CN111362790A - 一种分离epa和dha的色谱方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是针对市场对高纯度的EPA和DHA需求，提供了分离EPA和DHA的色谱方法，属于液相制备色谱分离技术领域。其色谱体系为：固定相为反相键合硅胶；流动相为碱性乙醇‑水；色谱柱再生液为流动相或者V_乙醇/V_水比例高于流动相的乙醇‑水溶液或者乙醇；色谱柱平衡液为流动相；用碱性乙醇‑水稀释原料，由此形成进样液，或用乙醇稀释原料形成进样液，所用原料含有EPA和DHA的混合物，EPA和DHA的质量百分数总和≥20％。用批色谱(色谱单柱)或梯度洗脱的批色谱或模拟移动床色谱设备实现EPA和DHA的分离。

Description

一种分离EPA和DHA的色谱方法

技术领域

本发明属于液相制备色谱分离技术领域，具体涉及一种液相色谱分离EPA和DHA及制备高纯EPA和DHA的工艺方法。

背景技术

二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)是ω-3不饱和脂肪酸系列(PUFA)中最重要的两种特征脂肪酸，是一些鱼油膳食补充剂和处方药的重要成分，对人体具有重要的生物学意义。EPA能降血脂、防治动脉粥样硬化等心血管疾病；DHA能健脑、增强记忆力和提高视力，适于幼儿、青少年孕妇等群体。市场上的EPA和DHA制品大多数是EPA+DHA的混合物。为了适用不同的使用对象、达到不同的使用目的，充分发挥EPA、DHA制剂的功效，要求EPA、DHA产品纯度越高越好，这不仅可提高疗效，而且还可减少不必要的副作用。

由于EPA和DHA分子结构相似，很难从它们的混合物中得到纯组分。目前的尿素包合法、低温结晶、分子蒸馏、银离子络合、超临界流体萃取和脂肪酶等EPA和DHA分离方法很难获得高纯度的单一组分。液相色谱法是制备高纯度EPA和DHA的主要方法，如：C18为固定相，含四氢呋喃的三元体系为流动相的色谱法[Journal of ChromatographyA，459(1988)369-378]；C18为固定相，含乙腈和水为流动相的色谱法[Journal of Chromatography A，1097(2005)54-58]；C18为固定相，用4种溶剂洗脱的色谱法，第一、第二和第三溶剂均至少包括水、DMF、DMSO、甲醇、乙醇和乙腈中的一种[CN 105272844 B，2014]；还有分别负载银离子的硅胶、离子交换树脂、分子筛的色谱法，该色谱法的弊端是非常明显的，银离子的失去，会造成重金属污染。

间歇色谱法存在收率低、溶剂消耗量大、成本高等缺点。模拟移动床(SMB)色谱法能够实现色谱过程的自动化和连续化，具有收率高、溶剂消耗量小、成本低等优势。巴斯夫公司以C18为固定相，以甲醇-水为流动相，采用SMB工艺对多不饱和脂肪酸进行分离纯化，EPA乙酯(EPA-EE)、DHA乙酯(DHA-EE)的纯度达到95％[US 9493392，2016]。李敏等用SMB分离EPA-EE和DHA-EE，其固定相是10μm C18，流动相是纯甲醇，获得的EPA-EE和DHA-EE纯度分别达到99％[Journal of Chromatography A，1425(2015)189-197]。

但是，现有分离技术大多数以EPA和DHA的乙酯形式为原料。实际处理鱼油过程中EPA和DHA比其乙酯形式更容易获得，重要的是，Omega-3脂肪酸的生物利用度比乙酯型大[Journal of Clinical Lipidology，6(2012)573-584]。

为此，本发明用碱性乙醇-水为流动相实现EPA和DHA的色谱分离。

发明内容

本发明的目的是针对市场对高纯度的EPA和DHA需求，提供了分离EPA和DHA的色谱方法。该法采用以C18为固定相，碱性乙醇-水为流动相的色谱体系。可以用批色谱(色谱单柱)或梯度洗脱的批色谱或模拟移动床色谱设备实现EPA和DHA的分离。

一种分离EPA和DHA的色谱方法，包括如下步骤：

色谱体系为：固定相为反相键合硅胶；流动相为碱性乙醇-水，7.5≤pH≤11；色谱柱再生液为流动相或者V_乙醇/V_水比例高于流动相的乙醇-水溶液或者乙醇；色谱柱平衡液为流动相；用碱性乙醇-水稀释原料，并控制7.5≤pH≤11，由此形成进样液，或用乙醇稀释原料形成进样液，所用原料含有EPA和DHA的混合物，EPA和DHA的质量百分数总和≥20％；色谱分离由色谱单柱完成或由SMB色谱设备完成；

或者，上述色谱体系中的乙醇由甲醇代替。

上述分离EPA和DHA的色谱方法，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，粒度为20-60μm，流动相中乙醇与水的体积比为4/6-7/3。

上述分离EPA和DHA的色谱方法，所述色谱分离由色谱单柱完成，在色谱单柱入口处依次注入进样液、流动相，在色谱单柱出口处先截取EPA馏分，后截取DHA馏分；当需要进行下一次色谱分离时，继续注入再生液、平衡液。

上述分离EPA和DHA的色谱方法，色谱分离采用流动相梯度洗脱。

上述分离EPA和DHA的色谱方法，所述的流动相梯度洗脱为：或者乙醇与水的体积比依次增大，或者pH依次减小，或者二者均变化。

上述分离EPA和DHA的色谱方法，所述色谱分离由SMB色谱设备完成，即：SMB设置三带运行模式，包括洗脱带I带、精制带II带和吸附带III带，a为洗脱带色谱柱数目，1≤a≤2，b为精制带色谱柱数目，1≤b≤3，c为吸附带色谱柱数目，1≤c≤3，运行模式用a-b-c表示；沿流动相方向设置洗脱液入口P、萃取液出口E、流动相入口D、原料液入口F和萃余液出口R的位置；在洗脱带由P泵泵入再生液，萃取液E流速Q_E＝P泵的泵速Q_P，在精制带由D泵泵入流动相，在吸附带由F泵泵入进样液F，萃余液R流速Q_R＝D泵的泵速Q_D+F泵的泵速Q_F；SMB自动控制系统按切换时间T_S沿流动相方向将所有入口和出口的位置同时移动至下一根色谱柱；从萃余液出口R得到EPA，从萃取液出口E得到DHA。

上述分离EPA和DHA的色谱方法，按三角形理论针对色谱体系选择一定进样浓度下的Q_D、Q_F和切换时间T_S，确定SMB色谱分离条件。

上述分离EPA和DHA的色谱方法，用NaOH、KOH、Na₂CO₃或氨水调整pH。

上述分离EPA和DHA的色谱方法，碱性乙醇-水含质量百分数为0.01-0.1％的NaOH。

上述分离EPA和DHA的色谱方法，色谱单柱分离得到的EPA馏分和DHA馏分，以及SMB分离得到的E口的萃取液、R口的萃余液经过蒸馏回收乙醇后，酸化为中性至弱酸性，分出上层得到EPA和DHA。

本发明与现有制备色谱分离技术相比，其显著的有益效果体现在：

1、针对市场对高纯度的EPA和DHA需求，提供了分离EPA和DHA的色谱体系。

2、用批色谱(色谱单柱)对EPA和DHA分离度≥1.5，设备简单。

3、梯度洗脱的批色谱增加过载时的进样量。

4、用SMB技术能够规模化、稳健、连续、自动、高效地分离EPA和DHA，产品回收率高于99％，HPLC纯度高于90％，固定相和流动相能反复利用，降低了提纯成本，属于绿色环保分离过程。

5、用该法检测EPA和DHA，不用将EPA和DHA酯化，直接测定，快速简单。

附图说明

图1、实施例1的EPA和DHA流出曲线。

图2、实施例2的EPA和DHA流出曲线。

图3、实施例3的EPA和DHA流出曲线。

图4、实施例4的EPA和DHA流出曲线。

图5、实施例5的EPA和DHA流出曲线。

图6、实施例6的EPA和DHA流出曲线。

图7、实施例7的EPA和DHA流出曲线。

图8、实施例8SMB分离EPA和DHA的区域。

图9、实施例8实验点⑧的萃余液EPA和萃取液DHA的HPLC谱图；

(a)萃余液EPA的HPLC谱图，(b)萃取液DHA的HPLC谱图。

具体实施方式

EPA和DHA的检测方法为：

高效液相色谱仪：Agilent 1200；分析色谱柱：Extend-C18，5μm，150mm×4.6mmI.D.；流动相：甲醇-水体积比为V_甲醇/V_水＝68/32，pH＝8；检测波长：210nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃。由EPA和DHA标准品来标定待测液EPA和DHA的含量。

实施例中纯度不特殊说明均为相对纯度，仅考虑EPA和DHA两组分，反映两者分离情况。

以下实施例1～8中，色谱单柱分离得到的EPA馏分和DHA馏分，以及SMB分离得到的出口E的萃取液、出口R的萃余液经过蒸馏回收乙醇后，酸化为中性至弱酸性，分出上层即得到EPA和DHA。

实施例1

一种分离EPA和DHA的色谱方法：

固定相：十八烷基硅烷键键合硅胶(C18)为固定相，粒度30-40μm；

色谱柱规格：长度10cm，直径1cm；

原料：EPA的质量百分数为52％，DHA的质量百分数为38％；

进样液：EPA浓度＝2.6mg/mL，DHA浓度＝1.9mg/mL，介质为流动相，pH＝9；

流动相：乙醇-水体积比V_乙醇/V_水＝57/43，pH＝9；

流动相流速：1.5mL/min；

进样时间：0.5min；

工作温度：室温；

在上述条件下，得到的流出曲线见图1。

在t₁＝12min至t₂＝18min时间段，收集流出液，得到EPA馏分，纯度：95.6％，收率：100％；

在t₁＝19min至t₂＝37min时间段，收集流出液，得到DHA馏分，纯度：91.6％，收率：94.0％。

再生液：乙醇；

平衡液：同流动相。

实施例2

一种分离EPA和DHA的色谱方法：

除下述条件，其它均同实施例1：

进样液：EPA浓度＝5.2mg/mL，DHA浓度＝3.9mg/mL，介质为流动相，pH＝9；

进样时间：1min。

在上述条件下，得到的流出曲线见图2。

在t₁＝5min至t_n＝19min时间段，收集流出液，得到EPA馏分，纯度：96.3％，收率：99.2％；

在t₁＝20min至t₂＝37min时间段，收集流出液，得到DHA馏分，纯度：95.8％，收率：85.1％。

实施例3

一种分离EPA和DHA的色谱方法：

除下述条件，其它均同实施例1：

进样液：EPA浓度＝5.2mg/mL，DHA浓度＝3.9mg/mL，介质为流动相，pH＝9；

进样时间：1.5min；

在上述条件下，得到的流出曲线见图3。

在t₁＝8min至t₂＝17min时间段，收集流出液，得到EPA馏分，纯度：95.6％，收率：91.1％；

在t₁＝19min至t₂＝37min时间段，收集流出液，得到DHA馏分，纯度：95.2％，收率：87.1％。

实施例4

一种分离EPA和DHA的色谱方法：

除下述条件，其它均同实施例1：

原料：EPA的质量百分数为40.8％，DHA的质量百分数为29.2％；

进样液：EPA浓度＝5.3mg/mL，DHA浓度＝3.8mg/mL，介质为V_乙醇/V_水＝5/5，pH为8；

进样量：2min；

流动相梯度洗脱：流动相的V_乙醇/V_水为55/45，pH分别10、9、8；依次洗脱10min、10min和8min；

在上述条件下，得到的流出曲线见图4。

在t₁＝11min至t₂＝17min时间段，收集流出液，得到EPA馏分，纯度：92.5％，收率：94.8％；

在t₁＝18min至t₂＝27min时间段，收集流出液，得到DHA馏分，纯度：91.8％，收率：88.2％。

再生液：乙醇；

平衡液：流动相的V_乙醇/V_水为55/45，pH＝10。

实施例5

一种分离EPA和DHA的色谱方法：

除下述条件，其它均同实施例1：

原料：EPA的质量百分数为40.8％，DHA的质量百分数为29.2％；

进样液：EPA浓度＝5.3mg/mL，DHA浓度＝3.8mg/mL，介质为流动相V_乙醇/V_水＝5/5，pH为8；

进样量：2.5min；

流动相梯度洗脱：流动相的V_乙醇/V_水分别为：5/5、6/4和7/3，pH＝8；依次洗脱10min、10min和8min。

在上述条件下，得到的流出曲线见图5。

在t₁＝16min至t₂＝21min时间段，收集流出液，得到EPA馏分，纯度：91.6％，收率：98.0％；

在t₁＝22min至t₂＝27min时间段，收集流出液，得到DHA馏分，纯度：97.3％，收率：89.2％。

再生液：乙醇

平衡液：流动相的V_乙醇/V_水为5/5，pH＝8。

实施例6

一种分离EPA和DHA的色谱方法：

固定相：十八烷基硅烷键硅胶(C18)为固定相，粒度20μm；

色谱柱规格：长度10cm，直径1cm；

流动相流速：1.5mL/min；

工作温度：室温；

原料：EPA的质量百分数为40.8％，DHA的质量百分数为29.2％；

进样液：EPA浓度＝5.3mg/mL，DHA浓度＝3.8mg/mL，介质为V_乙醇/V_水＝5/5，pH为8；

进样时间：2min；

流动相梯度洗脱：流动相的V_乙醇/V_水为55/45，pH分别10、9、8；依次洗脱10min、10min和14min；

上述条件下，得到的流出曲线见图6。

在t₁＝16min至t₂＝26min时间段，收集流出液，得到EPA馏分，纯度：95.3％，收率：99.7％；

在t₁＝27min至t₂＝34min时间段，收集流出液，得到DHA馏分，纯度：99.4％，收率：90.2％。

再生液：乙醇；

平衡液：流动相的V_乙醇/V_水为55/45，pH＝10。

实施例7

一种分离EPA和DHA的色谱方法：

除下述条件，其它均同实施例6；

进样量：2.5min；

流动相梯度洗脱：流动相的V_乙醇/V_水分别为：4/6、5/5和6/4，pH＝8；依次洗脱15min、15min和11min；

在上述条件下，得到的流出曲线见图7。

在t₁＝29min至t₂＝35min时间段，收集流出液，得到EPA馏分，纯度：97.3％，收率：97.5％；

在t₁＝37min至t₂＝41min时间段，收集流出液，得到DHA馏分，纯度：99.6％，收率：93.9％。

再生液：乙醇；

平衡液：流动相的V_乙醇/V_水为4/6，pH＝8。

实施例8

一种分离EPA和DHA的色谱方法：

1)SMB分离条件如下：

色谱柱：4-6根，直径1cm，长10cm；

固定相：十八烷基硅烷键合硅胶C18，20μm或30-40μm或40-60μm；

运行模式：a-b-c，即洗脱带：a根色谱柱；精制带：b根色谱柱；吸附带：c根色谱柱；

流动相：精制带和吸附带的流动相D为乙醇与水的混合溶液，体积比为5/5—7/3，pH＝8-10；

再生液：P泵95％乙醇或乙醇；

平衡液：在III带中最后一根色谱柱的平衡液为其前一根色谱柱流出液。

模拟移动床操作温度：室温；

SMB色谱分离条件的选择：按三角形理论针对色谱体系选择一定进样浓度下的Q_D、Q_F和切换时间T_S。具体为：针对色谱体系，根据EPA和DHA的色谱单柱的流出曲线，确定EPA和DHA吸附等温线；根据EPA和DHA的浓度和吸附参数(吸附等温线)，按三角形理论，得到在m_II-m_III平面坐标中可以分离的区域WRAB。其中

m_α叫做区带α.的流率比，α.为II带或III带。Q_α ^SMB(mL/min)为SMB的α带流动相的体积流量，Q_II ^SMB＝Q_D，Q_III ^SMB＝Q_D+Q_F，V为色谱单柱的柱体积，T_S为切换时间，ε为孔隙率。

具体的，针对20μm的C18，乙醇与水的混合溶液V_乙醇/V_水＝6/4，pH＝8的色谱体系，得到EPA吸附等温线为

DHA吸附等温线为

q_EPA和C_EPA分别为EPA在固定相和流动相的浓度，q_DHA和C_DHA分别为DHA在固定相和流动相的浓度。EPA的质量百分数为40.9％，DHA的质量百分数为32.5％；当进样液中C_EPA＝3.3g/L，C_DHA＝2.6g/L，得到可以分离的区域WRAB如图8，在该区域选点，实验条件见表1。

表1、SMB实验条件及分离结果

2)SMB分离过程如下：

分别在表1①-⑥的SMB工作条件下分别进行SMB分离，连续由原料液入口泵入进样液，SMB自动控制系统按切换时间T_S沿流动相方向将洗脱液入口、萃取液出口、原料液入口和萃余液出口的位置同时依次移动至下一根色谱柱，从萃余液R出口得到EPA萃余液，从萃取液E出口得到DHA萃取液，分离结果见表1①-⑥。

在实验点⑥条件下，改变SMB工作模式为1-2-2和2-2-2，记为实验点⑦和⑧，得到产品纯度进一步提高。实验点⑧的萃余液EPA和萃取液DHA的HPLC谱图分别见图9(a)(b)，EPA和DHA的全组分的色谱纯度分别为97.6％和94.5％。

实施例9

一种分离EPA和DHA的色谱方法：

固定相：十八烷基硅烷键键合硅胶(C18)为固定相，粒度20μm；

色谱柱规格：长度10cm，直径1cm；

原料：EPA的质量百分数为40.9％，DHA的质量百分数为32.5％；

进样液：EPA浓度＝3.3mg/mL，DHA浓度＝2.6mg/mL，介质为流动相，pH＝8；

流动相：乙醇-水体积比V_乙醇/V_水＝5/5，pH＝8；

流动相流速：1mL/min；

进样量：20μL；

工作温度：室温；

根据在上述条件下的流出曲线得到EPA和DHA的分离度为3.7。

Claims (10)

1.一种分离EPA和DHA的色谱方法，其特征在于，色谱体系为：固定相为反相键合硅胶；流动相为碱性乙醇-水，7.5≤pH≤11；色谱柱再生液为流动相或者V_乙醇/V_水比例高于流动相的乙醇-水溶液或者乙醇；色谱柱平衡液为流动相；用碱性乙醇-水稀释原料，并控制7.5≤pH≤11，由此形成进样液，或用乙醇稀释原料形成进样液，所用原料含有EPA和DHA的混合物，EPA和DHA的质量百分数总和≥20％；色谱分离由色谱单柱完成或由SMB色谱设备完成；

或者，上述色谱体系中的乙醇由甲醇代替。

2.根据权利要求1所述的一种分离EPA和DHA的色谱方法，其特征在于，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，粒度为20-60μm，流动相中乙醇与水的体积比为4/6-7/3。

3.根据权利要求1所述的一种分离EPA和DHA的色谱方法，其特征在于，所述色谱分离由色谱单柱完成，即：在色谱单柱入口处依次注入进样液、流动相，在色谱单柱出口处先截取EPA馏分，后截取DHA馏分；当需要进行下一次色谱分离时，继续注入再生液、平衡液。

4.根据权利要求1所述的一种分离EPA和DHA的色谱方法，其特征在于，色谱分离采用流动相梯度洗脱。

5.根据权利要求4所述的一种分离EPA和DHA的色谱方法，其特征在于，所述的流动相梯度洗脱为：或者乙醇与水的体积比依次增大，或者pH依次减小，或者二者均变化。

6.根据权利要求1所述的一种分离EPA和DHA的色谱方法，其特征在于，所述色谱分离由SMB色谱设备完成，即：SMB设置三带运行模式，包括洗脱带I带、精制带II带和吸附带III带，a为洗脱带色谱柱数目，1≤a≤2，b为精制带色谱柱数目，1≤b≤3，c为吸附带色谱柱数目，1≤c≤3，运行模式用a-b-c表示；沿流动相方向设置洗脱液入口P、萃取液出口E、流动相入口D、原料液入口F和萃余液出口R的位置；在洗脱带由P泵泵入再生液，萃取液E流速Q_E＝P泵的泵速Q_P，在精制带由D泵泵入流动相，在吸附带由F泵泵入进样液F，萃余液R流速Q_R＝D泵的泵速Q_D+F泵的泵速Q_F；SMB自动控制系统按切换时间T_S沿流动相方向将所有入口和出口的位置同时移动至下一根色谱柱；从萃余液出口R得到EPA，从萃取液出口E得到DHA。

7.根据权利要求6所述的一种分离EPA和DHA的色谱方法，其特征在于，按三角形理论针对色谱体系选择一定进样浓度下的Q_D、Q_F和切换时间T_S，确定SMB色谱分离条件。

8.根据权利要求1所述的一种分离EPA和DHA的色谱方法，其特征在于，用NaOH、KOH、Na₂CO₃或氨水调整pH。

9.根据权利要求1所述的一种分离EPA和DHA的色谱方法，其特征在于，碱性乙醇-水含质量百分数为0.01-0.1％的NaOH。

10.根据权利要求1～9任意一项所述的一种分离EPA和DHA的色谱方法，其特征在于，色谱单柱分离得到的EPA馏分和DHA馏分，以及SMB分离得到的出口E的萃取液、出口R的萃余液经过蒸馏回收乙醇后，酸化为中性至弱酸性，分出上层得到EPA和DHA。

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