)、软壁菌门(Tenericutes)(柔膜菌门(Mollicutes))和疣微菌门(Verrucomicrobia)。

另一方面，本发明涉及根据本发明上文所定义的蛋白质或宿主细胞在生产HPA、特别是5-HPA、更特别是顺-5-HPA、甚至更特别是(2S,5S)-顺-5-羟基哌可酸((2S,5S)-顺-5-HPA)中的用途。如上所述，本发明的蛋白质具有羟化酶活性，并且优选能够将PA特别是L-PA羟基化为HPA，特别是5-HPA，更特别是顺式-5-HPA，甚至更特别是(2S,5S)-顺式-5-HPA。因此，可将其用于所述目的。上文和下文技术术语的定义也适用于本发明的这方面。

另一方面，本发明涉及生产HPA的方法，该方法包含在氧存在下，用根据本发明上文所定义的蛋白质羟基化PA，特别是L-PA。在优选实施方案中，HPA是5-HPA，特别是顺式-5-HPA，甚至更特别是(2S,5S)-顺式-5-HPA。如上所述，本发明的蛋白质具有羟化酶活性，并且能够将PA特别是L-PA羟基化为HPA，特别是顺式-5-HPA，甚至更特别是(2S,5S)-顺式-5-HPA。上文和下文技术术语的定义也适用于本发明的这方面。

对于该方法，将PA特别是L-PA与具有羟化酶活性的蛋白质接触，并且根据文中定义的，在氧存在下，允许PA特别是L-PA羟基化为HPA的条件下。通常，羟化酶属于α-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族，它们利用分子氧进行羟基化。一个氧原子转移到PA以产生HPA，并且分子氧的另一个氧原子根据下述流程图转移到受体(共-底物)：

受体可以是通过本发明的蛋白质可向其转移氧的任何分子。合适的受体包括α-酮戊二酸、α-酮己二酸和其他α-酮二酸同系物；然而，α-酮戊二酸是优选的。

通常，所有试剂都存在于溶液中，并且处于允许反应的条件下，所述意指适当的反应条件，例如温度、压力、pH、各组分的浓度、存在共因子等。将适当的条件在实施例中示例说明。

通常，实验将在环境温度或其他合适的温度(例如15℃～40℃；例如15℃、25℃或37℃)下进行，尽管它可以在例如5℃～40℃的温度范围内进行。发现15℃的温度会产生高的转化，这是令人惊讶的，因为酶反应通常在较高的温度例如30℃～37℃下进行。因此，10℃～30℃的温度是优选的。

接触/温孵时间可以从大约5分钟至许多小时，优选从大约15h～200h，例如50h～100h。然而，温孵时间将取决于实验方式、溶液体积、底物和催化剂的浓度、待羟基化的PA的量等。

可将所述蛋白质作为溶液、冻干物使用，可将其固定或作为完整细胞催化剂使用(参见实施例)。在优选实施方案中，蛋白质可在上文定义的宿主细胞中产生。在本发明的方法中，还可将其包含于细胞中(参见实施例)或者已将其从中分离出来。

优选地，羟基化在氧受体/共底物特别是α-酮戊二酸存在下并且Fe²⁺存在下发生。可使用本领域已知的气体供应装置提供氧气。氧气可以以气体的形式供应，例如空气或人工气体如carbogen(二氧化碳和氧气的混合物)。可将气体引入含有所有其他反应成分的溶液或悬浮液中。Fe²⁺通常作为可溶性无毒盐提供，其适当实例在本领域是已知的，其中包括硫酸铁(II)铵(莫尔(Mohr)盐)。

在优选实施方案中，羟基化在pH 4.5～8的水性环境中，5℃～30℃温度下和/或在50～500mM的α-酮戊二酸浓度与25mM～200mM浓度的PA特别是L-PA发生。通气速率可以是50mL/min到至多250mL/min。

在本发明的一实施方案中，生产HPA的方法包括分离HPA，特别是顺式-5-HPA或甚至更特别是(2S,5S)-顺式-5-HPA。HPA，特别是顺式-5-HPA或甚至更特别是(2S,5S)-顺式-5-HPA可通过本领域已知的任何方法分离，所述方法包括色谱法，例如离子交换色谱法。

另一方面，在本发明上下文中，本发明涉及生产上文定义的蛋白质的方法，在本发明上下文中，该方法包含在宿主细胞中表达编码该蛋白质的核酸，特别是在上文定义的宿主细胞中。

核酸在原核或真核宿主细胞中的表达为用于市售和研究用途的蛋白质的大量生产提供了手段。可将编码根据本发明的蛋白质的核酸引入合适的宿主细胞中，以通过重组方式产生各种蛋白质。所述方法可以包括将各自的核酸克隆到合适的质粒载体中。将质粒载体广泛应用于基因克隆，并且可以很容易地将其导入即转化到已被暂时可渗透DNA的细胞中。可将包含核酸的宿主细胞在适当的培养基中培养，并可从培养的细胞或培养基中获得根据本发明的蛋白质。可将根据本发明的蛋白质以常规方式回收和任选地纯化，所述常规方式包括沉淀、离心、色谱法、亲和力结合(使用例如标签)等方法。核酸的表达可以在宿主细胞中诱导(例如使用诱导启动子)或构成。

在一相关方面，本发明提供生产在本发明的上下文中上文定义的蛋白质的方法，所述方法包含：

a)将包含编码在本发明的上下文中上文定义的蛋白质的核酸的载体引入宿主细胞中，特别是在本发明的上下文中上文定义的宿主细胞中，

b)在允许在本发明的上下文中上文定义的蛋白质表达的条件下生长宿主细胞，

c)任选地自宿主细胞分离蛋白质。

作为第一步，将包含所关注核酸的载体引入宿主细胞中。本领域技术人员能够为外源核酸的表达选择合适的载体-宿主组合。在手边有许多用于异源蛋白质高水平生产的分子工具和策略，例如大量目录的表达质粒，大量的工程菌株和许多培养策略。为了表达所需的氨基酸序列(例如通过将包含编码蛋白质的核酸的载体引入)至宿主细胞，除了根据本发明的核酸序列之外，该载体还可以包含用于控制表达的其他序列(例如启动子序列、终止子序列和增强子序列)和用于选择微生物、昆虫细胞、动物培养细胞等的基因标记(例如氨苄西林、新霉素或卡那霉素抗性基因)。此外，载体可包含重复形式(例如串联)的根据本发明的核酸序列。可根据遗传工程领域中常用的操作和方式构建该载体。

作为第二步，宿主细胞在允许本发明上下文中上文定义的蛋白质表达的条件下生长。根据本发明的宿主细胞的培养是本领域技术人员已知的常规操作。这些宿主细胞可以由任何一种合适的细胞，优选细菌细胞例如大肠杆菌特别是大肠杆菌BL21(DE3)，可将其在培养基中培养。

作为任选的第三步，可以从宿主细胞中分离蛋白质。蛋白质在各自宿主细胞中表达后，可以收获细胞并用作制备含有关注蛋白质的细胞提取物的原料。通过细胞裂解得到含有关注蛋白质的细胞提取物。通过化学、生物、酶和/或机械细胞裂解制备细胞提取物的方法是本领域技术人员熟知的，包括但不限于例如低渗盐处理、均化或超声。此后，可根据本发明的前面方面的详述，分离蛋白质。

另一方面，本发明涉及含有下述成分或由下述成分构成的蛋白质：

-多肽SEQ ID NO:1和至少一个其他氨基酸，尤其在C和/或N末端；

-多肽SEQ ID NO:2和至少一个其他氨基酸，尤其在C和/或N末端；

-SEQ ID NO:1的多肽的功能活性变体，该变体的至少一个氨基酸残基与SEQ IDNO:1的多肽不同，但与SEQ ID NO:1的多肽具有至少75％的序列同一性，并且其具有哌可酸羟化酶活性；或

-SEQ ID NO:2的多肽的功能活性变体，该变体的至少一个氨基酸残基与SEQ IDNO:2的多肽不同，但与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％的序列同一性，并且其具有哌可酸羟化酶活性，

特别是，其中所述蛋白质进一步在本发明的特定和优选实施方案的内容中如上文定义所表征。在优选实施方案中，SEQ ID NO:1的多肽的功能活性变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少80％的序列同一性，优选与SEQ ID NO:1的多肽具有至少85％的序列同一性，更优选与SEQ ID NO:1的多肽具有至少90％的序列同一性，最优选与SEQ ID NO:1的多肽具有至少95％的序列同一性；或者其中SEQ ID NO:2的多肽的功能活性变体与SEQ ID NO:2的亲本多肽具有至少80％的序列同一性，优选与SEQ ID NO:2的多肽具有至少85％的序列同一性，更优选与SEQ ID NO:2的多肽具有至少90％的序列同一性，最优选与SEQ ID NO:2的多肽具有至少95％的序列同一性。可根据上文所详述测定序列同一性。更优选地，SEQ ID NO:1的多肽的功能活性变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少96％的序列同一性，优选与SEQ IDNO:1的多肽具有至少97％的序列同一性，更优选与SEQ ID NO:1的多肽具有至少98％的序列同一性，最优选与SEQ ID NO:1的多肽具有至少99％的序列同一性；或者其中SEQ ID NO:2的多肽的功能活性变体与SEQ ID NO:2的亲本多肽具有至少96％的序列同一性，优选与SEQ ID NO:2的多肽具有至少97％的序列同一性，更优选与SEQ ID NO:2的多肽具有至少98％的序列同一性，最优选与SEQ ID NO:2的多肽具有至少99％的序列同一性。

如本领域众所周知的，酶可以在不显著损害其酶活性的情况下发生突变。特别是小的添加、缺失或替换，尤其是保守替换，通常对酶的活性是不重要的。所述特别适用于C和/或N末端突变或者催化和结合位点之外的突变。因此，这些蛋白质是本发明的主题。上述和下文技术术语的定义也适用于本发明的这一方面。

另一方面，本发明涉及编码本发明前面方面定义的蛋白质的核酸。

文中所用的术语“核酸”广泛涉及编码本发明的前面方面定义的蛋白质的任何核苷酸分子，并且其长度可以是可变的。本发明的核酸的实例包括但不限于质粒、载体或任何类型的DNA和/或RNA片段，其可通过标准分子生物学方法(包括例如离子交换色谱)分离。可将本发明的核酸用于特定细胞或生物体(例如本发明的宿主细胞)的转染或转导。

本发明的核酸分子可以是RNA形式，例如mRNA、cRNA或LNA(锁核酸)，或者是包括例如cDNA和基因组DNA的DNA形式，例如通过克隆获得或者通过化学合成技术或其组合产生的。DNA可能是三链、双链或单链的。单链DNA可以是编码链，也称为有义链，或者其可以是非编码链，也称为反义链。文中所用的核酸分子尤其还指单链和双链DNA、为单链和双链RNA混合物的DNA、单链和双链区域混合物的RNA、包含可以是单链或更典型的双链或三链的DNA和RNA的杂交分子，或者单链区和双链区的混合物。此外，文中所用的核酸分子指包含RNA或DNA或者RNA和DNA两者的三链区域。

此外，所述核酸可包含一个或多个修饰碱基。该核酸还可以含有修饰(例如在核糖磷酸骨架中)，以增加该分子在生理环境中的稳定性和半衰期。因此，具有由于稳定性或其他原因而修饰的骨架的DNAs或RNAs是“核酸分子”，因为所述特征预期在本文中。并且，包含稀有碱基例如肌苷或修饰碱基例如三苯甲基化碱基(仅举两个例子)的DNAs或RNAs是本发明范围内的核酸分子。应该理解：已经对DNA和RNA进行了各种修改，所述修改用于本领域技术人员已知的许多有用的目的。本文中所使用的术语核酸分子包含所述经化学、酶或代谢修饰形式的核酸分子，以及具有病毒和细胞尤其包括简单和复合细胞特征的DNA和RNA的化学形式。

此外，可利用标准技术(例如标准克隆技术)，将本发明前面方面中如上定义的编码蛋白质的核酸分子功能性地连接至任何所需序列例如调节序列、先导序列、异源标记序列或异源编码序列，以产生融合蛋白。

本发明的核酸可最初体外形成或细胞中培养形成，一般来讲，通过内切酶和/或外切酶和/或聚合酶和/或连接酶和/或重组酶或本领域技术人员已知的生产核酸的其他方法来处理核酸。

可将本发明的核酸包含于载体例如表达载体中，其中可将所述核酸有效连接到能够促进所述核酸在宿主细胞中表达的启动子序列。

因此，另一方面，本发明涉及包含本发明前面方面中如上定义的核酸或编码本发明上下文中如上定义的蛋白质的核酸的载体。

如文中所用，术语“表达载体”或“载体”通常指可用于在细胞中表达关注蛋白质的任何种类的核酸分子(也参见上文关于本发明核酸的详述)。特别是，本发明载体可以是本领域技术人员已知的任何质粒或载体，其适合于在特定宿主细胞中表达蛋白质，所述细胞包括但不限于哺乳动物细胞、细菌细胞和酵母细胞。本发明的表达构建体也可以是编码本发明蛋白质的核酸，并将其用于随后克隆至各自载体，以确保表达。用于蛋白质表达的质粒和载体在本领域是众所周知的，并且可以从多个供应商处购买，包括例如Promega(Madison，WI，USA)、Qiagen(Hilden，德国)、Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)或MoBiTec(德国)。蛋白质表达的方法是本领域技术人员所熟知的，并且例如在Sambrook等人，2000(Molecular Cloning:A laboratory manual，第三版)中描述。

载体可另外包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点、一个或多个治疗基因和/或可选择的标记基因，以及本领域已知的其他遗传元件，例如指导编码蛋白质转录、翻译和/或分泌的调节元件。可将载体用于转导、转化或感染细胞，从而使细胞表达除细胞固有的核酸和/或蛋白质以外的核酸和/或蛋白质。所述载体任选地包含有助于实现核酸进入细胞的物质，例如病毒粒子、脂质体、蛋白质涂层等。在本领域中，已知多种类型的适当表达载体用于经标准分子生物学技术的蛋白质表达。所述载体选自传统载体类型，包括昆虫，例如杆状病毒表达，或酵母、真菌、细菌或病毒表达系统。可将其他适当的表达载体用于此目的，其中许多类型是本领域已知的。获取所述表达载体的方法是众所周知的(参见例如Sambrook等人，上文)。

如上所述，可将编码本发明蛋白质的核酸有效连接至适于驱动宿主细胞中蛋白质表达的序列，以确保蛋白质的表达。然而，本发明中包含的是所要求保护的表达构建物可以表示中间产物，随后将该中间产物克隆到适当的表达载体中，以确保蛋白质的表达。本发明的表达载体还可包含各种核酸序列，包括但不限于聚腺苷酸化信号、剪接供体和剪接受体信号、间插序列、转录增强子序列、翻译增强子序列、耐药基因等。任选地，可将该耐药基因有效连接至内部核糖体进入位点(IRES)，其可以是细胞周期特异性的或细胞周期无关的。

文中所用的术语“有效(operably)连接”通常指将基因元件进行排列，使其为预期目的共同起作用，例如转录由启动子启动并通过编码本发明蛋白质的DNA序列继续。也就是说，RNA聚合酶将编码融合蛋白的序列转录成mRNA，然后将其剪接并翻译成蛋白质。

本发明的上下文中所用的术语“启动子序列”通常指有效连接到下游编码序列的任何一种调节DNA序列，其中所述启动子能够结合RNA聚合酶并在细胞中启动编码的开放阅读框的转录，从而驱动所述下游编码序列的表达。本发明的启动子序列可以是本领域技术人员已知的任何一种启动子序列，包括但不限于组成性启动子、诱导性启动子、细胞周期特异性启动子和细胞类型特异性启动子。

除非另外定义，否则文中使用的所有技术和科学术语以及任何首字母缩写具有与本发明领域中普通技术人员通常理解的相同含义。分子生物学常用术语的定义可见Benjamin Lewin，Genes V，牛津大学出版社出版，1994年(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(编)，《分子生物学百科全书》(The Encyclopedia of Molecular Biology)，布莱克威尔科学有限公司出版，1994年(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(编)，《分子生物学和生物技术：综合案头参考》(Molecular Biology and Biotechnology:aComprehensive Desk Reference)，VCH出版社出版，1995年(ISBN 1-56081-569-8)。

本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以变化。尽管在本发明的实践中可以使用与文中所述类似或同等的任何方法和材料，但是将优选方法和材料在文中进行描述。此外，文中所用的术语仅用于描述特定实施方案，并不预期限制本发明的范围。

根据本文和所附权利要求书中所用的，单数形式“a/an”和“该(the)”包括复数形式，除非上下文另外明确规定。类似地，应将词语“包含”、“含有”和“包括”理解为包含而不是排他性的。同样，词语“或”预期包括“和”，除非上下文另外明确说明。术语“多个”指两个或更多个。

下文的图和实施例旨在解释说明本发明的各种实施方案。因此，不应将所讨论的具体修饰理解为对本发明范围的限制。对于本领域技术人员显而易见的是：在不背离本发明范围的条件下，可以进行各种等价替换、改变和修改，因此，应当理解：所述等价实施方案应包括于本文中。

附图

图1：顺式-5-HPA和相应的非对映体反式-5-HPA的参考标准品的参考色谱图。

图2：利用具有过度表达的脯氨酸羟化酶PH05的大肠杆菌BL21(DE3)全细胞进行制备规模的示范性生物转化。图2A显示不同反应时间后PA 1向5-HPA 2的转化。68.5h后，93％的PA 1(3mmol)转化为5-HPA 2。再将1.5mmol PA 1(0.5倍初始量)和3mmolαKG添加到反应混合物中。89h的总反应时间之后，检测到>98％的PA 1转化为5-HPA 2。经HPLC-分析测定转化率。图2B显示89h后反应混合物的色谱图，利用丹磺酰氯衍生化测定L-PA 1向HPA 2的转化。在89小时样品的色谱图中，仅留下微量的底物PA 1。图2C显示89小时后反应混合物的色谱图，利用Fmoc衍生化测定产物2的非对映体过量。

图3-5：在各种条件下利用脯氨酸羟化酶PH05进行制备规模的生物转化。图3、4和5分别显示了实施例3、4和5的结果。在各图中，A部分显示了不同反应时间后PA 1向5-HPA 2的转化，B部分显示利用丹磺酰氯衍生化，L-PA 1向HPA 2转化的测定，并且C部分显示利用Fmoc衍生化的产物2非对映体过量的测定(参见图2)。

图6和7：在不同条件下利用脯氨酸羟化酶PH12的制备规模的生物转化。图6和图7分别显示实施例6和7的结果。在各图中，A部分显示不同反应时间后PA 1向5-HPA 2的转化，B部分显示利用丹磺酰氯衍生化测定L-PA 1向HPA 2的转化，C部分显示利用Fmoc衍生化测定产物2的非对映体过量(参见图2)。

实施例

方法

反应设置：

用具有过表达的不同脯氨酸羟化酶(PHs)的大肠杆菌BL21(DE3)全细胞作为生物催化剂，在30毫升的总体积中完成制备规模的生物转化。除非另外说明，利用PHs的反应在15℃下(使用低温恒温器)于装配机械搅拌器的100毫升烧瓶中进行，该烧瓶包括pH-和温度传感器。反应在pH 7.0下进行，将其用1-2M HCl溶液和Metrohm滴定系统(Titrando 902，触控)保持恒定。下文的反应描述中列出的浓度与起始体积(30mL)相关。

将L-哌可酸(PA)(1)(25mM–150mM)溶解于含有表达PH的大肠杆菌BL21(DE3)全细胞(83g/L湿细胞质量)的缓冲液中。将α-酮戊二酸二钠盐(αKG)(2eq.)、抗坏血酸钠(0.03eq.)、莫尔盐(0.01eq.)和消泡剂Y-30(2％v/v)从制备的储备溶液加入缓冲液中。搅拌反应并施加恒流的水饱和空气(250mL/min)。

通过加入1-2M HCl，保持pH恒定。

不同的反应时间之后，取样，并在丹磺酰氯衍生化之后，经HPLC进行分析。芴甲氧羰酰氯(FMOC)衍生化后，经HPLC分析非对映体过量。下文描述衍生化和HPLC法。

丹磺酰氯衍生化

从反应中取出100μL反应混合物，并在14,100×g离心10min。将20μL(5mM终浓度，258μg，2μmol)上清液转移至新的微反应管中，并加入220μL(22μmol)的1M NaHCO₃溶液。然后，加入160μL 6g/L丹磺酰氯乙腈溶液，并将反应溶液在Eppendorf ThermoMixer中于55℃和850rpm下振摇15分钟。将反应溶液在14100×g离心5分钟。利用HPLC，将50μL上清液用于转化测定。

丹磺酰氯衍生化后利用HPLC-分析的转化测定：

方法：

Fmoc衍生化后通过HPLC-分析非对映体过量：

方法：

衍生化：

对于样品的衍生化，如本领域技术人员所知，建立了在线衍生化程序。将下述试剂用于衍生化操作：1)0.4M硼酸缓冲液(pH 10.2；购自Agilent；Art.No.5061-3339)，2)乙腈，3)FMOC氯化物溶液(50mg/mL的乙腈溶液)。将2体积的试剂1)与0.25体积的样品混合，并加入0.5体积的3)。将形成的衍生化混合物混合，并在进样前反应0.1min。进样后，用10μL乙腈清洗进样针。

实施例1：比较新鉴定的不同脯氨酸羟化酶

为了鉴定新的脯氨酸羟化酶，选择46种基因。选择相应的蛋白质用于进一步分析，并检测其羟化酶活性。对于L-PA，18种蛋白质未显示羟化酶活性，并且其中3种确实显示主要形成5-HPA区域异构体。

三种剩余的酶均显示羟化酶活性和良好的区域选择性。在下述条件(0.5ml)下，就立体选择性对其筛选，已提前确定该条件适用于相应的酶：

-源自棘孢小单孢菌的PH(简称PH05)：10mM PA，20mMαKG，1.5mM抗坏血酸(钠盐)，0.5mM莫尔(Mohr’s)盐，25％(v/v)裂解液，PH 5.5，5℃

-源自Micromonospora chokoriensis的PH(简称PH11)：10mM PA，20mMαKG，1.5mM抗坏血酸(钠盐)，0.5mM莫尔盐，90％(v/v)裂解液，PH 6.0，25℃

-源自Kordia jejudonensis的PH(简称PH12)：10mM PA，20mMαKG，1.5mM抗坏血酸(钠盐)，0.5mM莫尔盐，25％(v/v)裂解液，PH 6.0，25℃

将1g湿细胞糊状物重新悬浮于2mL磷酸钾缓冲液(50mM，pH 7)中，制备细胞裂解物。如本领域技术人员所知，将细胞通过超声裂解。反应之前，通过离心法除去细胞碎片。在详细表征之前，测定酶的反应条件(结果未显示)。

可将筛选结果总结如下：

表1：脯氨酸羟化酶筛选结果

PH	区域选择性	立体选择性	转化％
				5	5-HPA	>99％de	82％
11	5-HPA	>85.5％de	95％
				12	5-HPA(1％3-HPA)	>99％de	79％

发现两种脯氨酸羟化酶(PH05和PH 12)应特别关注，因为其特征为足够的哌可酸羟化酶活性和对于5-HPA的区域选择性，以及对于(S,S)-顺式-5-HPA(顺式-5-HPA)2的立体选择性。

脯氨酸羟化酶PH 05与SEQ ID NO:1相关，并且脯氨酸羟化酶PH 12与SEQ ID NO:2相关。

实施例2：利用脯氨酸羟化酶PH05的制备规模生物转化的详细描述鉴于脯氨酸羟化酶PH05和PH12的特征为哌可酸羟化酶活性和预期的区域选择性，因此其进一步特征在于：

利用源自棘孢小单孢菌(PH05)的过表达脯氨酸羟化酶(PH)的大肠杆菌(E.coli)全细胞作为生物催化剂，完成PA-1向顺式-5-HPA 2的制备规模的生物转化。该反应在15℃下和30mL体积中的83.3g/L全细胞，以4.5mmol PA(1)规模(580.5mg，～19g/L)完成，利用底物进料方法和Metrohm pH Stat。

将L-哌可酸(PA)(1)(0.387g，3mmol，100mM)溶解于30mL磷酸钾缓冲液(100mM，pH7)中，该缓冲液含有表达PH05的大肠杆菌BL21(DE3)全细胞(83g/L湿细胞质量)、α-酮戊二酸二钠盐(αKG)(1.356g，6mmol，200mM，2eq.)、抗坏血酸钠(0.018g，0.09mmol，3mM，0.03eq.)和莫尔盐(0.012g，0.03mmol，1mM，0.01eq.)。加入600μL(2％v/v)消泡剂Y-30。在15℃下搅拌反应，并施加恒流的水饱和空气(250mL/min)。

将PA 1(195mg，1.5mmol，50mM)和αKG加入反应中(如图1A所示，PA在68.5h，并且αKG在下列时间点后：50h(340mg，1.5mmol，50mM)、68.5h(677mg，3mmol，100mM)、75h(170mg，0.75mmol，25mM)。

通过加入1M HCl溶液来保持pH恒定，在89小时内消耗30毫升(设定为极限值)(30mmol)。

先前在小规模(～6.5mg/mL)完成的反应参数测定已表明：对于在15℃下利用进气口完成的反应，用全细胞可获得PH05催化反应的高转化。还发现：为了实现高转化，αKG的再投料是必需的。为了监测在不同时间点的反应进展，在不同时间点(1h、3h、18h、21h、…、89h)采集样品(图2A)。用HPLC监测PA 1向5-HPA 2的转化(参见图2B)。

68.5h后，93％的PA 1(3mmol)转化为顺式-5-HPA 2。再将1.5mmol PA 1(初始量的0.5倍)和3mmolαKG(2eq.)加入反应混合物中。在总反应时间89h后，检测到>98％的L-PA 1转化为(S,S)-顺式-5-HPA 2。在图2B中，显示89h反应时间后，反应混合物的HPLC-图谱。预先进行丹磺酰氯衍生化。在89h样品的色谱图中，只留下底物PA 1的微量信号(t_r～2.55min)。t_r～1.45min的信号与期望产物5-HPA 2有关。

利用HPLC，以及在线芴基甲氧羰酰氯(Fmoc)衍生化法，测定产物的非对映体过量。在图1C中，显示去除细胞和在线-Fmoc衍生化后89小时样品的HPLC-图谱。未检测到反式-5-HPA 3。反式-5-HPA 3非对映体的信号预期在保留时间t_r～1.7min，但只有t_r～1.8min的5-顺式-HPA 2的信号是可见的。利用HPLC-方法检测～1％的残留PA 1。如图2C所示，利用在线-Fmoc衍生化在HPLC色谱图中有许多背景信号，它们与Fmoc衍生化有关。

为推定本实验，采用包括PH05的83.33g/L(OD₆₀₀～50)全细胞催化剂，将30mL反应体积中的4.5mmol(580.5mg)PA 1(～19g/L)转化为5-顺式-HPA 2(>98％)，未检测到副产物。

实施例3：PA 1浓度～19g/L且加入50mM和200mM的αKG，利用PH05的制备规模生物转化

将L-哌可酸(PA)(1)(0.387g，3mmol，100mM)加到30mL磷酸钾缓冲液(100mM，pH 7)中，该缓冲液含有表达PH05的大肠杆菌BL21(DE3)全细胞(83g/L湿细胞质量)、α-酮戊二酸二钠盐(αKG)(1.356g，6mmol，200mM，2eq.)、抗坏血酸钠(0.018g，3mM，0.03eq.)和莫尔盐(0.012g，0.03mmol，1mM，0.01eq.)。加入600μL(2％v/v)消泡剂Y-30，并在15℃下搅拌反应，同时施加恒流的水饱和空气(250mL/min)。

向反应中加入另外量的PA 1和αKG(如图3A所示)。在78h时加入PA 1(195mg，1.5mmol，50mM)和αKG(1.356g，6mmol，200mM)，并在下述时间点后加入αKG(各340mg，～1.5mmol，～50mM)：23h和94.5h。随时间推移加入2M HCl溶液(10mL，26mmol)，保持pH恒定。

117h后，已检测到约99％的PA 1转化为5-顺式-HPA 2。结果如图3所示。

实施例4:PA 1浓度～19g/L且加入25mM和100mM的αKG，利用PH05的制备规模生物转化

将L-哌可酸(PA)(1)(0.387g，3mmol，100mM)溶解到30mL磷酸钾缓冲液(100mM，pH7)中，该缓冲液含有表达PH05的大肠杆菌BL21(DE3)全细胞(83g/L湿细胞质量)、α-酮戊二酸二钠盐(αKG)(1.356g，6mmol，200mM，2eq.)、抗坏血酸钠(0.018g，0.09mmol，3mM，0.03eq.)和莫尔盐(0.012g，0.03mmol，1mM，0.01eq.)。加入600μL(2％v/v)消泡剂Y-30，并在15℃下搅拌反应，同时施加恒流的水饱和空气(250mL/min)。

向反应中加入另外量的PA 1和αKG(如图4A所示)。在48h时加入PA 1(195mg，1.5mmol，50mM)和αKG(0.678g，3mmol，2eq.，100mM)，并在下述时间点后加入αKG(各170mg，0.75mmol，25mM)：12、22、37、43、68、83h。在反应时间内加入2M HCl溶液(13mL，26mmol)，保持pH恒定。

92h后，检测到约91％的PA 1转化为顺式-5-HPA 2。结果如图4所示。

实施例5：PA 1浓度～3.2g/L时利用PH05的制备规模生物转化将L-哌可酸(PA)(1)(～0.1g，0.75mmol，25mM)溶解于30mL磷酸钾缓冲液(100mM，pH 7)中，该缓冲液含有表达PH05的大肠杆菌BL21(DE3)全细胞(83g/L湿细胞质量)、α-酮戊二酸二钠盐(αKG)(0.338g，1.5mmol，50mM，2eq.)、抗坏血酸钠(1.5mM)和莫尔盐(0.5mM)。加入600μL(2％v/v)消泡剂Y-30，并在15℃下搅拌反应，同时施加恒流的水饱和空气(250mL/min)。在反应时间内加入1MHCl溶液(6mL，6mmol)，保持pH恒定。

41h后，检测到约53％的PA 1转化为顺式-5-HPA 2，并且反应不再有进展。结果如图5所示。

实施例6：PA 1浓度19g/L时利用PH12的制备规模生物转化

将L-哌可酸(PA)(1)(0.194g，1.5mmol，50mM)溶解于30mL磷酸钾缓冲液(100mM，pH7)中，该缓冲液含有表达PH12的大肠杆菌BL21(DE3)全细胞(83g/L湿细胞质量)、α-酮戊二酸二钠盐(αKG)(0.678g，3mmol，2eq.，100mM)、抗坏血酸钠(0.009g，0.045mmol，1.5mM，0.03eq.)、莫尔盐(0.006g，0.015mmol，0.5mM，0.01eq.)，并加入600μL(2％v/v)消泡剂Y-30。将反应物在25℃下搅拌，并施加恒流的水饱和空气(250mL/min)。

6h后，加入另外量的αKG(340mg，～1.5mmol，～50mM)，并在44小时后，加入L-哌可酸(PA)(1)(387mg，3mmol，100mM)和α-酮戊二酸二钠盐(αKG)(1.356g，6mmol，2eq，200mM)。在图6A所示的不同时间点后取样。在反应时间内加入1M HCl溶液(30mL，30mmol)，保持pH恒定。

68h后，利用150mM的总底物浓度，检测到93％的PA 1转化。与先前用PH05的实验相比，检测到少量(<1％)的3-HPA 4和2.6％(2S,5R)-反式-5-HPA 3(见图6)。

实施例7：PA 1浓度3.2g/L时利用PH12的制备规模生物转化将L-哌可酸(PA)(1)(～0.1g，0.75mmol，25mM)溶解于30mL磷酸钾缓冲液(100mM，pH 7)中，该缓冲液含有表达PH12的大肠杆菌BL21(DE3)全细胞(83g/L湿细胞质量)、α-酮戊二酸二钠盐(αKG)(0.339g，1.5mmol，2eq.，50mM)、抗坏血酸钠(1.5mM)、莫尔盐(0.5mM)。加入600μL(2％v/v)消泡剂Y-30。将反应物在25℃下搅拌，并施加恒流的水饱和空气(250mL/min)。在反应时间内通过加入1M HCl溶液(5mL，5mmol)，保持pH恒定。

21h和26h之后，向反应物中加入另外量的α-酮戊二酸二钠盐(αKG)(～0.085g，0.375mmol，0.5eq.，12.5mM)。在图7A所示的不同时间点后取样。

41h后，利用25mM PA 1的总底物浓度，检测到>99％的PA 1转化。与在更高浓度下用PH12的实验相比，未检测到3-HPA 4和(2S,5R)-反式-5-HPA 3形成(见图7)。

Claims

1.蛋白质作为羟化酶的用途，其中所述蛋白质包含：

2.权利要求1所述的用途，其中SEQ ID NO:1的多肽的功能活性变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少80％的序列同一性，优选与SEQ ID NO:1的多肽具有至少85％的序列同一性，更优选与SEQ ID NO:1的多肽具有至少90％的序列同一性，最优选与SEQ ID NO:1的多肽具有至少95％的序列同一性；或者其中SEQ ID NO:2的多肽的功能活性变体与SEQ ID NO:2的亲本多肽具有至少80％的序列同一性，优选与SEQ ID NO:2的多肽具有至少85％的序列同一性，更优选与SEQ ID NO:2的多肽具有至少90％的序列同一性，最优选与SEQ ID NO:2的多肽具有至少95％的序列同一性。

3.权利要求1或2中任何一项所述的用途，其中所述蛋白质包含SEQ ID NO:1或2多肽或者由SEQ ID NO:1或2多肽构成。

4.权利要求1-3中任何一项所述的用途，其中蛋白质包含SEQ ID NO:1多肽或者由SEQID NO:1多肽构成。

5.权利要求1-4中任何一项所述的用途，其中所述蛋白质能够将哌可酸(PA)特别是L-哌可酸(L-PA)羟基化为羟基-哌可酸(HPA)，特别是5-羟基-哌可酸(5-HPA)，更特别是顺式-5-羟基哌可酸(顺式-5-HPA)，甚至更特别是(2S,5S)-顺式-5-羟基-哌可酸((2S,5S)-顺式-5-HPA)。

6.权利要求5所述的用途，其中所述蛋白质的特征为：

ii)对于顺式-5-HPA的立体选择性至少为90％，尤其是至少为95％，更优选至少为99％；和/或

7.宿主细胞，其包含：

a.权利要求1和3-6中任何一项定义的SEQ ID NO:1的多肽或编码该多肽的核酸，其中所述细胞不是棘孢小单孢菌细胞，特别不是小单孢菌属细胞，更特别不是小单孢菌科细胞，仍更特别不是Micromonosporales细胞，甚至更特别不是放线菌门细胞，尤其不是细菌细胞；或者

b.权利要求1和3-6中任何一项定义的SEQ ID NO:2的多肽或编码所述多肽的核酸，其中所述细胞不是Kordia jejudonensis细胞，特别不是Kordia细胞，更特别不是黄杆菌科细胞，还更特别不是黄杆菌目细胞，甚至更特别不是拟杆菌门细胞，尤其不是细菌细胞；或者

c.蛋白质，其包含(i)权利要求1和3-6中任何一项定义的SEQ ID NO:1多肽和至少一个其他氨基酸或(ii)权利要求1-6中任何一项定义的SEQ ID NO:1多肽的功能活性变体，或者编码该蛋白质的核酸，特别是其中所述细胞不是棘孢小单孢菌细胞，特别不是小单孢菌属细胞，更特别不是小单孢菌科细胞，仍更特别不是Micromonosporales细胞，甚至更特别不是放线菌门细胞，尤其不是细菌细胞；或

d.蛋白质，其包含(i)权利要求1和3-6中任何一项定义的SEQ ID NO:2多肽和至少一个其他氨基酸或(ii)权利要求1-6中任何一项定义的SEQ ID NO:2多肽的功能活性变体，或者编码该蛋白质的核酸，特别是其中所述细胞不是Kordia jejudonensis细胞，特别不是Kordia细胞，更特别不是黄杆菌科细胞，还更特别不是黄杆菌目细胞，甚至更特别不是拟杆菌门细胞，尤其不是细菌细胞。

8.权利要求7所述的宿主细胞，其中宿主细胞是真核细胞，特别是动物细胞、植物细胞或真菌细胞或者其中所述宿主细胞，或者其中宿主细胞是原核细胞，其中根据权利要求7定义的蛋白质、多肽或核酸非天然存在。

9.权利要求1-6中任何一项定义的蛋白质或者权利要求7或8的宿主细胞用于生产HPA、特别是5-HPA、更特别是顺式-5-HPA、甚至更特别是(2S,5S)-顺式-5-羟基-哌可酸((2S,5S)-顺式-5-HPA)的用途。

10.生产HPA所述的方法，该方法包含在氧气存在下，用根据权利要求1-6中任何一项所定义的蛋白质羟基化PA，特别是L-PA。

11.权利要求10所述的方法，其中HPA是5-HPA，特别是顺式-5-HPA，甚至更特别是(2S,5S)-顺式-5-HPA。

12.权利要求10或11所述的方法，其中在权利要求7或8的宿主细胞中生产蛋白质。

13.权利要求10-12中任何一项所述的方法，其中羟基化在氧受体/共底物特别是α-酮戊二酸存在下以及Fe²⁺存在下发生。

14.权利要求10-13中任何一项所述的方法，其中羟基化在pH 4.5～8的水性环境中，5℃～30℃温度下和/或在50～500mM的α-酮戊二酸浓度和25mM～200mM的PA特别是L-PA浓度下发生。

15.权利要求10-14中任何一项所述的方法，其中该方法任选地包含分离HPA，特别是顺式-5-HPA或甚至更特别是(2S,5S)-顺式-5-HPA。

16.生产权利要求1-6中任何一项定义的蛋白质的方法，该方法包括在宿主细胞特别是权利要求7或8的宿主细胞中表达编码所述蛋白质的核酸。

17.生产权利要求1-6中任何一项定义的蛋白质的方法，该方法包括：

a)将含有编码权利要求1-6中任何一项定义的蛋白质的核酸的载体引入宿主细胞中，特别是权利要求7或8的宿主细胞中，

b)在允许权利要求1-6中任何一项定义的蛋白表达的条件下生长宿主细胞，

c)任选地自宿主细胞分离蛋白质。

18.蛋白质包含下述或由下述构成：

-多肽SEQ ID NO:1和至少一个其他氨基酸，尤其在C和/或N末端；

-多肽SEQ ID NO:2和至少一个其他氨基酸，尤其在C和/或N末端；

-SEQ ID NO:1的多肽的功能活性变体，该变体的至少一个氨基酸残基与SEQ ID NO:1的多肽不同，但与SEQ ID NO:1的多肽具有至少75％的序列同一性，并且其具有哌可酸羟化酶活性；或

-SEQ ID NO:2的多肽的功能活性变体，该变体的至少一个氨基酸残基与SEQ ID NO:2的多肽不同，但与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％的序列同一性，并且其具有哌可酸羟化酶活性，

特别是，其中所述蛋白质进一步特征在于权利要求2-6中的任何一项。

19.编码权利要求18的蛋白质的核酸。

20.载体，其含有权利要求19的核酸或者编码权利要求1-6中任何一项定义的蛋白质的核酸。