CN111362964A - 青蒿琥酯的琥珀酯化衍生物及其制备方法和药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种青蒿琥酯的琥珀酯化衍生物及其制备方法，该琥珀酯化衍生物为二氢青蒿素‑1,2‑α‑琥珀酸‑乙二醇‑琥珀酸双酯，以及该琥珀酯化衍生物在制备防治脓毒症和胰腺炎药物中的用途，该琥珀酯化衍生物相比青蒿琥酯表现出更强的药理活性和安全性。

Description

青蒿琥酯的琥珀酯化衍生物及其制备方法和药物中的用途

技术领域

本发明属于医药和药物制剂领域，具体涉及一种青蒿琥酯的琥珀酯化衍生物及其制备方法，以及青蒿琥酯的琥珀酯化衍生物在制备治疗脓毒症及脓毒症相关疾病如胰腺炎药物中的用途。

背景技术

脓毒症是由感染引发的全身炎性反应综合征(systematic inflammatoryresponse syndrome,SIRS)，也是外科大手术、各种感染、创伤、烧伤、缺氧再灌注损伤等严重的并发症之一。失控、持续放大的SIRS是脓毒症患者死亡的主要原因。临床脓毒症的治疗非常棘手，主要以糖皮质激素等非特异性治疗以及防治器官功能衰竭和休克等对症治疗为主，死亡率仍然居高不下，每年约有20万人死于脓毒症。

急性胰腺炎(Acute Pancreatitis，AP)是临床常见病，发病率高。其中，重症急性胰腺炎发病急、变化快而复杂：可从最初的胰腺组织的局部病变迅速发展成为SIRS、脓毒症、脓毒症休克乃至多器官功能衰竭(multiple organ failure syndrome,MOF)，甚至死亡。目前临床采用综合疗法进行治疗，但效果并不满意，死亡率仍然高达30％，位居院内死亡原因第五位。

由于炎症贯穿整个急性胰腺炎的病理生理过程，如果SIRS得不到控制，则由于感染因素的出现导致脓毒症、脓毒症休克和MOF，因此针对SIRS的药物的研发和使用成为治疗急性胰腺炎的策略之一。

研究发现抗疟药物青蒿琥酯(Artesunate，以下简称“AS”)具有抗炎作用。AS可抑制诱导SIRS和脓毒症发生的重要致病因子内毒素(LPS)、CpG DNA等诱导的单核/吞噬细胞的激活，显著减少TNF-α、IL-6等炎症细胞因子的产生，体内试验中，AS显著降低脓毒症模型小鼠体内血清内毒素、血清TNF-α、IL-6等炎症细胞因子的水平。此外，阎紫菲等报道青蒿琥酯对急性胰腺炎动物模型具有治疗作用，可使组织病变情况明显减弱，胰腺系数、血清淀粉酶、组织脂肪酶和胰蛋白酶的活力都明显降低。

但由于青蒿琥酯半衰期短(t_1/221.6～45.6分钟)，在进行脓毒症或急性胰腺炎的治疗上需持续静脉给药或反复血管外给药，不便于重症病人的抢救用药，且存在肝肾毒性风险。因此，有必要研发一种半衰期更长的青蒿琥酯类衍生物。

AS的体内过程研究表明,AS经水解酶转化代谢为二/双氢青篙素(dihydroartemisinin，DHA)。水解酶可能包括非微粒体酶和微粒体酶，因此这一转化过程广泛地存在于胃、小肠、肝脏以及血液中，此外，AS在胃肠道中还可通过酸的化学水解作用转化为DHA。因此，本发明人构思在AS的侧链上再接上一个侧链酯，以减慢AS在体内的水解过程，从而提高AS的半衰期。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种青蒿琥酯的琥珀酯化衍生物，本发明目的旨在提高青蒿琥酯的半衰期短，但意外发现该衍生物相对青蒿琥酯具有更强的抗脓毒症和胰腺炎活性及更好的安全性。

为实现本发明的目的，提供如下实施方案。

在一实施方案中，本发明提供一种青蒿琥酯的琥珀酯化衍生物，为式I所示的化合物：

式I所示化合物，中文化学名为二氢青蒿素-1,2-α-琥珀酸-乙二醇-琥珀酸双酯(简称青蒿双琥酯)，本案后续简写为“DA”。

DA为青蒿琥酯的琥珀酯化衍生物，其英文化学名为：

4-oxo-4-(2-((4-oxo-4-(((3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12S,12aR)-3,6,9-trimethyldodecahydro-3,12-epoxynaphtho[8a,1-c][1,2]dioxepin-10-yl)oxy)butanoyl)oxy)ethoxy)butanoic acid。

DA分子式为C₁₉O₈H₂₈分子量528.5461Da，略溶于水，易溶于有机溶剂。

在另一实施方案中，本发明提供一种制备青蒿琥酯的琥珀酯化衍生物的方法。具体实施如下：

本发明的一种制备式I所示化合物的方法，包括以下步骤：

1)将青蒿琥酯与乙二醇反应得到式II化合物；

2)将式II化合物与琥珀酸酐反应，得到式I所示化合物。

本发明还提供了一种药物组合物，含有式I所示的青蒿琥酯的琥珀酯化衍生物和药学上可接受的辅料。

所述组合物可以是片剂、注射剂、胶囊。所述药用辅料也是本领域常规的药用辅料。如填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂等，注射用的辅料如冻干赋形剂甘露醇、山梨醇、蔗糖、L-精氨酸等。

又一方面，本发明的目的在于提供了式I所示的青蒿琥酯的琥珀酯化衍生物在制备治疗或/和预防脓毒症药物中的应用。

上述本发明所述的应用，所述脓毒症为感染或非感染因素引起的全身炎症反应综合症。

本发明的目的还在于提供了一种式I所示的青蒿琥酯的琥珀酯化衍生物在制备治疗胰腺炎的药物中的应用。

优选的，上述本发明的应用，所述胰腺炎为急性胰腺炎。其中，所述急性胰腺炎，其诊断符合以下三个特征中的两个：(1)腹痛符合急性胰腺炎特征，所述急性胰腺炎特征为急性持续严重的上腹部疼痛常向背部放射；(2)血清脂肪酶活性或淀粉酶活性至少大于正常值上限3倍；(3)增强CT、CECT、MRI或腹部超声发现有急性胰腺炎的特征性。

更优选的，上述本发明的应用，所述急性胰腺炎为感染性或非感染性急性胰腺炎，所述非感染性急性胰腺炎是由胆道疾病或酒精所致。

本发明的青蒿琥酯的琥珀酯化衍生物青蒿双琥酯，可用于脓毒症的治疗，尤其是用于胰腺炎治疗，能够降低炎症因子，改善胰腺状态，降低急性胰腺炎动物的死亡率。

在上述实施方案中，本发明的应用，所述脓毒症，其诊断符合以下四个特征中的两个：(1)呼吸：频率>22次/min或是PaCO₂<32mmHg；(2)体温：>38℃或<36℃；(3)心率：>90次/min；(4)白细胞：>12x10⁹/L l或<4.0x10⁹/L。

本发明合成青蒿琥的琥珀酯化衍生物青蒿双琥酯，通过体外细胞实验筛选出毒性小、对不同致炎成分诱导的细胞因子释放有较强抑制作用的青蒿琥酯新衍生物。

其给药途径可为口服、肌肉或静脉注射，实验表明青蒿双琥酯具有优于青蒿琥酯的抗炎作用，可显著降低脓毒症模型动物的血清炎症因子，可使急性胰腺炎模型动物组织病变情况显著减弱。

因此，在青蒿琥酯化学结构的基础上，设计合成新的青蒿琥酯衍生物青蒿双琥酯，提高其抗炎活性，改善药代动力学特征，是对提高青蒿琥酯衍生物的利用，对脓毒症及相关疾病的治疗现状具有重要意义。

本发明的青蒿双琥酯单独使用可改善急性胰腺炎动物的胰腺病理变化。实验结果表明，相对于青蒿琥酯，青蒿双琥酯可明显降低热灭活大肠杆菌所致的脓毒症小鼠的血清炎症因子，也可明显降低雨蛙素联合LPS致急性胰腺炎小鼠胰腺系数，明显改善胰腺组织的病变情况和降低模型小鼠的血清淀粉酶，以及胰腺组织蛋白酶和脂肪酶活性。

因此，本发明的青蒿琥酯新衍生物青蒿双琥酯治疗脓毒症的用途，特别是治疗急性胰腺炎的用途，为脓毒症以及急性胰腺炎患者的治疗提供了新的选择。青蒿双琥酯日用量为10-400mg,30-200mg或60-120mg。

附图说明

图1表示青蒿双琥酯对巨噬细胞(RAW264.7cell)和腺泡细胞(AR42Jcell)的细胞毒性图；

图2表示青蒿琥酯、青蒿双琥酯对脓毒症模型小鼠血清炎症因子的影响图；

图3-1表示正常胰腺组织和模型动物胰腺组织图，其中Control代表正常对照组、AP代表空白对照正常组织、AS代表青蒿琥酯用药模型，DA代表青蒿双琥酯用药模型；

图3-2表示正常胰腺和模型动物胰腺组织病理图，其中Control代表正常对照组组织病理、AP代表模型组组织病理、AS代表青蒿琥酯治疗组组织病理，DA代表青蒿双琥酯治疗组组织病理。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但所述实施例仅用于理解本发明的精神实质而不是限制本发明的范围。

实施例1青蒿双琥酯的制备

反应式如下：

1、青蒿琥酯乙二醇酯(式II化合物)的制备

以青蒿琥酯为原料，在反应瓶中依次加入青蒿琥酯(1g，2.6mmol)，二环己基碳二亚胺(DCC，0.59g，2.86mmol)，4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.1g，0.78mmol)，5ml二氯甲烷，在0℃下搅拌反应1h以后，加入乙二醇(0.18g，2.86mmol)，室温反应10小时后，TLC检测反应结束后，过滤，滤液浓缩，剩余物通过柱层析分离得到目标产物即青蒿琥酯乙二醇酯(1g，收率90％，无色油状)。

产物核磁共振氢谱：¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝6.79(d,J＝8.01H),5.44(s,1H),4.30-4.18(m,2H),3.81(m,2H),2.78-2.68(m,4H),2.60-2.55(m,1H),2.42-2.34(m,1H),2.06-1.24(m,16H),0.96(d,J＝4.03H),0.86(d,J＝4.03H)ppm。

2、青蒿双琥酯(式I化合物)的制备

在反应瓶中加入上步所得的青蒿琥酯乙二醇酯式II(1g，2.34mmol)，琥珀酸酐(0.23g，2.34mmol)，5ml二氯甲烷，室温反应12小时，TLC检测反应结束后，滤液浓缩，剩余物通过柱层析分离得到目标产物DA1002(即青蒿双琥酯)1.1g，收率90％，无色油状。

最终产物编号DA1002，¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝6.78(s,1H),5.45(s,1H),4.30-3.0(m,4H),2.78-1.24(m,26H),0.97(d,J＝4.03H),0.85(d,J＝4.03H)ppm。

实施例2青蒿双琥酯治疗脓毒症作用试验

首先建立亚致死剂量的热灭活大肠埃希菌攻击小鼠的脓毒症小鼠模型，观察单独使用青蒿琥酯(AS)和青蒿双琥酯(DA)对模型的治疗作用，是否改善炎症反应，降低脓毒症模型动物的炎症因子水平。

灌胃DA的半数致死量LD₅₀为(618.24mg/kg)；DA的细胞毒性实验结果见(图1)：小鼠单核-巨噬细胞(RAW264.7 cell)，DA的10％抑制率(IC₁₀)为2.03μM,而在大鼠胰腺腺泡细胞(AR42J cell)中IC₁₀为2.84μM，以IC₁₀换算得小鼠上使用的安全给药剂量约为4.2mg/kg。青蒿琥酯AS临床上给药剂量为60mg/d，按照人－小鼠体表面积给药剂量公式换算得小鼠上使用的等效剂量约为7.5mg/kg。

采用亚致死剂量的热灭活大肠杆菌尾静脉注射建立脓毒症小鼠模型。对比研究青蒿双琥酯(DA)与青蒿琥酯(AS)对脓毒症的治疗作用效果。

实验小鼠制模前适应性喂养一周。将80只小鼠，雌雄各半，完全随机方法分成8个组，每组10只。以1.1×10¹¹CFU/kg的热灭活大肠杆菌尾静脉注射制备脓毒症小鼠模型。分组为：正常组、模型组、青蒿双琥酯三个剂量组治疗组(DA4.0 mg/kg、组DA2.0 mg/kg组、DA1.0mg/kg组)，青蒿琥酯三个剂量治疗组(AS7.5mg/kg组、AS5.0mg/kg组、AS2.5mg/kg组)。于建模0h、4h、24h各重复给药一次，采用肌肉注射给药进行DA治疗或AS治疗。造模后48h，小鼠眼眶取血，4℃放置1h，3500r/min、10min、4℃离心，取上清，测定细胞炎症因子TNF-α，IL-6。

实验结果：结果见图2(DA组与模型组相比，^*P<0.05，^**P<0.01；与正常组比较，^##P<0.01，与青蒿琥酯治疗组相比，

)

模型组小鼠血清TNF-α，IL-6水平增加明显，与正常组比较有非常显著差异(P<0.01,图2)；青蒿琥酯治疗组与模型组比较，高、中剂量组中血清TNF-α，IL-6水平都有不同程度的降低(P<0.05或P<0.01)；青蒿双琥酯治疗组与模型组比较，各剂量组中血清TNF-α、IL-6水平有非常显著降低(P<0.01)；高剂量、中剂量青蒿双琥酯治疗后血清TNF-α分别与高剂量、中剂量青蒿琥酯治疗组比较有显著差异(P<0.05)，高剂量、中剂量青蒿双琥酯治疗后血清IL-6水平分别与高剂量、中剂量青蒿琥酯治疗组比较有显著差异(P<0.05，图2)。

实施例3青蒿双琥酯治疗急性胰腺炎作用试验

雨蛙素联合脂多糖致急性胰腺炎小鼠模型，观察单独使用青蒿琥酯(AS)和青蒿双琥酯(DA)对模型的治疗作用，是否能改善急性胰腺炎模型动物的胰腺炎症反应，降低酶活性。

采用雨蛙素联合LPS(脂多糖)建立急性胰腺炎小鼠模型。实验小鼠制模前禁食12h，不禁水。将80只小鼠，雌雄各半，完全随机方法分成8个组，每组10只。以100μg/kg的雨蛙素，连续6次，每次间隔1h，末次注射LPS(10mg/kg)制备急性胰腺炎小鼠模型。分组为：青蒿双琥酯三个剂量组治疗组(DA4.0 mg/kg、DA2.0 mg/kg组、DA1.0 mg/kg组)，青蒿琥酯三个剂量治疗组(AS7.5mg/kg组、AS5.0mg/kg组、AS2.5mg/kg组)。建模成功后，采用肌肉注射给药，立即进行青蒿琥酯治疗或DA进行治疗。于第一次给药后4h重复肌肉注射。造模后18h，分别对小鼠眼球取血，4℃放置1h，3500r/min、10min、4℃离心，取上清，测定血清淀粉酶；采用颈椎脱臼法处死小鼠，切取胰腺：计算胰腺系数胰、病理学观察、测定胰组织脂肪酶和蛋白酶。

胰腺系数＝胰腺湿重(mg)/小鼠胫骨长度(cm)。

病理切片按照Rongione病理评分标准进行评分。

实验结果：结果见图3

正常组的胰腺组织呈浅粉色(图3-1Control)，模型组小鼠(图3-1AP)的胰腺组织与周围组织粘连，腺体肿胀，色灰白，有较多出血点，表现为严重水肿、血管充血甚至出血；此外，模型组胰腺系数较正常组显著增加(P<0.01,表1)。上述结果说明采用100μg/kg雨蛙素联合脂多糖可成功建立急性水肿型胰腺炎模型。

表1 DA对雨蛙素联合LPS致急性胰腺炎模型小鼠胰腺系数的影响(

n＝10)

注：与模型组相比，^*P<0.05，^**P<0.01；与正常组比较，^#P<0.05，^##P<0.01，与青蒿琥酯相比，

不同剂量青蒿琥酯治疗组小鼠胰腺组织血管充血情况有一定减轻、出血点减少，颜色接近正常对照组(图3-1AS)，胰腺系数均较模型组有非常显著降低(P<0.01,表1)；各剂量组青蒿双琥酯治疗，组织血管充血不明显，出血点不明显，颜色与正常组相近(图3-1DA)，青蒿双琥酯低剂量治疗组胰腺系数较青蒿琥酯低剂量组有非常显著降低(P<0.01,表1)，高、中剂量组也较青蒿琥酯组也有显著降低(P<0.05,表1)。

组织病理学显示，正常组腺泡排列规则，胰腺小叶间隔清晰(图3-2Control)；而模型组腺体结构紊乱，腺泡细胞肿胀，腺体实质内可见凝固性坏死并伴有出血，有大量炎细胞浸润(图3-2AP)。高、中剂量青蒿琥酯治疗组胰腺出血、肿胀和炎性浸润较模型组呈不同程度减轻，胰腺损伤的组织病理学评分均降低，有显著性差异(P<0.05)(图3-2AS,表2)。各剂量组青蒿双琥酯治疗，胰腺出血、坏死和炎性浸润较单用青蒿琥酯治疗组有进一步减轻，胰腺损伤的组织病理学评分均降低，均较青蒿琥酯组有显著降低(P<0.01或0.05)(图3-2DA,表2)。

表2 DA对雨蛙素联合LPS致急性胰腺炎模型小鼠酶活性的影响(

n＝10)

注：与模型组相比，^*P<0.05，^**P<0.01；与正常组比较，^#P<0.05，^##P<0.01，与青蒿琥酯相比，

模型组小鼠血清淀粉酶活力、组织胰脂肪酶活力和胰蛋白酶水平增加明显，与正常组比较有非常显著差异(P<0.01,表2)；青蒿琥酯治疗组与模型组比较，各剂量组中血清淀粉酶、组织匀浆中脂肪酶活力和胰蛋白酶都有不同程度的降低(P<0.05或P<0.01，表2)；不同剂量青蒿双琥酯治疗与青蒿琥酯组比较，各组中血清淀粉酶有显著降低(P<0.01，表3)，高剂量(4.0mg/kg)青蒿双琥酯治疗组组织匀浆中脂肪酶与青蒿琥酯治疗高剂量组比较有非常显著差异(P<0.01，表2)，中(2.0mg/kg)、低(1.0mg/kg)剂量组有显著差异(P<0.05，表3)；高(7.5mg/kg)和中(5.0mg/kg)剂量青蒿双琥酯治疗组的胰蛋白酶水平分别与青蒿琥酯高、中治疗组比较有非常显著差异(P<0.01，表2)。

Claims (10)

1.一种青蒿琥酯的琥珀酯化衍生物，为式I所示的化合物：

2.一种制备式I所示化合物的方法，包括以下步骤：

1)将青蒿琥酯与乙二醇反应得到式II化合物；

2)将式II化合物与琥珀酸酐反应，得到式I所示化合物。

3.一种药物组合物，含有权利要求1的青蒿琥酯的琥珀酯化衍生物和药学上可接受的辅料。

4.权利要求1的青蒿琥酯的琥珀酯化衍生物在制备治疗或/和预防脓毒症药物中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，所述脓毒症为感染或非感染因素引起的全身炎症反应综合症。

6.权利要求1的青蒿琥酯的琥珀酯化衍生物在制备治疗胰腺炎的药物中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，所述胰腺炎为急性胰腺炎。

8.如权利要求7所述的应用，所述急性胰腺炎，其诊断符合以下三个特征中的至少两个：(1)腹痛符合急性胰腺炎特征，所述急性胰腺炎特征为急性持续严重的上腹部疼痛常向背部放射；(2)血清脂肪酶活性或淀粉酶活性至少大于正常值上限3倍；(3)增强CT、CECT、MRI或腹部超声发现有急性胰腺炎的特征性。

9.如权利要求7所述的应用，所述急性胰腺炎为感染性或非感染性急性胰腺炎。

10.如权利要求9所述的应用，所述非感染性急性胰腺炎是由胆道疾病或酒精所致。

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