CN111349577A - 一种氨氧化细菌的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种氨氧化细菌的培养方法，首先确定培养体系DO浓度的上限值DOmax以及相应的曝气量；接种微生物后，确定微生物的最佳生长状态期，并通过微生物浓度来调控最佳生长状态期的溶解氧浓度不低于5%DOmax；当DO上升到30%‑70%DOmax，则启动补料系统，当DO下降10‑50个百分点时停止补料；如此循环，直至培养结束。本发明所获得的氨氧化细菌活性高，可以实现快速生长繁殖，解决工业应用所需菌源生长缓慢的难题。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种氨氧化细菌的培养方法。
背景技术
硝化细菌作为脱除氨氮污染物的主要功能微生物，属于化能自养型，包括氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌两类。其中氨氧化细菌负责把氨氧化成亚硝酸盐，亚硝酸盐氧化细菌负责把亚硝酸盐进一步氧化成硝酸盐。硝化细菌生长缓慢，世代时间长，增值速度慢，不容易快速培养，在工业上大规模应用存在难度。特别是随着一些短程硝化反硝化和短程硝化厌氧氨氧化等新型生物脱氮工艺的开发，如何实现将氨的氧化过程控制在亚硝酸阶段至关重要，氨氧化细菌的快速培养繁殖将是解决这一问题的途径之一。
氨氧化细菌属于化能自养细菌，需要从氨的氧化中获得能量和还原力，同化CO2合成细胞物质。获得能量的主要途径是将羟胺释放的电子通过呼吸链传递给末端氧化酶，最终交给氧；并在电子传递过程中实现氧化磷酸化，合成ATP。然而氨氧化细菌将氨氧化为亚硝酸盐的过程需要多种酶的共同参与，包括氨单加氧酶（AMO）和羟胺氧还酶（HAO），其中的氨单加氧酶也需要电子，用于启动氨氧化反应。因此在氨单加氧酶与末端氧化酶之间，存在电子流的分配问题。供氧充分，可强化末端氧化酶的功能，使电子流偏向末端氧化酶，导致氨单加氧酶处于电子饥饿状态，不能正常启动氨氧化；供氧不足，则会造成氨单加氧酶与末端氧化酶都缺少电子受体，代谢活动也不能正常进行。因此，对于好氧的氨氧化细菌来说，如何对培养过程中供氧方式进行调控，对于菌体生长及其氨氧化效果都有重要影响。
郑鹏生等（处理高氨氮废水亚硝化细菌培养实验研究，水处理技术，2018vol.44No4.）为培养适应高氨氮废水短程硝化要求的亚硝化细菌，采用选择性传代培养及序批式定向培养对亚硝化细菌富集过程及影响因素进行研究，结果显示：经过5 批次传代培养，第5批次培养到第10天，NH4 +-N全部去除，NO2 --N累积率达到93%；再经过22d的连续培养，基质氨氮浓度从200mg/L提高到550mg/L，亚硝化细菌浓度达到2.4×109 CFU/mL，氨氧化速率达到21.8 mg/(L·h)，亚硝酸氮累积率≥96.0%。该方法在溶解氧浓度ρ(DO)=(1.2±0.2)mg/L 的条件下，通过逐渐提高初始氨氮浓度，实现亚硝化细菌对高氨氮水质环境的适应，但是培养过程时间较长。
杨延芳等（溶解氧在发酵过程中的作用及自控方法，黑龙江医药，1999，vol.12No4.）提出了一种青霉素发酵过程中的溶解氧控制方法，主要是在罐压，搅拌，空气流速等不可改变的情况下，在高于青霉素发酵所需临界氧浓度限值条件下，通过改变空气流量实现了发酵过程中溶解氧的自动控制。该方法同现有技术一样，都是通过调节供气量大小将反应系统内的溶解氧浓度维持在一定范围内，目的是为微生物生长提供一个相对稳定的供氧环境，并没有考虑微生物自身的生长状态。
CN201510802658.9公开了一种亚硝酸细菌富集培养方法，首先选择富含硝化细菌的活性污泥，采取逐级提高基质氨氮浓度的方式进行培养，并补加亚硝酸细菌生长促进剂；所述的亚硝酸细菌生长促进剂包括金属盐、多胺类物质、有机酸羟胺和Na2SO3，当氨氮去除率达85%，亚硝酸率达80%以上时结束富集培养过程。该方法组合物成分较多，而且含有金属盐，长期使用会有二次污染。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种氨氧化细菌的培养方法。本发明通过调控微生物的浓度和溶解氧变化，并依靠溶解氧变化幅度进行自动补料控制，所获得的氨氧化细菌活性高，可以实现快速生长繁殖，解决工业应用所需菌源生长缓慢的难题。
本发明提供的氨氧化细菌的培养方法，包括如下内容：
（1）在曝气反应器内加入培养液，在不接种氨氧化细菌的情况下调整曝气量进行曝气，直到DO浓度不再增加，由此确定培养体系DO浓度的上限值DOmax以及相应的曝气量；
（2）接种微生物后，确定微生物的最佳生长状态期，并通过微生物浓度来调控最佳生长状态期的溶解氧浓度不低于5%DOmax；
（3）在培养过程中，当DO上升到30%-70%DOmax，则启动补料系统，当DO下降10-50个百分点时停止补料；如此循环，直至培养结束。
本发明中，步骤（1）所述的曝气反应器为设有曝气、自动补料系统、溶解氧监测及搅拌功能的反应器。所述培养液为主要含有氨氮的培养液，其中氨氮浓度为50-600mg/L，还可以含有微量元素等物质。对于培养体系，当调整曝气量到一定程度后，再提高曝气量DO浓度也不再增加，由此确定培养体系DO浓度的上限值DOmax以及相应的曝气量，DOmax一般为6-9mg/L。之后在整个培养过程中，维持该曝气量不变。
本发明中，步骤（2）氨氧化细菌的接种量为培养液体积的0.5%-5%。接种菌体后，随着菌体生长过程中对溶解氧的消耗，DO浓度会逐渐下降，直到DO趋于最低并稳定1-2h，这个时期为微生物的最佳生长状态期，此时DO一般在15%-25%DOmax。培养过程中根据具体情况定期排出氨氧化细菌，以控制DO浓度不低于5%DOmax。与最佳生长状态期的溶解氧浓度相比，溶解氧每降低5-10个百分点，即按培养体系内氨氧化细菌总体积的5%-10%排出菌体。
本发明中，在步骤（3）培养过程中，当DO开始呈现上升趋势，且上升到35%-50%DOmax，则启动补料系统，当DO下降10-20个百分点时停止补料；如此循环，直至培养过程结束。
本发明中，步骤（3）所述补料系统补加的基质为氨氮，如可以是硫酸铵、氯化铵等一切无机氨化合物。
本发明中，所述氨氧化细菌的培养条件为：pH值为7-9，温度为25-38℃。
本发明通过确定培养体系的DOmax以及相应的曝气量，在维持该通气量不变情况下，确定微生物的最佳生长状态期，并通过微生物浓度来调控最佳生长状态期的溶解氧浓度，当DO上升到一定程度，通过基质浓度来调控溶解氧在最适宜生长的范围，从而可以保证菌体长期处于较佳的生长状态。所获得的氨氧化细菌活性高，可以实现快速生长繁殖，解决工业应用所需菌源生长缓慢的难题。
本发明将溶解氧浓度的变化与排出部分菌体相结合来控制培养体系处于较佳的生长状态，有效促进了氨单加氧酶的活性，提高了氨氧化细菌的生长速率。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方法和效果作进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均可从生化试剂商店购买得到。
本发明实施例中，氨氮浓度采用GB7478-87《水质-铵的测定-蒸镏和滴定法》测定；硝酸盐氮浓度采用GB 7480-1987《水质 硝酸盐氮的测定 酚二磺酸分光光度法》测定；亚硝酸盐氮浓度采用GB 7493-1987《水质 亚硝酸盐氮的测定 分光光度法》测定。
本发明实施例中，氨氮去除速率是指单位时间单位体积内能够去除的氨氮量，氨氮去除速率=（进水氨氮浓度-出水氨氮浓度）/培养时间。亚硝化率是指氨氮被氧化为亚硝酸盐氮浓度占总的硝化产物浓度的百分比，亚硝化率=亚硝酸盐氮浓度/（亚硝酸盐氮浓度+硝酸盐氮浓度）×100%。
实施例1
在100L的曝气反应器内进行氨氧化细菌的培养，曝气反应器同时设有搅拌、pH和溶解氧监测、自动补料系统。培养过程中温度设定在30℃-35℃，pH设置在7.5-8.0。
（1）首先在曝气反应器内加入50L培养液，在不接种微生物的情况下打开曝气系统并调整曝气量进行曝气，直到DO浓度不再增加，由此确定培养体系DO浓度的上限值DOmax（8.8mg/L）以及相应的曝气量，并在整个培养过程中维持该通气量不变。其中微生物培养液中含有：硫酸铵50g（相当于氨氮浓度212mg/L左右）、硫酸亚铁1.5g、氯化钙0.5g、七水合硫酸镁7g、磷酸二氢钾7g。
（2）按照培养液体积的0.5%接种实验室富集培养的氨氧化细菌（亚硝化率大于80%），培养过程中系统内的溶解氧开始下降，最后DO趋于最低并在2h内稳定在25%DOmax左右，氨氧化细菌进入最佳活性生长状态期；培养过程中溶解氧每降低5个百分点，即按培养体系内氨氧化细菌总体积的5%排出菌体，以控制DO浓度不低于5%DOmax。
（3）在氨氧化细菌培养过程中，当DO上升到40%DOmax时启动补料系统补加基质氨氮；随着基质的补加系统内溶解氧浓度又开始呈现下降趋势，当DO降至30%DOmax则停止补料；如此循环，直至培养体系达反应器总体积的80%时，关掉自动补料系统，待培养液中氨氮浓度耗尽，结束本批次的培养，停止曝气和搅拌，沉降后排出上清液，收获菌体。
经过上述培养，所收获的氨氧化细菌氨氮去除速率由接种时的10mg/(L·h)提高到70mg/(L·h)，同时亚硝化率大于80%。
实施例2
在100L的曝气反应器内进行氨氧化细菌的培养，曝气反应器同时设有搅拌、pH和溶解氧监测、自动补料系统。培养过程中温度设定在30℃-35℃，pH设置在7.8-8.2。
（1）首先在曝气反应器内加入50L培养液，在不接种微生物的情况下打开曝气系统并调整曝气量进行曝气，直到DO浓度不再增加，由此确定培养体系DO浓度的上限值DOmax（8.5mg/L），以及相应的曝气量，并在整个培养过程中维持该通气量不变。其中微生物培养液中含有：硫酸铵120g（相当于氨氮浓度500mg/L左右）、硫酸亚铁1.5g、氯化钙0.5g、七水合硫酸镁7g、磷酸二氢钾7g。
（2）按照培养液体积的5%接种实验室富集培养的氨氧化细菌（亚硝化率大于80%），培养过程中系统内的溶解氧开始下降，最后DO趋于最低并在2h内稳定在15%DOmax左右，氨氧化细菌进入最佳活性生长状态期；培养过程中溶解氧每降低10个百分点，即按培养体系内氨氧化细菌总体积的10%排出菌体，以控制DO浓度不低于5%DOmax。
（3）在氨氧化细菌培养过程中，当DO上升到50%DOmax时启动补料系统补加基质氨氮；随着基质的补加系统内溶解氧浓度又开始呈现下降趋势，当DO降至30%DOmax则停止补料；如此循环，直至培养体系达反应器总体积的80%时，关掉自动补料系统，待培养液中氨氮浓度耗尽，结束本批次的培养，停止曝气和搅拌，沉降后排出上清液，收获菌体。
经过上述培养，所收获的氨氧化细菌氨氮去除速率由接种时的10mg/(L·h)提高到70mg/(L·h)，同时亚硝化率大于80%。
实施例3
在100L的曝气反应器内进行氨氧化细菌的培养，曝气反应器同时设有搅拌、pH和溶解氧监测、自动补料系统。培养过程中温度设定在30℃-35℃，pH设置在7.8-8.2。
（1）首先在曝气反应器内加入50L培养液，在不接种微生物的情况下打开曝气系统并调整曝气量进行曝气，直到DO浓度不再增加，由此确定培养体系DO浓度的上限值DOmax（8.9mg/L）以及相应的曝气量，并在整个培养过程中维持该通气量不变。其中微生物培养液中含有：硫酸铵50g、硫酸亚铁1.5g、氯化钙0.5g、七水合硫酸镁7g、磷酸二氢钾7g。
（2）按照培养基体积的2.5%接种实验室富集培养的氨氧化细菌（亚硝化率大于80%），培养过程中系统内的溶解氧开始下降，最后DO趋于最低并在2h内稳定在20%DOmax左右，氨氧化细菌进入最佳活性生长状态期；培养过程中溶解氧每降低10个百分点，即按培养体系内氨氧化细菌总体积的10%排出菌体，以控制DO浓度不低于5%DOmax。
（3）在氨氧化细菌培养过程中，当DO上升到35%DOmax时启动补料系统补加基质氨氮；随着基质的补加系统内溶解氧浓度又开始呈现下降趋势，当DO降至25%DOmax则停止补料；如此循环，直至培养体系达反应器总体积的80%时，关掉自动补料系统，待培养液中氨氮浓度耗尽，结束本批次的培养，停止曝气和搅拌，沉降后排出上清液，收获菌体。
经过上述培养，所收获的氨氧化细菌氨氮去除速率由接种时的10mg/(L·h)提高到70mg/(L·h)，同时亚硝化率大于80%。
比较例1
同实施例1，不同在于：在整个培养过程中控制溶解氧浓度为1-3mg/L，等量的基质采用流加补料的方式。所收获菌体的氨氧化速率只有40mg/(L·h)，同时亚硝化率只有75%。
比较例2
同实施例1，不同在于：在整个培养过程中没有根据溶解氧的变化定期排出菌体。所收获菌体的亚硝酸率可达80%，但氨氧化速率只有55mg/(L·h)。
Claims (10)
1.一种氨氧化细菌的培养方法，其特征在于包括如下内容：
（1）在曝气反应器内加入培养液，在不接种氨氧化细菌的情况下调整曝气量进行曝气，直到DO浓度不再增加，由此确定培养体系DO浓度的上限值DOmax以及相应的曝气量；
（2）接种微生物后，确定微生物的最佳生长状态期，并通过微生物浓度来调控最佳生长状态期的溶解氧浓度不低于5%DOmax；
（3）在培养过程中，当DO上升到30%-70%DOmax，则启动补料系统，当DO下降10-50个百分点时停止补料；如此循环，直至培养结束。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述培养液为主要含有氨氮的培养液，其中氨氮浓度为50-600mg/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中DOmax为6-9mg/L，维持该DOmax对应的曝气量不变。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）氨氧化细菌的接种量为培养液体积的0.5%-5%。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）接种菌体后，随着菌体生长过程中对溶解氧的消耗，DO浓度会逐渐下降，直到DO趋于最低并稳定1-2h，这个时期为微生物的最佳生长状态期，此时DO一般在15%-25%DOmax。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）培养过程中根据具体情况定期排出氨氧化细菌，以控制DO浓度不低于5%DOmax。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于：步骤（2）溶解氧每降低5-10个百分点，即按培养体系内氨氧化细菌总体积的5%-10%排出菌体。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤（3）培养过程中，当DO开始呈现上升趋势，且上升到35%-50%DOmax，则启动补料系统，当DO下降10-20个百分点时停止补料。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）所述补料系统补加的基质为硫酸铵、氯化铵等中的至少一种。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述氨氧化细菌的培养条件为：pH值为7-9，温度为25-38℃。
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