CN111358938A - 人干扰素-ε与干扰素-γ组合药及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了干扰素‑ε与干扰素‑γ组合药及用途，组合药协同在肿瘤治疗中的应用，对于单独地施用干扰素‑ε或干扰素‑γ，将干扰素‑ε与干扰素‑γ联合用药，可明显地抑制黑色素瘤SK‑MEL 103细胞和子宫颈癌HeLa S3细胞的增殖，因此在干扰素‑ε与干扰素‑γ联合用药在肿瘤治疗方面具有良好的应用前景，为重组人干扰素‑ε和干扰素‑γ在黑色素肿瘤和子宫颈癌的抗癌效应提供理论依据，同时也为实体肿瘤尤其是黑色素瘤和子宫颈癌的治疗提供一种新的思路和治疗手段。

Description

人干扰素-ε与干扰素-γ组合药及用途

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗技术领域，具体而言，涉及人干扰素-ε与干扰素-γ组合药及用途。

背景技术

当前，恶性肿瘤(癌症)已经成为严重威胁全球人群健康的主要公共卫生问题之一，根据最新的世界卫生组织(World Health Organization；WHO)国际癌症研究机构(IARC)的统计数据显示，全世界罹患癌症的人数在“迅速增长”，仅2018年一年就新增1810万病例，死亡人数高达960万。到本世纪末，癌症将可能成为全球头号“杀手”。癌症仍是中国目前致死率最高的疾病之一。根据国家癌症中心发布的最新癌症数据，2015年中国恶性肿瘤发病约392.9万例，发病率为285.8/10万；死亡人数233.8万人，平均每分钟有7.5人被确诊为癌症。在过去的十余年里，我国癌症生存率呈逐渐上升趋势，目前癌症5年相对生存率约为40.5％。但与欧美发达国家相比还有很大差距。

黑色素瘤是世界上最具侵略性的皮肤癌，它是由黑色素基因突变引起的常见皮肤癌之一，可出现在人体的许多部位，如皮肤，眼睛，内耳，头颈。据统计，每2分钟约有一个人被诊断出患有黑色素瘤，每10分钟就有1人死于这种疾病。黑色素瘤在皮肤癌中具有极高的死亡率，是因为它更可能扩散到人体的其他部位，而普通的手术和化学疗法无助于提供帮助。尽管目前已经开发了许多药物和治疗方法，但是它们的功效，高成本和令人不快的副作用仍然是治疗黑素瘤的主要挑战。因此黑色素瘤仍然是人类主要的疾病负担之一。

宫颈癌是占女性中发生率和死亡率第二的癌症，2018年估计有570,000例新病例，占所有女性癌症的6.6％。宫颈癌死亡的大约90％发生在低收入和中等收入国家。尽管当前已经有疫苗可以预防常见的致癌类型的人乳头瘤病毒，并且可以大大降低患子宫颈癌的风险。但是对于已患宫颈癌的患者来说，治疗仍然是宫颈癌患者女性的一重要负担，因此，新的药物和治疗方案仍需不断的开发和完善。

干扰素是最早投放市场的基因药物，自1989年以来已经获得广泛的使用。国际上批准的治疗适应症约有数十种，自投入市场以来已经成为抗癌症和抗病毒最为广泛的药物之一，取得了巨大的社会效益和经济效益。干扰素是一种具有多种生物学活性的低相对分子质量糖蛋白，具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫活动及抑制细胞增殖等多种生物学功能，这些功能构成了动物机体内抵抗病原体的第一道防线。因此，干扰素已被广泛地用于各种疾病的治疗。根据干扰素的结构、理化性质、生物学性质(包括所在基因位置和与之结合的受体信号转导方式等)将干扰素分为两类：I型和II型干扰素。干扰素-ε(Interferonepsilon) 是干扰素家族中较晚发现的成员，属于I型干扰素。虽然干扰素-ε与其他成员有一些共有的生物学作用，但又有着自身的特点。目前已经尝试用于病毒感染性疾病如尖锐湿疣、乙型肝炎、丙型肝炎等的治疗，

由于干扰素-ε发现较晚，对它的研究远不如其他同型的干扰素。在α、β等干扰素被广泛应用于临床治疗的情况下，对干扰素-ε的研究还停留在基础研究阶段，关于它的作用与机制目前还尚不完全明确。因此，探索干扰素-ε和干扰素-γ(Interferon gamma)组合药在抗肿瘤应用领域是具有重要临床意义的，特别是以黑色素瘤和宫颈癌为代表的恶性上皮肿瘤。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于治疗肿瘤的组合药，包括人干扰素-ε与人干扰素-γ。

本发明的另外一个目的为提供上述组合物的应用，组合药用于制备治疗肿瘤的药物的应用，为制备诱导先天免疫应答的激活剂的应用。

作为进一步改进，所述诱导先天免疫应答的激活剂包括用于激活I型和II 型干扰素信号传导途径。

作为进一步改进，用于制备治疗肿瘤的药物的应用，用于制备治疗肿瘤的药物的应用，为制备OAS2、OAS1、OAS3、IFI44L、IFI44、IFI3、IFI27、IFI6、 IFIT1、IFIT5、IFIH1、IFITM1、DHX58、DDX60、IRF9、EPSTI1、ISG15、 HELZ2、HERC6、STAT1、RP11-572P18.1、RP11-468E2.4、PARP9、PARP12、 PARP14、SAMD9L、XAGE1E、EPSTI1、HELZ2、CMPK2、USP18、REC8、SAMHD1、PLSCR1中一种或者多种的基因表达的激活剂的应用；

或/和为制备TXNDC5、AC016739.2、RPL5P34、UBE2Q2P6中一种或者多种的基因表达的拮抗剂的应用。

作为进一步改进，作为上皮肿瘤治疗药物中的IFI27、IFI44L、IFI6、OAS2、 IFI44、ISG15、SAMD9L、OAS1、OAS3、PLSCR1、PARP9、DDX60、HERC6、 IFIT1中一种或者多种的基因表达的激活剂的应用。

作为本发明的一种应用方式，所述肿瘤为上皮细胞肿瘤。

作为本发明的一种应用方式，所述上皮细胞肿瘤包括黑色素瘤和子宫颈癌。

作为本发明的一种应用方式，干扰素-ε与干扰素-γ联合在制备用于抑制黑色素瘤和宫颈癌细胞增殖的抑制剂中的应用。

作为本发明的一种应用方式，干扰素-ε与干扰素-γ联合在制备用于促进黑色素瘤和宫颈癌细胞凋亡的促进剂中的应用。

作为本发明的一种应用方式，干扰素-ε与干扰素-γ联合在制备用于促进黑色素瘤和宫颈癌细胞核碎裂，形成凋亡小体的促进剂中的应用。

作为本发明的一种应用方式，在治疗黑色素瘤时，干扰素-ε有效剂量为 100-1000ng/ml，干扰素-γ有效剂量为200-800ng/ml；在治疗宫颈癌时，干扰素-ε有效剂量为100-1000ng/ml，干扰素-γ有效剂量为10-100ng/ml。

作为本发明的一种应用方式，在治疗黑色素瘤时，干扰素-ε有效剂量为 500-1000ng/ml，干扰素-γ有效剂量为200-800ng/ml；在治疗宫颈癌时，干扰素-ε有效剂量为500-1000ng/ml，干扰素-γ有效剂量为10-100ng/ml。

作为本发明的一种应用方式，在治疗黑色素瘤时，干扰素-ε和干扰素-γ有效剂量分别为800ng/ml、500ng/ml；在治疗宫颈癌时，干扰素-ε和干扰素-γ有效剂量分别为800ng/ml、20ng/ml。

本发明具有如下优点：本发明提供了干扰素-ε和干扰素-γ联合在肿瘤治疗中的应用，由于干扰素-ε在上皮细胞和粘膜组织的表达特性，并且在和干扰素-γ的协同作用下治疗上皮细胞癌有显著的效果，特别是黑色素瘤和宫颈癌。另外干扰素-ε通过调控I型和II型干扰素信号传导途径，促进肿瘤免疫应答来用于抗肿瘤治疗，并且富集调控干扰素-γ相关的信号通路，起到多向调控的效果。干扰素-ε和和干扰素-γ联合作用下可显著的抑制SK-MEL 103黑色素瘤细胞和HeLa S3宫颈癌细胞的增殖及改变肿瘤细胞的形态。因此，本发明提供了干扰素 -ε和干扰素-γ联合组合药物在肿瘤治疗中的应用，联合用药的抗肿瘤的效果好于单独地施用干扰素-ε或干扰素-γ的效果，为干扰素-ε在肿瘤尤其是以黑色素瘤和宫颈癌的实体瘤治疗的抗癌效应提供了一定的理论基础，同时也为肿瘤治疗尤其是以黑色素瘤和宫颈癌为代表的实体瘤治疗提供了一种新的思路和治疗手段。

附图说明

图1图1a不同浓度梯度干扰素-ε对黑色素瘤细胞增殖的影响；图1b为干扰素 -ε不同处理时间对对黑色素瘤细胞增殖的影响；图1c为对照组和干扰素-ε联合干扰素-γ组对黑色素瘤细胞的增殖影响结果；图1d为干扰素-ε联合干扰素-γ对黑色素瘤细胞的形态变化图，用800ng/ml的干扰素-ε处理48小时后，通过设置200X放大率的倒置显微镜对细胞成像，图1e为干扰素-ε联合干扰素-γ不同处理时间对黑色素瘤细胞增殖的影响；

图2图2a为不同浓度梯度干扰素-ε对宫颈癌细胞增殖的影响；图2b为干扰素 -ε不同处理时间对对宫颈癌细胞增殖的影响；图2c为对照组和干扰素-ε联合干扰素-γ组对HeLa S3宫颈癌细胞的增殖影响结果；图2d为干扰素-ε联合干扰素 -γ对HeLa S3宫颈癌细胞的形态变化图，用800ng/ml的干扰素-ε处理48小时后，通过设置在200X放大率的反相显微镜对细胞成像，图2e为干扰素-ε联合干扰素-γ不同处理时间对HeLa S3宫颈癌细胞增殖的影响；

图3归一化的箱形图，RNA序列中读取计数的分布，纵坐标表示log₂(归一化或非归一化计数)，x轴表示各组，对照组(MC1，MC2，MC3)和治疗组(MT1，MT2，MT3)；(图3A)非标准化读取计数的分布，(图3B)标准化读取计数的分布；

图4为实施例3差异表达基因的火山图，横坐标表示log2(倍数变化)值，纵坐标表示log₁₀(P_adj)的平均表达值；

图5为实施例3差异表达基因的功能性分析，其中前面7条是富集的分子功能项(p＜0.05)，而后面17条是富集的生物过程；

图6为实施例3Reactome途径的富集分析；

图7为实施例4差异表达基因的火山图，横坐标表示log2(倍数变化)值，纵坐标表示log10(Padj)的平均表达值；

图8实施例4差异表达基因的功能性分析，其中前面2条是富集的分子功能项 (p＜0.05)，而后面6条是富集的生物过程；

图9实施例4Reactome途径的富集分析。

具体实施方式

下面将结合实施例和效果例对本发明做进一步的详述，而非限制本发明的范围，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本发明实施例的干扰素-ε在肿瘤治疗中的应用进行具体说明。

细胞系和主要试剂：

黑色素瘤细胞系(SK-MEL 103)使用DMEM培养液(含5％胎牛血清)在 37℃、5％CO2孵箱内培养，和子宫颈癌细胞系(HeLa S3)使用DMEM培养液 (含10％胎牛血清)在37℃、5％CO₂孵箱内培养。重组人干扰素-ε(purity＞90％) 和重组人干扰素-γ(purity＞97％))购于北美的Bio-Techno公司，并根据制造商的说明书用无菌水将干扰素-ε制成250μg/mL制剂备用，将和重组人干扰素-γ制成200ng/ml备用。

实施例1对照组和干扰素-ε联合干扰素-γ组对SK-MEL 103黑色素瘤细胞增殖的影响

WST法检测细胞增殖

为了优化干扰素-ε最佳剂量，使用WST-1细胞增殖和细胞毒性测定试剂盒(Beyotime，上海)来评估细胞活力。将SK-MEL 103细胞以每孔2×10³个细胞的密度接种到96孔细胞板中直至完全附着，然后用0至1000ng/ml浓度梯度的干扰素-ε处理细胞24小时，加入等体积的无菌水作为对照组(既control组)。向每个孔中加入10μl WST-1混合溶液，并在37℃的培养箱中培养4小时，并通过酶标仪(Biotek，美国)来检测450nm的吸光度(OD)值。绘制曲线图表示细胞活力情况。在细胞活力测试中，每组3孔，重复5次，结果以(平均值±标准误)表示。

图1a结果显示：用干扰素-ε(0-1000ng/ml)梯度处理SK-MEL 103黑色素瘤细胞24小时，暴露出干扰素-ε对黑素瘤细胞的最佳剂量(800ng/ml)，例如，与对照组相比，被800ng/ml的干扰素-ε刺激24小时后导致细胞活力降低了7％ (P＜0.05)。

为了进一步研究干扰素-ε在不同处理时间点对黑素瘤细胞的影响，分别用800ng/ml干扰素-ε处理了黑色素瘤细胞24小时，48小时，72小时和96小时。图1b的数据表明：与对照组相比，干扰素-ε在48小时后对黑素瘤细胞的活力表现出最显着的抑制作用，被处理48小时后的细胞活力降低了约10％ (P＜0.0001)。综上所述，干扰素-ε可以抑制黑素瘤细胞系的增殖，且48小时的处理时间效果较为理想。

将SK-MEL 103细胞以每孔2×10³个细胞的密度接种到96孔细胞板中直至完全附着，然后加入800ng/ml的干扰素-ε和500ng/ml的干扰素-γ处理细胞 48小时，加入等体积的无菌水作为对照组1(既control组)、加入800ng/ml 的干扰素-ε和500ng/ml无菌水为对照组2、加入500ng/ml的干扰素-γ和800ng /ml无菌水为对照组3。之后使用WST-1细胞增殖和细胞毒性测定试剂盒 (Beyotime，上海)来评估细胞活力。向每个孔中加入10μl WST-1混合溶液，并在37℃的培养箱中培养4小时，并通过酶标仪(Biotek，美国)来检测450nm 的吸光度(OD)值。绘制曲线图表示细胞活力情况。在细胞活力测试中，每组 3复孔，并重复5次，结果以(平均值±标准误)表示。

图1c结果显示：与对照组相比，用干扰素-ε(800ng/ml)单独处理SK-MEL 103 细胞时的细胞活力为90.6％(P＜0.0005)；用干扰素-γ(500ng/ml)单独处理 SK-MEL 103细胞时的细胞活力为74.1％(P＜0.0001)。然而当用800ng/ml的干扰素-ε和500ng/ml的干扰素-γ同时处理SK-MEL 103细胞时导致细胞活力为 64％(P＜0.0001)。与干扰素-ε(800ng/ml)单独处理时减少了26.6％，与干扰素-γ (500ng/ml)单独处理时减少了10.1％.同时图1d结果显示：在相同视野下，对照组1的细胞密度远高于实验组。同时图1e结果显示：与对照组相比，用800ng /ml的干扰素-ε和500ng/ml的干扰素-γ同时处理SK-MEL 103细胞24小时导致细胞活性丢失22.7％；处理时间为48小时细胞活力丢失36％；当处理时间为 72小时时，细胞活力丢失66.1％；当处理时间延长至96小时时，细胞活力丢失了75％。由此可见，干扰素-ε和干扰素-γ联合对SK-MEL 103黑色素瘤细胞有显著抑制作用，并且抑制率随处理时间延长而提高。

由此可见，相较于单独使用干扰素-ε的情况，将干扰素-ε与干扰素-γ联合使用其对SK-MEL 103细胞增殖的抑制效果更好，干扰素-γ能够促进干扰素-ε对 SK-MEL 103黑色素瘤细胞的抑制作用。

实施例2对照组和干扰素-ε联合干扰素-γ组对HeLa S3宫颈癌细胞增殖的影响

WST法检测细胞增殖

为了确定干扰素-ε对HeLa S3细胞作用的最佳剂量，使用WST-1细胞增殖和细胞毒性测定试剂盒(Beyotime，上海)来评估细胞活力。将HeLa S3细胞以每孔2×10³个细胞的密度接种到96孔细胞板中直至完全附着，然后用0至1000 ng/ml浓度梯度的干扰素-ε处理细胞24小时，加入等体积的无菌水作为对照组 (既control组)。向每个孔中加入10μl WST-1混合溶液，并在37℃的培养箱中培养4小时，并通过酶标仪(Biotek，美国)来检测450nm的吸光度(OD)值。绘制曲线图表示细胞活力情况。在细胞活力测试中，每组3孔，重复5次，结果以(平均值±标准误)表示。

图2a结果表明：当用800ng/ml的干扰素-ε处理细胞24小时，细胞活力损失最低为4％，尽管与对照组相比，细胞活力没有明显影响(P＞0.05)。

为了进一步研究干扰素-ε在不同处理时间点对HeLa S3宫颈癌细胞的影响，用800ng/ml干扰素-ε分别处理HeLa S3细胞24小时、48小时、72小时和96 小时。图2b中的数据表明：与对照组相比，干扰素-ε(800ng/ml)处理48小时、 72小时和96小时对细胞活力有显著影响(P＜0.01)。与对照组相比，处理时间为48小时时损失了7％的细胞活力(P＜0.01)，在72小时和96小时内，它们具有相似的细胞活力丢失水平，约为10％(P＜0.0001)。因此，以上实验结果表明干扰素-ε可以抑制HeLa S3子宫颈癌细胞的增殖，且处理时间大于48小时为宜。

将HeLa S3细胞以每孔2×10³个细胞的密度接种到96孔细胞板中直至完全附着，然后加入800ng/ml的干扰素-ε和20ng/ml的干扰素-γ处理细胞48小时，加入等体积的无菌水作为对照组1(既control组)、加入800ng/ml的干扰素-ε和20ng/ml无菌水为对照组2、加入20ng/ml的干扰素-γ和800ng/ml无菌水为对照组3。之后使用WST-1细胞增殖和细胞毒性测定试剂盒(Beyotime，上海)来评估细胞活力。向每个孔中加入10μl WST-1混合溶液，并在37℃的培养箱中培养4小时，并通过酶标仪(Biotek，美国)来检测450nm的吸光度(OD) 值。绘制曲线图表示细胞活力情况。在细胞活力测试中，每组3复孔，并重复5 次，结果以(平均值±标准误)表示。

图2c结果显示：与对照组相比，用干扰素-ε(800ng/ml)单独处理HeLa S3细胞时的细胞活力为93.5％(P＜0.01)；用干扰素-γ(20ng/ml)单独处理HeLa S3 细胞时的细胞活力为88.6％(P＜0.0001)。然而当用800ng/ml的干扰素-ε和20ng /ml的干扰素-γ同时处理HeLa S3细胞时导致细胞活力降到82.9％(P＜0.0001)，与干扰素-ε(800ng/ml)单独处理时减少了10.6％，与干扰素-γ(20ng/ml)单独处理时减少了5.7％.同时图2d结果显示：在相同视野下，对照组1的细胞密度远高于实验组。同时图2e结果显示：与对照组相比，用800ng/ml的干扰素-ε和20ng/ml的干扰素-γ同时处理HeLa S3细胞24小时导致细胞活力丢失7.5％；处理时间为48小时时，细胞活力丢失17.1％；当处理时间为72小时时，细胞活力丢失近50％；当处理时间延长至96小时时，细胞活力丢失了66.2％。由此可见，干扰素-ε和干扰素-γ联合对HeLa S3宫颈癌细胞有显著抑制作用，并且抑制率随处理时间延长而提高。由此可见，相较于单独使用干扰素-ε的情况，将干扰素-ε与干扰素-γ联合使用其对HeLa S3细胞增殖的抑制效果更好，干扰素 -γ能够促进干扰素-ε对HeLa S3宫颈癌细胞的抑制作用。

实施例3干扰素-ε对黑色素瘤细胞基因表达水平的影响

黑色素瘤细胞的转录本丰度评估和差异表达分析在比较两组样品的表达谱之前，我们将所有样品归一化，结果如图3所示。归一化数据表明六个样品的归一化工作良好，并且表明数据适合于比较差异表达分析。比较对照组(MC) 和治疗组(MT)的表达谱后，当倍数变化的阀值≥2时，我们成功鉴定了由31 个上调基因和3个下调基因组成的34个差异表达基因(P＜0.05)(图4A)。如图 4B所示，当使用了更宽松的阀值(倍数变化≥1.5)，可以鉴定出68个显着差异表达的基因，包括54个上调基因和14个下调基因。我们发现通过设置两个临界阀值所生成的两组基因基本相似。因此，我们决定使用严格阀值(倍数变化≥2) 中设置的基因进行下游分析。

差异表达基因的火山图结果如图4所示，横坐标表示log₂(倍数变化)值，纵坐标表示log₁₀(P_adj)的平均表达值。34个差异表达基因具体如表1所示，干扰素-ε处理的黑色素瘤细胞中的31个上调基因中，我们发现了许多干扰素诱导的蛋白家族成员，包括OAS2，IFI44L，IFI6，IFIT1，IFI27，IRF9，IFIT3，IFI44和与先天性免疫相关的蛋白成员ISG15，PARP9和IRF7等也被显着诱导。在干扰素诱导的蛋白质中，OAS2和IFI44L表现出明显的诱导作用，变化约为16倍。OAS2 蛋白是dsRNA激活的抗病毒酶，可通过激活RNASEL介导抗病毒作用，引起细胞病毒RNA降解，从而抑制蛋白合成并终止病毒复制。除此之外，据报道它在细胞过程如增殖，分化，凋亡和基因调控中起关键作用。OAS2的有效诱导可能揭示干扰素-ε在抑制癌细胞增殖中的潜在功能。另一个基因表达明显上调的是 XAGE1E，倍数变化约为10.24倍。该基因是XAGE家族的成员，在多种肿瘤例如乳腺癌，前列腺癌和许多类型的肺癌中高表达，包括鳞状细胞癌，小细胞癌，非小细胞癌和腺癌等。其他XAGE成员(如XAGE3)可能在抑制癌细胞生长中起作用。因此，用干扰素-ε治疗黑色素瘤细胞后，XAGE1E基因表达明显上调，为癌症治疗提供了可能的候选药物或药物靶点。

表1

功能富集分析为了更好地了解差异表达基因的功能，我们使用了Gene Ontology(GO)网站上的PANTHER分类系统进行功能富集分析。我们的结果表明，与对照样品相比，干扰素-ε处理的黑色素瘤样品中的GO分子功能和GO生物学进展显著富集，如图5所示。对于生物学过程，最重要的术语是I型干扰素信号传导途径，分配了41％的基因。干扰素-γ介导的信号通路和病毒基因组复制的负调控，也得到了显着富集，分别占24％，21％和17％。此外，有10％的基因分配给先天免疫应答和其他I型或II型信号通路(图5)。前五个最重要的基因与先天性抗病毒反应以及增殖，分化和基因调控最相关，这证明它们参与了介导肿瘤宿主免疫应答的多种机制。特别是，大多数与I型信号通路相关的基因，例如 OAS2，ISG15，STAT1，IFI6，IRF9等，都参与介导癌症免疫应答的机制。这些结果表明，干扰素-ε通过诱导先天免疫对黑素瘤细胞产生作用，包括I型和II型干扰素信号传导途径。对于分子功能，差异表达基因主要分配给结合和酶活性(图 5)。最上面代表的是碳水化合物衍生物结合，核苷酸结合，嘌呤核糖核苷三磷酸结合和双链RNA结合，分别占38％，38％，34％和21％。最上面代表的基因包括RNA解旋酶活性，NAD+ADP-核糖基转移酶活性和2′-5′-寡腺苷酸合成酶活性分别映射为14％，10％和10％。

为了进一步确定差异表达基因参与的途径，通过PANTHER分类系统(GENE ONTOLY)和Reactome途径注释对差异表达基因进行了分析。我们的分析表明，差异表达的基因(41％)大部分富含干扰素α/B信号传导，其次是II型信号传导， DDX85/IFIH1介导的干扰素α/β诱导作用以及ISG15抗病毒机制(图6)。激活的干扰素信号传导可通过激活免疫反应的JAK-STAT途径发挥重要的抗癌作用。因此，该途径分析表明，干扰素-ε通过激活I型或/和II型干扰素信号传导途径来调节免疫反应而杀死癌细胞。

实施例4干扰素-ε对宫颈癌瘤细胞基因表达水平的影响

宫颈癌细胞的转录本丰度评估和差异表达分析在比较两组样品的表达谱之前，我们将所有样品归一化，结果如图3所示。归一化数据表明六个样品的归一化工作良好，并且表明数据适合于比较差异表达分析。比较对照组(HC)和实验组(HT)的表达谱后，当倍数变化的阀值≥2时，我们成功鉴定了由17个上调基因和1个下调基因组成的18个差异表达基因(P＜0.05)。

差异表达基因的火山图结果如图7所示，横坐标表示log₂(倍数变化)值，纵坐标表示log₁₀(P_adj)的平均表达值。

18个差异表达基因具体如表2所示，在干扰素-ε处理的宫颈癌细胞中的17 个上调基因中，我们发现了许多干扰素诱导的蛋白家族成员，包括OAS2，IFI27， IFI44L，IFI6，IFI27，IFIT3，IFIT5，IFITM1，IFI44和与先天性免疫相关的蛋白成员 ISG15和PARP9等被显着诱导。在干扰素诱导的蛋白质中，IFI27和IFI44L表现出明显的诱导作用，倍数变化约为11.14-18倍。IFI27是I型干扰素的诱导蛋白，能够激活干扰素相关的通路来抑制癌细胞的增殖。此外，还显著诱导了 ISG15，SAMD9L，PLSCR1，PARP9，DDX60，HERC6等细胞因子和酶。这些细胞因子参与DNA损伤修复，先天免疫应答，介导生长因子信号传导的下调以及细胞因子调节的细胞增殖和分化。同时，TXNDC5基因可以促进癌症的生长和细胞增殖。在干扰素-ε处理的宫颈癌细胞中，TXNDC5基因表达明显被下调，表明干扰素-ε通过下调TXNDC5基因表达来抑制癌症细胞的生长和增殖。

表2

功能富集分析是为了更好地了解差异表达基因的功能，我们使用了GeneOntology(GO)网站上的PANTHER分类系统进行功能富集分析。我们的结果表明，与对照样品相比，干扰素-ε处理的宫颈癌样品中的GO分子功能和GO生物学过程显著富集，如图8所示。对于生物学过程，最重要的术语是病毒防御反应，分配了76％的基因。I型干扰素-γ介导的信号通路和病毒基因组复制的负调控，也得到了显着富集，分别占47％和41％。此外，有18％的基因分配给II型信号通路(图8)。前五个最重要的基因与先天性抗病毒反应以及增殖，分化和基因调控最相关，这证明它们参与了介导肿瘤宿主免疫应答的多种机制。特别是，与I 型和II型干扰素信号通路相关的基因，例如OAS2，ISG15，IFI6等，都参与介导癌症免疫应答的机制。这些结果表明，干扰素-ε通过诱导先天免疫对宫颈癌细胞产生作用，包括I型和II型干扰素信号传导途径。

为了进一步确定差异表达基因参与的途径，通过PANTHER分类系统 (GENEONTOLY)和Reactome途径注释对差异表达基因进行了分析。我们选择富集最多的两个途径来分析，分析表明，差异表达的基因(47％)大部分富含干扰素α/β信号传导，其次是II型信号传导(18％)(图9)。激活的干扰素信号传导可通过激活免疫反应的JAK-STAT途径发挥重要的抗癌作用。因此，该途径分析表明，干扰素-ε通过激活I型或/和II型干扰素信号传导途径来调节免疫反应而杀死癌细胞。

通过实施例3和实施例4，干扰素-ε作用黑色素瘤细胞和宫颈癌瘤细胞的调节基因对比后，两者具有14个相同的调节基因，如表3所示，进一步揭示了14个相同的调节基因通过诱导先天免疫应答作用于上皮肿瘤细胞。

表3

结论

从分子水平上来说干扰素-ε通过激活干扰素-γ调控肿瘤信号传导途径来调节免疫反应而杀死癌细胞，特别是上皮肿瘤细胞。干扰素-γ信号传导可诱导肿瘤缺血和体内稳态程序，从而导致肿瘤清除。干扰素-ε导致干扰素-γ信号转导上调并进而清除肿瘤细胞，两者之间具有协同作用。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种用于治疗肿瘤的组合药，其特征在于，包括人干扰素-ε与人干扰素-γ。

2.权利要求1所述组合药的应用，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的药物的应用，为制备诱导先天免疫应答的激活剂的应用。

3.权利要求2所述组合药的应用，其特征在于，所述诱导先天免疫应答的激活剂包括用于激活I型和II型干扰素信号传导途径。

4.权利要求2所述组合药的应用，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的药物的应用，为制备OAS2、OAS1、OAS3、IFI44L、IFI44、IFI3、IFI27、IFI6、IFIT1、IFIT5、IFIH1、IFITM1、DHX58、DDX60、IRF9、EPSTI1、ISG15、HELZ2、HERC6、STAT1、RP11-572P18.1、RP11-468E2.4、PARP9、PARP12、PARP14、SAMD9L、XAGE1E、EPSTI1、HELZ2、CMPK2、USP18、REC8、SAMHD1、PLSCR1中一种或者多种的基因表达的激活剂的应用；

或/和为制备TXNDC5、AC016739.2、RPL5P34、UBE2Q2P6中一种或者多种的基因表达的拮抗剂的应用。

5.权利要求4所述组合药的应用，其特征在于，作为上皮肿瘤治疗药物中的IFI27、IFI44L、IFI6、OAS2、IFI44、ISG15、SAMD9L、OAS1、OAS3、PLSCR1、PARP9、DDX60、HERC6、IFIT1中一种或者多种的基因表达的激活剂的应用。

6.权利要求1所述组合药的应用，其特征在于，所述肿瘤为上皮细胞肿瘤。

7.权利要求6所述组合药的应用，其特征在于，所述上皮细胞肿瘤包括黑色素瘤和子宫颈癌。

8.权利要求7所述组合药的应用，其特征在于，干扰素-ε与干扰素-γ联合在制备用于抑制黑色素瘤和宫颈癌细胞增殖的抑制剂中的应用。

9.权利要求7所述组合药的应用，其特征在于，干扰素-ε与干扰素-γ联合在制备用于促进黑色素瘤和宫颈癌细胞核碎裂，形成凋亡小体的促进剂中的应用。

10.权利要求1所述组合药的应用，其特征在于，在治疗黑色素瘤时，干扰素-ε有效剂量为100-1000ng/ml，干扰素-γ有效剂量为200-800ng/ml；在治疗宫颈癌时，干扰素-ε有效剂量为100-1000ng/ml，干扰素-γ有效剂量为10-100ng/ml。

11.权利要求10所述组合药的应用，其特征在于，在治疗黑色素瘤时，干扰素-ε有效剂量为500-1000ng/ml，干扰素-γ有效剂量为200-800ng/ml；在治疗宫颈癌时，干扰素-ε有效剂量为500-1000ng/ml，干扰素-γ有效剂量为10-100ng/ml。

12.权利要求11所述组合药的应用，其特征在于，在治疗黑色素瘤时，干扰素-ε和干扰素-γ有效剂量分别为800ng/ml、500ng/ml；在治疗宫颈癌时，干扰素-ε和干扰素-γ有效剂量分别为800ng/ml、20ng/ml。

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