CN111372581A - 表没食子儿茶素没食子酸酯溶液 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及表没食子儿茶素没食子酸酯的稳定的药物水溶液或皮肤化妆品水溶液。所述溶液具有改善的EGCG溶解度、稳定性和生物利用度。

Description

表没食子儿茶素没食子酸酯溶液
本发明涉及包含表没食子儿茶素没食子酸酯的稳定的药物水溶液或皮肤化妆品水溶液。
绿茶(野茶树(Camellia sinensis))在中国和其他亚洲国家已广泛使用了几千年。它被认为是预防和/或治疗多种疾病的最有希望的营养素之一(Cabrera,Artacho等人,Journal of the American College of Nutrition,第25卷，第2期，第79-99页(2006))。绿茶含有大量的多酚。多酚儿茶素以其强大的抗氧化性质而闻名，这使其成为开发涵盖多个治疗领域的药物的候选物。绿茶中存在的大多数多酚是黄烷醇，通常称为儿茶素(Afzal,Safer等人,Inflammopharmacology.2015年8月；23(4):151-61)。
在许多体外和体内模型中检查了绿茶儿茶素的抗氧化性质。实验结果和临床研究为茶提取物和茶多酚的有益作用提供了令人信服的数据(Yang,Wang等人,Nat RevCancer.2009年6月；9(6):429–439)。儿茶素被特别描述为具有抗癌作用和对神经退行性疾病如帕金森氏病和阿尔茨海默氏病的防护性质。
表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是迄今为止最丰富的绿茶儿茶素多酚，其被公认在预防或延缓如癌症、糖尿病和组织变性的衰老相关疾病方面具有巨大潜力(Krupkova等人,Journal of Nutritional Biochemistry 37(2016)1-12)。
事实证明，EGCG可在体外和体内预防由于暴露于太阳紫外线辐射引起的氧化损伤和抗氧化酶的消耗(Vayalil等人,Carcinogenesis 24(2003)927-936)。已经发现，通过抑制炎性白细胞浸润和前列腺素代谢物的产生，用EGCG进行局部处理可减少由于日晒引起的皮肤炎症反应(Nichols et Katiyar,Dermatol Arc.Res.302(2010)71-83)。此外，据报道，EGCG可通过减少由太阳紫外线辐射触发的基质金属蛋白酶的表达来防止阳光诱导的皮肤免疫系统抑制，并防止皮肤的光老化(Shin等人,Tropical Journal of PharmaceuticalResearch(2014)13(7):1079-1084)。
EGCG是天然来源的，其包含在绿茶提取物中。其含量随季节、叶片类型和所用植物的部分而变化。绿茶的干提取物含有约35％的多酚，其中30％属于儿茶素，而儿茶素本身含有55％至80％的EGCG。
EGCG目前可作为草药或绿茶提取物获得(现行欧洲药典，专题1433；2017年6月欧洲药典，专题2668)，无论是否分离。茶酿造品以及与维生素共同配制的胶囊或片剂是EGCG摄入的主要途径。
尽管EGCG具有出色的抗氧化性质，但在动物和人类流行病学研究中仅观察到有限的作用。经口施用(PO)后，发现EGCG在人体内的生物利用度很低，导致血浆浓度比在体外系统中发挥生物活性的浓度低5倍至50倍(Chow等人,Clin Cancer Res 11(2005)4627-4633)。
像其他儿茶素一样，EGCG的溶解性差且皮肤渗透性低。
EGCG的生物制药性能差主要是由于其在水中相对较低的溶解度、较低的化学稳定性、较低的渗透性和较短的血浆半衰期。
实际上，在正常条件下，EGCG仅以4.6g/L(10mM)的比率溶解。可溶性EGCG的量远远不足以开发药品，而药品需要小体积、高浓度的活性成分。
EGCG可以通过自氧化而迅速反应，因此显示出非常低的化学稳定性。EGCG的自氧化产生能够诱导EGCG聚合和分解的活性氧。所得的醌类衍生物、二聚体或低聚物具有低得多的肠吸收率。
通常，其所处的直接环境，例如水的存在、pH、温度、氧含量、抗氧化剂含量和金属离子，甚至微量物质(铁、锌、铜、铝)都会直接影响其稳定性(Krupkova等人,Journal ofNutritional Biochemistry 37(2016)1-12)。
顺便说一下，生物利用度低也部分由于其与存在的营养素(包括共配制的赋形剂)之间的相互作用。事实上，研究表明，胶囊中通常难溶的成分和明胶壳本身的成分在崩解后可以与EGCG结合，形成甚至难溶复合物，从而阻碍吸收。
上述缺点也阻止了EGCG被用于皮肤护理产品中。除了其化学不稳定性、差的皮肤渗透性、在水中的低溶解度以外，EGCG对紫外线辐射非常敏感。在紫外线照射1小时后，发现EGCG分解了70％。因为EGCG是保护皮肤免受太阳辐射伤害的非常有用的成分，所以其在紫外线照射下的稳定性对于制备含有EGCG的有效皮肤病学产品至关重要。
为了在局部施用的情况下提高EGCG的溶解度和稳定性，过去已经提出了几种技术。然而，迄今为止描述的EGCG制剂仍不能完全满足EGCG临床开发的要求。
US20140088030描述了一种通过将蔗糖和来自明串珠菌(Leuconostoc)的葡聚糖蔗糖酶与酚类化合物一起孵育来制备酚类化合物的O-α-葡糖苷衍生物(例如EGCG)的方法。然而，该方法涉及EGCG的结构变化。这些变化可能会损害EGCG的其他性质。
还开发了包裹EGCG的纳米颗粒，以促进绿茶多酚浓缩物在胃肠道中的持续释放(Krupkova等人,Journal of Nutritional Biochemistry 37(2016)1-12)。然而，释放速率和动力学的变化可能使EGCG生物制药阶段变得更加复杂且难以预测。顺便说一下，对于相等剂量的施用，使用逐渐释放形式的EGCG(其因此以较小的剂量存在于胃肠道中)比使用立即释放形式更容易使其暴露于酶促降解和细菌代谢。
Krupkova等人(Journal of Nutritional Biochemistry 37(2016)1–12)描述了一种绿茶儿茶素(GTC)的溶液制剂，其包含1.09mM的GTC混合物、0.15g/mL的蔗糖和2mg/mL的柠檬酸。然而，一项为期6个月的评估表明，添加蔗糖对GTC的稳定性影响很小，而添加柠檬酸会使GTC不稳定。
迫切需要开发具有改善的溶解度和稳定性、易于配制并且不含能够与EGCG形成不溶性复合物的赋形剂或成分的含EGCG的药物产品或皮肤化妆品。
本发明的目的是开发表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的新型天然药物制剂，其中ECGC具有更好的水溶性和稳定性。
本发明的第一方面涉及表没食子儿茶素没食子酸酯的稳定的药物水溶液或皮肤化妆品水溶液，所述溶液包含：
-13mg/ml至107mg/ml的表没食子儿茶素没食子酸酯，
-至少一种二糖，
-0.1mmol/l至1.0mmol/l的至少一种螯合剂，
-药学上可接受或皮肤化妆品上可接受的pH调节剂，
其中所述溶液的pH为3.0至4.0，表没食子儿茶素没食子酸酯/二糖的摩尔比为0.1至0.8，特别是0.25。
在一个实施方案中，本发明涉及表没食子儿茶素没食子酸酯的稳定的药物水溶液，所述溶液包含：
-13mg/ml至107mg/ml的表没食子儿茶素没食子酸酯，
-至少一种二糖，
-0.1mmol/l至1.0mmol/l的至少一种螯合剂，
-药学上可接受的pH调节剂，
其中所述溶液的pH为3.0至4.0，表没食子儿茶素没食子酸酯/二糖的摩尔比为0.1至0.8，特别是0.25。
在一个特定实施方案中，所述稳定的溶液用于其在制备皮肤药物产品中的用途。
本发明的另一个实施方案涉及表没食子儿茶素没食子酸酯的皮肤化妆品水溶液，所述溶液包含：
-13mg/ml至107mg/ml的表没食子儿茶素没食子酸酯，
-至少一种二糖，
-0.1mmol/l至1.0mmol/l的至少一种螯合剂，
-化妆品上可接受的pH调节剂，
其中所述溶液的pH为3.0至4.0，表没食子儿茶素没食子酸酯/二糖的摩尔比为0.1至0.8，特别是0.25。
克服了重重困难，在不依靠温度和例如DMSO的有机溶剂的情况下，本发明的发明人在二糖存在下成功地将水溶液中的EGCG浓度提高了近20倍。
此外，已观察到该水溶液在2℃至8℃和环境温度下分别在18个月至24个月和9个月至12个月期间可以保持稳定。
发明人首次观察到，当EGCG和二糖以一定摩尔比存在于水溶液中时，可以形成复合物，其中EGCG的羟基与作为受体的二糖的羟基之间形成氢键。
不受任何理论的束缚，认为EGCG/二糖复合物和氢键的形成可能大幅提高EGCG在水溶液中的溶解度，进而通过以下方面提高溶液的稳定性：
-降低溶解的氧含量，
-增加底物/试剂的比例，使反应定量降低，
-通过单线态氧的自淬灭和淬灭来更好地自保护EGCG。
顺便说一下，EGCG和二糖之间形成的氢键会阻止酯官能团暴露于水解试剂中。
由于高浓度的可溶性EGCG和高稳定性，与迄今已知的EGCG制剂相比，所述药物溶液可以显示出改善的EGCG生物利用度，因为高浓度的EGCG可以避免与低底物/试剂比有关的EGCG逐渐溶解，有利于通过肠屏障并限制EGCG的肝清除，这是重要的。
在本文中，术语“表没食子儿茶素没食子酸酯的稳定的药物水溶液或皮肤化妆品水溶液”是指在室温20℃至25℃下储存至少9个月或2℃至8℃下储存至少18个月后，与所述溶液中的初始EGCG量相比，保留至少95重量％的EGCG及其反式差向异构体没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)的药物溶液或皮肤化妆品溶液。
本发明的药物溶液是药学上可接受的，即当施用于患者时不会产生不利的、过敏的或其他不良反应。
如本文所用，本发明中的术语“表没食子儿茶素没食子酸酯”是指从任何季节采摘的野茶树的叶的任何部分中纯化的天然EGCG。
优选地，EGCG的含量为至少90重量％，特别是至少95重量％，更特别是至少97重量％的任何EGCG提取物都适合于制备本发明的溶液。
优选地，用于制备本发明溶液的EGCG提取物满足有关欧洲现行药典(现行欧洲药典，专题1433和2668)中规定的要求。
术语“二糖”是指由通过糖苷键连接的两个单糖缩合形成的糖。
在一个优选的实施方案中，所述二糖是易溶于水的二糖，其在25℃下的溶解度高于100mg/ml。
在一个更优选的实施方案中，所述二糖是蔗糖或海藻糖。
如本文所用，术语“螯合剂”是指与金属离子反应形成稳定的水溶性金属络合物的化合物。在本发明的药物溶液中，螯合剂的存在旨在捕获溶液中可能存在的任何痕量金属离子，并防止EGCG去质子化，即使在痕量浓度的金属离子存在下，也可以催化EGCG去质子化。
适用于本发明溶液的螯合剂的实例是柠檬酸、依地酸二钠钙、依地酸二钠、富马酸、苹果酸、麦芽酚和喷替酸。
将本发明溶液的pH保持在pH 3.0至4.0，以避免在较高pH(>5.0)下与质子损失有关的EGCG降解的风险。
在本发明的一个优选的实施方案中，本发明的药物溶液或皮肤化妆品溶液的pH为3.0至3.5。
溶液的pH可以通过掺入合适的药学上可接受的或皮肤化妆品上可接受的pH调节剂来调节。
术语“药学上可接受的pH调节剂”是指在合理的医学判断范围内适合用于与人的组织接触而没有过度的毒性、刺激、变态反应等的任何化学试剂。
术语“皮肤化妆品上可接受的pH调节剂”是指用于皮肤化妆品中的无毒的任何化学试剂。
术语“皮肤化妆品”是指要与人体的不同浅表部分尤其是表皮、毛发、指甲、嘴唇等接触的产品，该产品结合了美容作用和皮肤病学作用。
通常，pH调节剂可以是酸化剂，尤其是酸。任何合适的药学上可接受的酸均可用于本发明的药物溶液中。任何合适的皮肤化妆品上可接受的酸均可用于本发明的皮肤化妆品溶液中。
有时，可能有必要掺入缓冲剂以增加溶液的pH以达到所需的pH范围。任何合适的药学上可接受的或皮肤化妆品上可接受的缓冲剂可以分别用于本发明的药物溶液或皮肤化妆品溶液中。
在本发明的一个实施方案中，pH调节剂选自乙酸、己二酸、碳酸铵、氢氧化铵、磷酸铵、柠檬酸、二乙醇胺、富马酸、盐酸、苹果酸、硝酸、丙酸、乙酸钾、碳酸氢钾、氯化钾、柠檬酸钾、偏磷酸钾、磷酸钾、乙酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠、柠檬酸钠、乙醇酸钠、氢氧化钠、乳酸钠、磷酸钠、丙酸钠、琥珀酸、硫酸、酒石酸、三乙醇胺或其混合物。
所需pH调节剂的量应能使溶液达到所需的pH。
根据本发明的一个实施方案，螯合剂和pH调节剂可以是相同的化合物。例如，柠檬酸同时是螯合剂和pH调节剂。
根据本发明的一个实施方案，本发明的药物溶液或皮肤化妆品溶液还包含至少一种适用于水性体系并与酸性pH相容的抗氧化剂。
合适的抗氧化剂的实例是抗坏血酸、异抗坏血酸、单硫代甘油、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠或还原糖。
本文将术语“还原糖”定义为包括包含醛官能团或在碱性溶液中可异构化以形成醛官能团的任何糖，例如葡萄糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、乳糖和戊糖例如木糖。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的药物溶液或皮肤化妆品溶液中的抗氧化剂是葡萄糖或果糖。
在一个优选的实施方案中，当本发明的药物溶液或皮肤化妆品溶液包含选自抗坏血酸、异抗坏血酸、单硫代甘油、焦亚硫酸钠或亚硫酸氢钠的抗氧化剂时，所述抗氧化剂的浓度为0.01mg/ml至0.5mg/ml。
在另一个优选的实施方案中，当本发明的药物溶液或皮肤化妆品溶液包含还原糖时，所述还原糖的浓度为至少10mg/ml，优选不超过500mg/ml，更优选为100mg/ml。
在本发明的药物溶液中，不需要有机溶剂的存在。
在本发明的一个特定实施方案中，所述药物溶液不含有机溶剂。
有机溶剂的实例是丙酮、乙腈、氯仿、二甲基亚砜、乙醇、丙烯、乙二醇、甘油、PEG400。
在本发明的另一个特定实施方案中，所述药物溶液包含选自乙醇、丙二醇、甘油、PEG 400的有机溶剂。
在一个特定实施方案中，本发明提供了一种药物水溶液，其包含或组成为：
-13mg/ml至107mg/ml，特别是27mg/ml至67mg/ml，更特别是27mg/ml至53mg/ml的表没食子儿茶素没食子酸酯，
-0.05mg/ml至3.0mg/ml，特别是0.08mg/ml至0.25mg/ml，更特别是0.10mg/ml至0.20mg/ml的柠檬酸，
-25mg/ml至140mg/ml，特别是50mg/ml至125mg/ml，更特别是100mg/ml至125mg/ml的蔗糖，
-任选地，25mg/ml至250mg/ml，特别是100mg/ml的葡萄糖和/或果糖。
在另一个特定实施方案中，本发明提供了一种药物水溶液，其包含或组成为：
-27mg/ml表没食子儿茶素没食子酸酯，
-0.1mg/ml柠檬酸，
-100mg/ml蔗糖，
-100mg/ml葡萄糖。
在本发明的一个实施方案中，药物溶液配制成口服药物组合物，尤其是饮用药物组合物。
所述溶液可包含一种或多于一种药学上可接受的甜味剂和/或芳香剂。当所述药物溶液不含葡萄糖或果糖作为抗氧化剂时，甜味剂或芳香剂是特别有用的。
甜味剂可包括但不限于阿斯巴甜、乙酰磺胺酸钾、甘露醇、山梨糖醇、乳糖醇、木糖醇、赤藓糖醇或其混合物。芳香剂可以是任何水果芳香剂，或其他芳香剂例如可乐芳香剂，或其混合物。
所述甜味剂或芳香剂的量可以根据药物制剂领域中的常识来确定。
在另一个实施方案中，本发明的药物溶液是可注射制剂，其可以通过肠胃外途径例如静脉内或皮下施用或通过局部途径施用。
可以根据溶液制备的任何常规方法来制备本发明的药物溶液。应当每种先前添加的成分完全溶解后，依次添加成分。成分的溶解可以在室温下搅拌实现。
在所有成分完全溶解后，可以对溶液进行一次或多于一次无菌过滤，然后以合适的体积装入药物容器例如多剂量药瓶中。
在另一个特定实施方案中，本发明提供了一种皮肤化妆品水溶液，其包含或组成为：
-13mg/ml至107mg/ml，特别是27mg/ml至67mg/ml，更特别是27mg/ml至53mg/ml表没食子儿茶素没食子酸酯，
-0.05mg/ml至3.0mg/ml，特别是0.08mg/ml至0.25mg/ml，更特别是0.10mg/ml至0.20mg/ml柠檬酸，
-25mg/ml至140mg/ml，特别是50mg/ml至125mg/ml，更特别是100mg/ml至125mg/ml蔗糖，
-任选地，25mg/ml至250mg/ml，特别是100mg/ml葡萄糖和/或果糖。
在另一个特定实施方案中，本发明提供了一种皮肤化妆品水溶液，其包含或组成为：
-27mg/ml表没食子儿茶素没食子酸酯，
-0.1mg/ml柠檬酸，
-100mg/ml蔗糖，
-100mg/ml葡萄糖。
本发明的另一方面提供了单位剂量的表没食子儿茶素没食子酸酯，其包含前述的药物水溶液或皮肤化妆品水溶液。
与调整为较大剂量例如在多剂量小瓶的本发明的溶液相比，单位剂量的药物溶液或皮肤化妆品溶液为患者提供了更多的优势，特别是在维持溶液的化学稳定性方面。
所述本发明的单位剂量的体积为5ml至30ml，特别是10ml至15ml，更特别是15ml。
根据本发明，单位剂量的溶液包含重量为200mg至1600mg，特别是400mg至1200mg，更特别是400mg的表没食子儿茶素没食子酸酯。
在一个优选的实施方案中，本发明的单位剂量为5ml至30ml，特别是10ml至15ml，更特别是15ml，其包含重量为200mg至1600mg，特别是400mg至1200mg，更特别是400mg的EGCG。
在一个更优选的实施方案中，本发明的单位剂量为15ml，含有400mg EGCG和1.5g蔗糖。
本发明的另一方面涉及由前述药物水溶液或前述单位剂量的任何脱水过程，特别是冻干或喷雾干燥得到的固体组合物。
所述固体组合物可以是晶体、水合物或无水多晶型物形式。
可以通过添加适当体积的水，复溶所述固体组合物来获得之前描述的药物溶液。
本发明提供了一种药物组合物，其包含药物水溶液、单位剂量的药物水溶液或由所述药物溶液或所述单位剂量的任何脱水过程得到的固体组合物。
在一个特定实施方案中，本发明的药物组合物被配制为用作皮肤药物产品。
所述产品可以是通过将所述皮肤化妆品溶液与不同的糊状或半固体基质混合而得到的半固体或糊状局部用组合物。
本发明提供药物水溶液、单位剂量的药物水溶液或由所述药物溶液或所述单位剂量的任何脱水过程得到的固体组合物，其用作治疗癌症、心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病如帕金森氏病和阿尔茨海默氏病或皮肤病的药物。
本发明还提供了一种皮肤化妆品，其包含皮肤化妆品水溶液、单位剂量的皮肤化妆品水溶液或由所述皮肤化妆品溶液或所述单位剂量的任何脱水过程得到的固体组合物。
所述皮肤化妆品可以是通过将所述皮肤化妆品溶液或所述固体组合物与不同的糊状或半固体基质混合而得到的半固体或糊状局部用组合物。
所述皮肤化妆品可以是护肤产品，例如防晒霜、日霜、晚霜、晒后产品、粉底、口红、眼部化妆品、洗发水、沐浴露。
本发明还提供了由表没食子儿茶素没食子酸酯和二糖，特别是蔗糖形成的混合物，其中表没食子儿茶素没食子酸酯/二糖的摩尔比为0.1至0.8，特别是0.25。
所述混合物确保在20℃至25℃的环境温度下最佳的EGCG水溶解率。
本发明还涉及由EGCG和二糖形成的低共熔复合物，其中EGCG和二糖的摩尔比为0.7至0.85。
术语“低共熔复合物”是指在特定温度下在特定摩尔比范围内两种或多于两种组分熔融后获得的复合物。在低共熔复合物中，各组分在相同的温度下熔融和凝固，该温度低于各组分的熔融温度。
在所述复合物中，EGCG和二糖通过氢键结合。
根据本发明的一个特定实施方案，低共熔复合物是由EGCG和蔗糖形成的复合物，其中EGCG和蔗糖的摩尔比为0.7至0.85。
在一个优选的实施方案中，本发明的低共熔复合物EGCG/蔗糖的低共熔温度为80℃至90℃。
在另一方面，本发明涉及用于改善EGCG水溶性的方法。
所述方法包括以下步骤：
(i)制备包含以下组分的溶液：
-至少一种二糖，特别是蔗糖和海藻糖，其中表没食子儿茶素没食子酸酯/二糖的摩尔比为0.1至0.8，特别是0.25，
-0.1mmol/l至1.0mmol/l的至少一种螯合剂，
-药学上可接受的pH调节剂，以将溶液的pH调节至3.0至4.0，
-任选地，至少一种适用于水性体系并与酸性pH相容的抗氧化剂，
(ii)将13mg/ml至107mg/ml，特别是27mg/ml至67mg/ml，更特别是27mg/ml至53mg/ml的EGCG溶解于上一步制备的溶液中。
本发明还涉及用于改善EGCG生物利用度的方法。
所述方法包括以下步骤：
(i)将13mg/ml至107mg/ml，特别是27mg/ml至67mg/ml，更特别是27mg/ml至53mg/ml的EGCG溶解于含有以下物质的溶液中：
-至少一种二糖，特别是蔗糖和海藻糖，其中表没食子儿茶素没食子酸酯/二糖的摩尔比为0.1至0.8，特别是0.25，
-0.1mmol/l至1.0mmol/l的至少一种螯合剂，
-药学上可接受的pH调节剂，以将溶液的pH调节至3.0至4.0，
-任选地，至少一种适用于水性体系并与酸性pH相容的抗氧化剂，
(ii)将所述溶液施用至需要EGCG治疗的患者。
在一个优选的实施方案中，当抗氧化剂选自抗坏血酸、异抗坏血酸、单硫代甘油、焦亚硫酸钠或亚硫酸氢钠时，所述抗氧化剂在上述溶液中的浓度为0.01mg/ml至0.5mg/ml。
在另一个优选的实施方案中，当本发明的药物溶液包含还原糖时，所述还原糖的浓度为至少10mg/ml，优选不超过500mg/ml，更优选为100mg/ml。
施用可以通过经口施用或通过肠胃外途径进行。
通过以下附图和实施例更详细地说明本发明。
附图
图1显示了与单独的EGCG在水中的溶解度(由方形符号表示)相比，EGCG在根据本发明的含有100mg/mL的蔗糖的溶液中的溶解度(由菱形符号表示)。X轴表示溶解时间(小时)。Y轴表示溶液中的EGCG含量(g/L)。
图2A、图2B和图2C显示了下表1中给出的EGCG制剂的稳定性(图2A)与仅基于EGCG的溶液的稳定性(图2B)。两种溶液都以每分钟5℃的速率经受从25℃至135℃的渐进式加热。加热结束时，每种溶液形成的残留物如图2A所示，并通过高效液相色谱进行分析。图2B是表1中给出的EGCG制剂的色谱图。图2C是不含其他赋形剂的基于EGCG的水性悬浮液的色谱图。
图3显示了由EGCG和蔗糖形成的复合物的ATR-IR光谱。
图4比较了本发明溶液(要求保护的制剂)和对照制剂(胶囊)在模拟的上肠培养基中在长达6小时的时间内通过合成透析膜的累积EGCG渗透百分率(CEP％)随时间的变化。
图5显示了在经口施用对照制剂(胶囊剂量27mg/kg)和本发明的溶液(制剂27mg/kg)后，大鼠血浆EGCG浓度随时间的变化。
实施例
实施例1
1.材料和方法
1.1制剂
根据下表1中给出的配方制备EGCG口服溶液。
表1：示例性EGCG的400mg/15mL溶液制剂
Figure BDA0002504058800000131
用于制备所述溶液的EGCG是分离的EGCG提取物(>97重量％的干提取物)。在使用之前，已对活性物质进行严格控制，以确保其质量符合专题2668(2017年6月，欧洲药典)的要求。
用于应力稳定性测试的EGCG的参考标准悬浮液是仅含有浓度为26.6mg/mL的EGCG的水悬浮液。通过将适量的分离的EGCG提取物(>97重量％的干提取物)分散在蒸馏水中临时制备标准悬浮液，以得到所述浓度。
用于长期稳定性和加速稳定性研究的EGCG参考标准溶液是仅含有浓度为0.26mg/mL的EGCG的水溶液。通过将适量的分离的EGCG提取物(>97重量％的干提取物)溶解在蒸馏水中临时制备标准溶液，以得到所述浓度。
1.2制备过程
下面给出制备过程的一个实施例。
阶段1：溶液制备
步骤1：用注射用水将20升派热克斯玻璃容器填充到溶液最终体积的1/3。
步骤2：将根据表1的适量EGCG、柠檬酸、葡萄糖、蔗糖、可乐芳香剂添加到水中，通过混合使其完全溶解。
步骤3：加入注射用水以达到最终体积。
阶段2：过滤
通过1μ
Figure BDA0002504058800000141
滤筒进行过滤。过滤后的溶液存放在带有氮气入口的20升不锈钢罐中，以使溶液和容器的顶部空间惰化。
阶段3：装入多剂量瓶
将溶液装入250mL多剂量琥珀色玻璃瓶中。填充的瓶子用带有聚乙烯密封圈的盖封闭。
1.3应力稳定性测试：
使1mL的参考标准悬浮液和之前在表1中公开的本发明的制剂以5℃/min的速率经受25℃至135℃的热梯度程序。在该暴露结束时，将形成的每种残留物的一部分放置在载玻片上，其余部分通过高效液相色谱法进行分析。结果如图2所示。
1.4长期稳定性和加速稳定性测试
储存条件和采样方案
根据表1中提到的250ml单位剂量的配方制备测试批次。
EGCG的参考标准溶液是仅含有浓度为0.26mg/mL的EGCG的水溶液。
测试的批次已按照ICH准则Q1A进行了存储。表2列出了每种条件下采样时间点的详细信息。在进行HPLC分析之前，将其在蒸馏水中按1/100稀释。
表2-用于主要批次研究的采样和储存方案
Figure BDA0002504058800000151
包装：250mL多剂量琥珀色玻璃瓶(III型)，具有带聚乙烯密封圈的聚乙烯盖。
稳定性测试和容许极限
在稳定性研究过程中以及在每个时间点监视适当的化学、物理和微生物特性，可以评估EGCG口服溶液的稳定性。
EGCG的化学稳定性通过HPLC来评估，HPLC是经验证的稳定性指示的测定方法。所述程序适用于使用外标的EGCG研究产品测定。EGCG的测定是通过将样品溶液的响应与以相似标称浓度制备并以相同方式分析的EGCG参考标准溶液的响应进行比较来实现的。使用合适的色谱柱和色谱条件，通过梯度反相HPLC和UV检测分析样品和参考标准溶液。
HPLC测定使用的液相色谱仪装有UV检测器(可变波长或二极管阵列检测器)，并配有
Figure BDA0002504058800000161
VKR5C18色谱柱(250×4.6.0mm，粒径为5μm)或等效色谱柱。
乙腈、乙酸和纯水用于制备流动相A(5/95/0.07体积/体积/体积，乙腈/水/乙酸)和流动相B(50/50/0.05体积/体积/体积，乙腈/水/乙酸)。
色谱程序
使用合适的色谱条件进行分析，例如使用表3中给出的条件。
表3-EGCG测定的色谱条件
Figure BDA0002504058800000162
体系适用性标准
所有体系适用性标准均根据欧洲药典“第2.2.46章”进行计算。如果需要，可以在药典和验证的范围内修改程序的特定参数，以实现体系适用性。
表4显示了应满足的体系适用性标准。
表4-体系适用性标准
Figure BDA0002504058800000171
计算
根据以下公式计算稀释后的样品溶液中EGCG的残留量与该样品中原始量的百分比。
Figure BDA0002504058800000172
其中：
Astd＝参考标准溶液中EGCG的峰面积
Asam＝稀释样品溶液中EGCG的峰面积
D＝稀释系数
Wstd＝参考标准溶液的EGCG重量(mg)
Pstd＝参考标准溶液的纯度(重量％)
Vstd＝参考标准溶液的体积(mL)
1.5 ATR-IR光谱图像
通过FTIR光谱获得复合蔗糖/EGCG的ATR-IR光谱图像。实验是在Perkin-ElmerSpectrum BX FT-IR系统上进行的，该系统基于具有FT-IR Spectrum v2.00软件的漫反射采样附件。使用ATR池在室温下在400cm-1至4000cm-1的波数范围内记录应力样品的光谱。
2.结果
2.1根据本发明的EGCG溶液的溶解度
将EGCG在包含10重量％蔗糖的溶液中的溶解度与单独的EGCG在水中的溶解度进行比较。溶解仅1小时后，测试溶液中EGCG的浓度就达到近80g/L，而对照溶液中EGCG的溶解度在溶解4小时后不超过5g/L(图1)。
2.2根据本发明的EGCG溶液的稳定性
针对具有表1中所列配方的EGCG溶液和仅基于EGCG的溶液进行1.3节中所述的稳定性测试。最初，这两种溶液是清晰透明的。在加热结束时，仅基于EGCG的溶液的残留物为黑色，而观察到本文要求保护的EGCG制剂为透明玻璃样膜(图2A)。当通过色谱法进行分析时，黑色残留物几乎不包含EGCG，而由测试制剂的热处理产生的产物的色谱图与起始溶液的色谱图相同，也就是说，它具有与EGCG和最初存在的另一种多酚绿茶的峰相同的峰(图2B和图2C)。
长期稳定性测试的结果在下表5中给出。
表5：长期稳定性测试
Figure BDA0002504058800000181
NA：不适用
观察到的在25℃/60％RH下相对于2℃至8℃下的储存损失主要是由于EGCG的差向异构化，出现了没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)，而25℃/60％RH和40℃/75％RH之间的差异主要是由于酯官能团的水解导致出现表儿茶素和没食子酸。
长期稳定性测试表明，在2℃至8℃下，400mg/15mL溶液中存在的EGCG水平保持不变，在25℃下储存仅记录到5％的损失。顺便说一下，已经表明这种损失主要归因于EGCG的差向异构化。儿茶素差向异构化是可逆的。顺便说一句，儿茶素反式差向异构体不具有毒性作用，而是与其顺式对应物具有相似的生物学活性。
这些结果表明，开发的制剂能够保护EGCG免于自氧化和水解。
2.3低共熔复合物的结构
ATR-IR光谱图显示OH拉伸IR区域中存在宽吸收，并且不存在OH自由拉伸峰(图3)，这表明在蔗糖的OH官能团作为受体的情况下，EGCG将通过强氢键OH-O与蔗糖形成复合物。
H键可能导致以比以前更低的频率和/或相对强烈的振动模式振动，只要参与振动模式的原子活跃地参与H键。
实施例2：体外渗透性研究
在这项研究中，使用人工再生的纤维素膜作为Caco-2细胞的屏障替代物，以比较来自对照制剂和本发明溶液的EGCG的膜通透性。这种人造膜的优点是无需进行培养、洗涤或预培养步骤即可进行比较研究。
1.材料和方法
使用具有表1中给出的配方的EGCG溶液。对照制剂是每单位剂量含等量EGCG的胶囊。
使用人造膜插入系统进行渗透性评估
两种EGCG制剂的渗透性研究都是使用Spectrum Labs开发的即用型透析装置
Figure BDA0002504058800000191
G2进行的(http://fr.spectrumlabs.com/dialysis/FloatALyzer.html？Lang＝English&)。所述装置具有再生的纤维素生物技术酯膜(分子量截留值为3.5kDa至5kDa，膜直径为10mm，总长度为100mm)。它包括供体室，其通过纤维素生物技术酯膜与受体(接受器)隔开。受体室的容量为600mL。可用于扩散的面积为约7.85cm2(表6)。
表6：使用的即用型透析系统的参数
Figure BDA0002504058800000201
供体室和受体室的填充溶液
用于填充供体室的溶液的组成类似于组成十二指肠介质的溶液，而扩散液是pH调节为5.5的10-4mol L-1磷酸盐缓冲溶液。
Tenore等人(Food Chemistry 169(2015)320-326)提出的模拟的十二指肠介质由10-3mol L-1磷酸盐缓冲溶液、胰酶(0.4mg mL-1)和胆汁盐(2.5mg mL-1)组成。使用盐酸将最终混合物的pH调节至6.8。
体外比较渗透研究
供体室分别填充有每种制剂，即7505别要求保护的制剂或一个包含20mg EGCG和乳糖的胶囊。供体室用铝箔覆盖以防止载剂蒸发。使用带有聚四氟乙烯涂覆珠的恒温控制磁力搅拌器，将受体室内的流体保持在37±0.5℃并以非常低的速度(30rpm)连续搅拌。注意确保受体室内没有气泡。
在预设时间定期从上述受体室中取出等分试样(每次1mL)，将其用10-4mol L-1磷酸盐缓冲溶液(pH 5.5)稀释10倍，然后通过0.45μ.过滤器过滤。EGCG含量通过HPLC测定。将相同体积的扩散液在37℃下预热。取出的样品的体积由预热的扩散液代替，进入扩散池以保持体积恒定，从而可以保持漏槽条件。实验进行了长达6小时。计算每种情况下不同时间点的药物渗透率。
数据分析
使用从每种制剂的渗透性研究获得的数据来计算CEP％、Papp(表观渗透系数)和ER。
Papp和ER通过以下标准公式计算得出(Arch Appl Sci Res 2010；2:31-42；Eur JPharm Sci 1994；2:311-30；Asian J Pharm Clin Res 2010；3:31-4)：
·渗透系数(Papp)：
Papp＝(VA/面积×时间)×([EGCG]受体/[EGCG]供体)
其中，VA＝受体室中的体积，面积＝膜的表面积，时间＝总运输时间
·ER：
ER＝本申请制剂的Papp/对照(胶囊)的Papp。
HPLC分析
稀释的样品通过HPLC进行分析，HPLC是经验证的上文实施例1中所述的稳定性指示的测定方法。所述程序适用于使用外标的EGCG测定。EGCG的测定是通过将样品溶液的响应与以相似标称浓度制备并以相同方式分析的EGCG参考标准溶液的响应进行比较来实现的。使用合适的色谱柱和色谱条件，通过梯度反相HPLC和UV检测分析样品和参考标准溶液。
2.结果
以纤维素生物技术酯膜为扩散膜，模拟的肠道介质为扩散液，在最长达6h的不同时间对两种EGCG制剂(本发明的溶液与对照，即胶囊中的EGCG)进行渗透性研究。
表7和表8提到了这项调查的结果。所有样品均在6h后测定CEP％和Papp值。在对照制剂(胶囊)的情况下，这些值是最低/最小值，而本发明的溶液显示出最大值。有趣的是，这项研究中对照制剂的Papp值与Zhang等人(International Journal of Pharmaceutics 287(2004)1-12)通过Caco-2单层模型研究GTC肠道吸收和处置的结果等同，从而证明了我们的人工膜模型和caco-2细胞模型之间的可移置性。
通过获得不同时间点的CEP％与时间的关系，上述结果在不同的图中示出(图4)。
表7：使用合成透析膜的对照(胶囊)和本发明溶液的EGCG的CEP％
Figure BDA0002504058800000221
表8：EGCG样品通过合成透析膜长达6h的体外渗透率分析
Figure BDA0002504058800000222
这项研究的总体结果表明，本发明的溶液在ER为≈4的情况下相对于对照获得最佳的渗透结果。
这些结果显然有助于提供概念证明，即本发明的溶液可以改善EGCG的生物利用度，为改善临床疗效铺平了道路。
实施例3：水溶液对光照射的稳定性
将具有表1所列配方的EGCG溶液分配到15mL派热克斯玻璃小瓶中，密封并使用以窗口模式运行的氙气测试室Q-SUN Xe-1曝光。呈现出300nm至800nm特征光谱的光束以1.50W m-2的强度发射。暴露1小时后取出样品的等分试样。对于溶液未观察到颜色变化。此外，测试溶液的色谱图与起始溶液的色谱图相同，即其具有与EGCG和最初存在的另一种绿茶多酚(ECG)的峰相同的峰。
实施例4：大鼠中的EGCG血浆浓度
进行该测试以比较在大鼠经口施用含有EGCG的胶囊和本发明的EGCG制剂后获得的血浆浓度和曲线下总面积(AUC总)。
1.材料和方法
动物
使用9只体重至少300g的雄性Sprague-Dawley大鼠。其由Janvier Labs提供。
体内测试位于Eurofins ADME生物分析仪的啮齿动物区域。房间内有完全人工照明，控制周期为12小时光照时间，12小时黑暗时间。其由被设计用来维持正常条件的空调系统调节。耳标识别出每只动物。检查动物的总体健康和福利。在实验过程中，动物可以自由获取食物和水。
根据Eurofins ADME生物分析仪当前使用的程序进行处理、治疗和安乐死。
分析测试
分析测试基于de Lourdes等人(J.Agric.Food Chem.2007,55,8857–8863)描述的方法。
直接注入MS-MS系统后，为每个分子选择分子离子和子离子。分析方法由以下组成：通过加入适当的溶剂使蛋白质沉淀，然后进行LC-MS/MS分析。根据预期的灵敏度，至少使用8个校准标准品来制备血浆中的校准曲线。计算相应的相关系数，并且相关系数必须高于0.75才能继续进行体内测试。
测试的校准范围是血浆中的EGCG为4ng/mL至5000ng/mL。所观察到的平均浓度与标称浓度之间的差异用于估计该方法的偏差。
用于体内测试的制剂
根据经验施用的两种EGCG制剂(由亨利蒙多尔医院药房制备的对照制剂和本发明的溶液)列于下表9中。
表9：用于体内测试的EGCG制剂
Figure BDA0002504058800000241
*为了增加施用量并优化精度，所用大鼠的最小体重为300克。
制剂在室温下储存。在施用期间将制剂保持在磁力搅拌器下。
血液采样和采样时间
在规定的时间，采集血液并按以下指示进行处理：
采集部位：眶后静脉窦，使用毛细管
采血量：每个时间点最低0.300mL
抗凝剂：肝素锂
记录每个血液样品的准确采样时间。
将血液样品在10℃下以2500rpm离心，取出血浆并将其放入标记的聚丙烯管中。
将这些单独的血浆样品冷冻保存(-20℃±5℃)直至分析。
表10中列出了上述两种制剂的采样时间。
表10：采样时间
Figure BDA0002504058800000251
2.结果
浓度和AUC总结果总结在下表11中。
图5说明了血浆EGCG浓度随时间的变化。
如这些结果所示，以相同的剂量施用，由本发明的制剂产生的全身暴露远高于含有100％EGCG粉末的传统胶囊形式所产生的全身暴露。实际上，每剂量的总AUC比为18有利于由本发明得到的制剂。
表11：血浆浓度和AUC总结果
Figure BDA0002504058800000261

Claims (17)

1.一种稳定的药物水溶液或皮肤化妆品水溶液，其包含：
-13mg/ml至107mg/ml的表没食子儿茶素没食子酸酯，
-至少一种二糖，
-0.1mmol/l至1.0mmol/l的至少一种螯合剂，
-药学上可接受的或皮肤化妆品上可接受的pH调节剂，
其中所述溶液的pH为3.0至4.0，表没食子儿茶素没食子酸酯/二糖的摩尔比为0.1至0.8，特别是0.25。
2.根据权利要求1所述的药物水溶液或皮肤化妆品水溶液，其中所述二糖选自蔗糖和海藻糖。
3.根据权利要求1或2所述的药物水溶液或皮肤化妆品水溶液，其还包含至少一种适用于水性体系并与酸性pH相容的抗氧化剂，特别地选自抗坏血酸、异抗坏血酸、单硫代甘油、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠和还原糖。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的药物水溶液或皮肤化妆品水溶液，其中所述溶液不含有机溶剂。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的药物水溶液或皮肤化妆品水溶液，其中所述溶液还包含选自乙醇、丙二醇、甘油、PEG 400的有机溶剂。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的药物水溶液或皮肤化妆品水溶液，其中所述螯合剂选自柠檬酸、依地酸二钠钙、依地酸二钠、富马酸、苹果酸、麦芽酚和喷替酸。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的药物水溶液或皮肤化妆品水溶液，其中药学上可接受的pH调节剂选自乙酸、己二酸、碳酸铵、氢氧化铵、磷酸铵、柠檬酸、二乙醇胺、富马酸、盐酸、苹果酸、硝酸、丙酸、乙酸钾、碳酸氢钾、氯化钾、柠檬酸钾、偏磷酸钾、磷酸钾、乙酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠、柠檬酸钠、乙醇酸钠、氢氧化钠、乳酸钠、磷酸钠、丙酸钠、琥珀酸、硫酸、酒石酸、三乙醇胺。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的药物水溶液或皮肤化妆品水溶液，其包含或组成为：
-13mg/ml至107mg/ml，特别是27mg/ml至67mg/ml，更特别是27mg/ml至53mg/ml的表没食子儿茶素没食子酸酯，
-0.05mg/ml至3.0mg/ml，特别是0.08mg/ml至0.25mg/ml，更特别是0.10mg/ml至0.20mg/ml的柠檬酸，
-25mg/ml至140mg/ml，特别是50mg/ml至125mg/ml，更特别是100mg/ml至125mg/ml的蔗糖，
-任选地，25mg/ml至250mg/ml，特别是100mg/ml的葡萄糖和/或果糖。
9.根据权利要求8所述的药物水溶液或皮肤化妆品水溶液，其包含或组成为：
-27mg/ml的表没食子儿茶素没食子酸酯，
-0.1mg/ml的柠檬酸，
-100mg/ml的蔗糖，
-100mg/ml的葡萄糖。
10.表没食子儿茶素没食子酸酯的单位剂量，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的药物水溶液或皮肤化妆品水溶液。
11.根据权利要求10所述的单位剂量，其中所述单位剂量的体积为5ml至30ml，特别是10ml至15ml，更特别是15ml。
12.根据权利要求10或11所述的单位剂量，其中表没食子儿茶素没食子酸酯的重量为200mg至1600mg，特别是400mg至1200mg，更特别是400mg。
13.一种固体组合物，其通过根据权利要求1至9中任一项所述的药物水溶液或皮肤化妆品水溶液或根据权利要求10至12中任一项所述的单位剂量的任何脱水过程，特别是冻干而得到。
14.根据权利要求1至9中任一项所述的药物水溶液、或根据权利要求10至12中任一项所述的单位剂量、或根据权利要求13所述的固体组合物，其用作治疗癌症、心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病或皮肤病的药物。
15.一种由表没食子儿茶素没食子酸酯和二糖形成的混合物，其中表没食子儿茶素没食子酸酯/二糖的摩尔比为0.1至0.8，特别是0.25。
16.一种皮肤药物产品，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的药物水溶液、或根据权利要求10至12中任一项所述的单位剂量、或根据权利要求13所述的固体组合物。
17.一种皮肤化妆品，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的皮肤化妆品组合物或权利要求13所述的固体组合物。
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