CN111334072A - 一种高亮度、高稳定性线粒体超分辨荧光染料 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高亮度、高稳定性线粒体超分辨荧光染料，该染料为以萘酰亚胺为母体，以三苯基膦为定位基团，设计合成的一种能够对活细胞进行线粒体标记的荧光染料。通过在萘酰亚胺供电子一端引入1,2‑环己二胺，有效抑制了染料的TICT，使其亮度和稳定性有了大幅度提高，水中吸光度达到40000M‑1cm‑1，量子产率约为0.80，在其他有机溶剂中量子产率可达0.80以上。同时对溶剂极性、温度和酸碱性等环境因素的变化均不敏感。此外，相对于商业线粒体染料，该分子的细胞膜透过性更好，可以实现对活细胞线粒体快速、准确地染色，在包括超分辨在内的生物成像领域具有广泛的应用前景。

Description

一种高亮度、高稳定性线粒体超分辨荧光染料
技术领域
本发明属于荧光染料和成像领域，具体涉及一种高亮度、高稳定性线粒体超分辨荧光染料。
背景技术
线粒体是细胞内最重要的细胞器之一，对细胞的新陈代谢与衰老死亡有着重要意义，监测其动态对深刻理解复杂的生命活动非常必要。荧光显微成像因其原位无损的特点，成为研究线粒体活动的首选工具。荧光染料作为荧光显微成像与线粒体动态呈现的媒介，需要具备快速标记并在多变的生理环境中、严苛的成像条件下高亮度、长时间发光的特点。而近些年来超分辨成像技术的发展，又对荧光染料的亮度和光稳定性提出了更高要求。
目前488nm激发的线粒体探针主要为MitoTracker Green。该染料的荧光母体花菁极易被单线态氧氧化而发生光淬灭，亮度低、稳定性差，难以满足对线粒体长时间追踪的需求。透膜性不足还带来孵育时间长，成像背景高等一系列问题。因此，开发一种环境不敏感的高亮度、高光稳定性荧光成像染料对于采用超分辨显微成像技术长时间研究活细胞线粒体动态生命过程显得尤为迫切。
发明内容
本发明提供了一种高亮度、高稳定性线粒体超分辨荧光染料，解决了商用线粒体定位荧光染料亮度、稳定性不足，细胞透过性差的问题。具体结构以1,8-萘酰亚胺为基本单元，以三苯基膦为靶向基团，借助线粒体自身显负性的膜电位即可实现对线粒体的定位。通过在供电子一侧引入环己二胺提高了染料的亮度、光稳定性及细胞膜透过性，从而适用于对线粒体的超分辨显微像。
本发明所述的一种高亮度、高稳定性线粒体超分辨荧光染料，其结构式如下所示：
Figure BDA0001911521570000021
一种高亮度、高稳定性线粒体超分辨荧光染料的合成方法，合成路线如下：
Figure BDA0001911521570000022
具体合成步骤如下：
(1)中间体N-(6-羟己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺，6-胺基-1-己醇，溶于乙醇，60-80℃下1-10h，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱分离得米白色固体N-(6-羟己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐。
(2)中间体N-(6-溴己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的合成：
将N-(6-羟己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐溶于乙酸乙酯，向其中滴加三溴化磷，缓慢升温至60-90℃搅拌5-10h，反应结束后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到N-(6-溴己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐。
(3)中间体N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的合成：
将N-(6-溴己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐和三苯基膦溶于乙腈中，升温至120-140℃搅拌18-30h，反应结束后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到N-(6-三苯基膦)-己基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐。
(4)化合物Mito-DAC的合成
将N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐溶于乙二醇甲醚，向其中加入1,2-环己二胺，升温升温至110-130℃搅拌10-14h，反应结束后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到化合物Mito-DAC。
步骤(1)中：4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺与6-胺基-1-己醇的质量比为1.25-5:1；4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量与乙醇的体积比为10-20:1mg/mL。
步骤(2)中：N-(6-羟己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与三溴化磷的质量比为1:1.7-5；N-(6-羟己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与乙酸乙酯的体积比为20-30:1mg/mL。
步骤(3)中：N-(6-溴己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与三苯基膦的质量比为：1:2.7-8；N-(6-溴己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与乙腈的体积比为15-30:1mg/mL。
步骤(4)中：N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与1,2-环己二胺的质量比为：1.6-2.4:1；：N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与乙二醇甲醚的体积比为5.3-24:1。
一种高亮度、高稳定性线粒体超分辨荧光染料在荧光成像、分子探针及荧光传感领域的应用。
本发明具有以下特征：
该探针具有原料廉价易得、合成方法简单等显著优点；
该探针在水中吸光度达到40000M-1cm-1，量子产率约为0.80，在其他有机溶剂中量子产率可达0.80以上，相比于其他萘酰亚胺染料亮度明显提高；
该探针与常见商业荧光染料相比具有极高的光稳定性。体外实验中，500W钨灯照射10h以后，该探针的荧光强度仍保持在初始值的95％以上；细胞内实验中，在与商业染料Mito Tracker Red共染完成后持续共聚焦成像40分钟，荧光强度仍维持在初始值的90％，而Mito Tracker Red荧光强度降到初始值的35％。
该探针对溶剂极性、酸碱性、温度等环境因素表现出不敏感的特性，多种溶剂中最大吸收和最大荧光波长均基本不变，pH 2-12的范围内荧光强度基本不变，35-40℃的生理温度条件下，吸收和荧光强度基本不变，完全满足生理条件下对线粒体成像的需求。
附图说明
图1实施例1制备得到的Mito-DAC核磁氢谱；
图2实施例1制备得到的Mito-DAC核磁碳谱；
图3实施例1制备得到的Mito-DAC高分辨质谱；
图4实施例1制备得到的Mito-DAC在不同溶剂中的归一化荧光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为10μM；
图5实施例1制备得到的Mito-DAC在不同溶剂中的归一化紫外吸收谱图，横坐标为波长，纵坐标为吸收强度，荧光探针的浓度为10μM；
图6实施例1制备得到的Mito-DAC与常见荧光染料光稳定性测试图，横坐标为测试时间，纵坐标为荧光强度相对值，荧光探针的浓度为10μM；
图7实施例1制备得到的Mito-DAC在水中不同温度下荧光谱图。横坐标为波长，纵坐标分别为荧光强度。
图8实施例1制备得到的Mito-DAC与商业染料MitoTracker Red对活细胞染色完成后，持续实时共聚焦成像细胞内染料荧光强度随时间变化曲线。(a)、(b)、(c)为Mito-DAC不同时间点共聚焦成像图；(d)、(e)、(f)MitoTracker Red不同时间点共聚焦成像图。(g)为提取的归一化荧光强度随时间变化曲线。横坐标为时间，纵坐标为归一化荧光强度相对值。
图9实施例1中制备得到的Mito-DAC标记的C3A细胞线粒体共聚焦成像图；
图10实施例1中制备得到的Mito-DAC标记的HeLa细胞线粒体结构光照明超分辨显微成像图。
具体实施方式
本发明给出了一种高亮度、高稳定性地适用于超分辨的线粒体荧光染料的合成及其作为细胞器定位探针应用于超分辨荧光成像技术领域。
实施例1
化合物Mito-DAC的合成。
中间体N-(6-羟己基-)4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的合成。
Figure BDA0001911521570000051
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1g，3.11mmol)溶于50mL乙醇中，并向其中滴加6-氨基-1-己醇(364mg，3.11mmol)。70℃下1h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝2:1，V/V)分离得米白色固体620mg，产率53％。
核磁氢谱数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(d,J＝7.8Hz,1H),8.51(d,J＝7.9Hz,1H),8.22(d,J＝7.9Hz,1H),7.93(d,J＝7.8Hz,1H),4.25–4.07(m,2H),3.65(t,J＝6.5Hz,2H),1.75(dt,J＝14.4,7.0Hz,2H),1.59(dd,J＝13.2,6.5Hz,2H),1.48–1.43(m,4H).
核磁碳谱数据如下：13C NMR(101MHz,CDCl3)δ162.83,162.06,151.31,135.98,132.36,131.24,130.55,125.74,124.15,123.55,122.45,121.23,62.77,40.76,32.55,27.86,26.68,25.29.
高分辨质谱数据如下C18H18BrN2O5[M+H]+计算值：421.0399,实验值：421.0396.
经检测，上述产物结构为N-(6-羟己基-)4-溴-5-硝基-1,8-萘酐。
中间体N-(6-溴己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的合成。
Figure BDA0001911521570000061
将N-(6-羟己基-)4-溴-5-硝基-1,8-萘酐(500mg，1.19mmol)溶于二氯甲烷中，并向其中滴加三溴化磷(1.5g，7mmol)。70℃反应6h后，用饱和碳酸钠溶液洗涤有机相。所得有机相用无水硫酸钠干燥后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：石油醚＝1:1，V/V)，得白色固体230mg，产率40％。
核磁氢谱数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(d,J＝7.8Hz,1H),8.52(d,J＝7.9Hz,1H),8.22(d,J＝7.9Hz,1H),7.93(d,J＝7.8Hz,1H),4.22–4.11(m,2H),3.41(t,J＝6.8Hz,2H),1.94–1.83(m,2H),1.75(dt,J＝15.0,7.6Hz,2H),1.58–1.49(m,2H),1.44(dd,J＝14.8,5.8Hz,2H).
高分辨质谱数据如下：C18H16Br2N2O4[M+H]+计算值：481.9477,实验值：481.9482.
经检测，上述产物结构为N-(6-溴己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐。
中间体N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的合成
Figure BDA0001911521570000071
将N-(6-溴己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐(200mg，0.41mmol)与三苯基膦(1g，4.13mmol)溶于10mL无水乙腈中，并置于密封管中。140℃下反应24h后，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝400:1，V/V)，得白色固体485mg，产率60％。
核磁氢谱数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.66(d,J＝7.3Hz,1H),8.47(d,J＝8.0Hz,1H),8.20(d,J＝7.3Hz,1H),8.01–7.40(m,16H),4.11(t,J＝6.8Hz,2H),3.72(s,2H),1.80–1.33(m,8H).
核磁碳谱数据如下：13C NMR(101MHz,CDCl3)δ162.73,161.96,151.21,135.98,135.13,133.77,133.67,132.32,132.13,132.03,131.96,131.25,130.64,130.52,128.56,128.44,125.68,124.05,123.59,122.40,121.16,118.57,117.71,53.46,40.58,30.11,29.95,27.43,26.55.
高分辨质谱数据如下：C36H31N2O4P+[M]+计算值：665.1205,实验值：665.1208.
经检测，上述产物结构为N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐。
化合物Mito-DAC的合成
Figure BDA0001911521570000081
将N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐(100mg，0.13mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺(60mg，0.52mmol)。将反应液缓慢加热至120℃，并反应10h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝200:1，V/V)，得黄色固体40mg，产率89％.
核磁氢谱如图1所示，具体数据如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.04(d,J＝8.5Hz,2H),7.83(t,J＝6.8Hz,3H),7.68(dd,J＝13.9,6.4Hz,12H),6.83(d,J＝8.5Hz,2H),5.86(s,2H),4.02(t,J＝6.5Hz,2H),3.42–3.31(m,2H),3.18(d,J＝9.7Hz,2H),2.33(d,J＝12.5Hz,2H),1.80(d,J＝8.2Hz,2H),1.63(s,4H),1.48(d,J＝9.7Hz,2H).
核磁碳谱如图2所示，具体数据如下：13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.31,153.34,135.46,134.31,133.53,133.43,130.75,130.63,118.30,117.44,111.04,109.26,107.18,59.65,38.94,32.67,29.71,27.28,25.53,23.65.
高分辨质谱如图3所示，具体数据如下：C42H43N10O21P+[M]+计算值：652.3087，实验值：652.3128.
经验证，该化合物结构如Mito-DAC所示，适用于多种生理状态下的活细胞线粒体成像且光性能不受微环境影响，亮度高稳定性强可以满足超分辨成像对线粒体的长时间动态追踪，其荧光性能如下：
将该探针溶解于DMSO溶液中，配制成2mM母液，根据需要配制成不同浓度测试溶液，以检测其荧光光谱变化及细胞内线粒体荧光成像。
实施例1所得化合物Mito-DAC在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水等溶剂中的归一化紫外吸收。每次取20μL荧光染料母液，分别加入4mL正己烷、乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜，配制成10μM的荧光染料测试液，并进行紫外吸收光谱的测试，归一化紫外吸收如图4所示。
由图4可见化合物Mito-DAC在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水中的最大吸收均在475nm左右，随溶剂极性变化极小。
实施例1所得化合物Mito-DAC在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水等溶剂中的归一化荧光发射光谱。每次取20μL荧光染料母液，分别加入4mL正己烷、乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜，配制成10μM的荧光染料测试液，并进行荧光发射光谱的测试，归一化荧光发射如图5所示。
由图5可见化合物Mito-DAC在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水中最大发射波长随溶剂的极性几乎没有变化。
实施例1所得化合物Mito-DAC与MitoTracker Green、荧光素和BODIPY光稳定性对比实验。将荧光素溶于0.1mmol/L的NaOH溶液中，Mito-DAC、MitoTracker Green和BODIPY溶于Hepes缓冲液中配置成浓度为10μM的测试样品。将待测溶液置于1×1×3cm的石英比色皿中，用500W钨灯作为光源进行光照。前两个小时每隔半个小时对样品进行紫外-可见光谱测试和荧光光谱测试，此后每隔一个小时测试一次，跟踪样品荧光强度的变化情况。样品的荧光强度变化曲线如图6所示。
由图6可见，钨灯照射10h后荧光素、MitoTracker Green和BODIPY的荧光强度分别降至起始值得40％、60％和65％，而Mito-DAC的荧光强度基本保持不变，说明化合物Mito-DAC相对于常见商业染料具有更好的稳定性。
实施例1所得化合物Mito-DAC对温度的稳定性测试实验。取20μL母液置于4mL水中，每隔5度采取一个采集点，待温度稳定10min后进行荧光紫外测试，荧光和紫外随温度的变化如图7所示。
由图7可见，35-40℃中Mito-DAC的荧光强度变化幅度很小，足够满足其在生物成像中的应用。
实施例2
化合物Mito-DAC的合成
中间体N-(6-羟己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的合成。
Figure BDA0001911521570000101
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1g，3.11mmol)溶于50mL乙醇中，并向其中滴加6-氨基-1-己醇(800mg，6.84mmol)。60℃下10h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝2:1，V/V)分离得米白色固体626mg，产率48％。
中间体N-(6-溴己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的合成。
Figure BDA0001911521570000102
将N-(6-羟己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐(500mg，1.19mmol)溶于二氯甲烷中，并向其中滴加三溴化磷(850mg，298μL)。60℃回流10h后，用饱和碳酸钠溶液洗涤有机相。所得有机相用无水硫酸钠干燥后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：石油醚＝1:1，V/V)，得白色固体258mg，产率45％。
中间体N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的合成
Figure BDA0001911521570000111
将N-(6-溴己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐(200mg，0.41mmol)与三苯基膦(540mg，2.06mmol)溶于10mL无水乙腈中，并置于密封管中。120℃下反应30h后，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝400:1，V/V)，得白色固体485mg，产率60％。
化合物Mito-DAC的合成
Figure BDA0001911521570000121
将N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐(100mg，0.13mmol)溶于4mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺(63mg，0.52mmol)。将反应液缓慢加热至110℃，并反应14h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝200:1，V/V)，得黄色固体40mg，产率89％.
经检测，该化合物结构如Mito-DAC所示，其在水中荧光发射波长为482nm，吸收波长为472nm，能够特异性标记细胞内线粒体。
实施例3
化合物Mito-DAC的合成
中间体N-(6-羟己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的合成。
Figure BDA0001911521570000122
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1g，3.11mmol)溶于25mL乙醇中，并向其中滴加6-氨基-1-己醇(200mg，1.71mmol)。80℃下1h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝2:1，V/V)分离得米白色固体350mg，产率30％。
中间体N-(6-溴己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的合成。
Figure BDA0001911521570000131
将N-(6-羟己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐(500mg，1.19mmol)溶于二氯甲烷中，并向其中滴加三溴化磷(2.5g，833μL)。90℃回流5h后，用饱和碳酸钠溶液洗涤有机相。所得有机相用无水硫酸钠干燥后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：石油醚＝1:1，V/V)，得白色固体288mg，产率50％。
中间体N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的合成
Figure BDA0001911521570000132
将N-(6-溴己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐(200mg，0.41mmol)与三苯基膦(1.6g，6.61mmol)溶于15mL无水乙腈中，并置于密封管中。140℃下反应18h后，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝400:1，V/V)，得白色固体323mg，产率40％。
化合物Mito-DAC的合成
Figure BDA0001911521570000141
将N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐(100mg，0.13mmol)溶于20mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺(42mg，0.36mmol)。将反应液缓慢加热至130℃，并反应10h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝200:1，V/V)，得黄色固体25mg，产率56％。
经检测，该化合物结构如Mito-DAC所示，其在水中荧光发射波长为482nm，吸收波长为472nm，能够特异性标记细胞内线粒体。
实施例4
实施例1所得化合物Mito-DAC对活细胞染色后连续光照稳定性实验。取0.5μL母液及2μL MitoTracker Red染色液溶于1mL细胞培养液中，37℃，5％CO2下孵育10分钟对细胞进行染色。
化合物Mito-DAC与商业染料MitoTracker Red对MCF细胞染色完成后，持续实时共聚焦成像细胞内染料荧光强度随时间变化曲线如图8所示。横坐标为时间，纵坐标为归一化荧光强度相对值。由图可见，连续成像40分钟后，化合物的Mito-DAC细胞内的荧光强度仍保持在初始值的90％以上，而商业染料MitoTracker Red的亮度降至初始值的40％左右，说明该染料具有突出的光稳定性，适合于活细胞长时间动态成像。
实施例5
实施例1所得化合物Mito-DAC对活细胞染色后连续光照稳定性实验及共聚焦显微成像、结构光照明显微成像实验。取0.5μL母液溶于1mL细胞培养液中，37℃，5％CO2下孵育10分钟后分别进行荧光共聚焦成像及结构光照明显微成像。
探针分子标记的C3A线粒体共聚焦成像如图9所示，细胞内的线粒体结构清晰可见；
探针标记的HeLa细胞线粒体结构光照明超分辨显微成像如图10所示，细胞内的线粒体结构清晰可见，线粒体嵴亦可分辨。

Claims (7)

1.一种高亮度、高稳定性线粒体超分辨荧光染料，其特征在于：其结构式如下所示，
Figure FDA0001911521560000011
2.如权利要求1所述一种高亮度、高稳定性线粒体超分辨荧光染料的合成方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)中间体N-(6-羟己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺，6-胺基-1-己醇，溶于乙醇，60-80℃下1-10h，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱分离得米白色固体N-(6-羟己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐；
(2)中间体N-(6-溴己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的合成：
将N-(6-羟己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐溶于乙酸乙酯，向其中滴加三溴化磷，缓慢升温至60-90℃搅拌5-10h，反应结束后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到N-(6-溴己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐；
(3)中间体N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的合成：
将N-(6-溴己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐和三苯基膦溶于乙腈中，升温至120-140℃搅拌18-30h，反应结束后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到N-(6-三苯基膦)-己基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐；
(4)化合物Mito-DAC的合成
将N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐溶于乙二醇甲醚，向其中加入1,2-环己二胺，升温升温至110-130℃搅拌10-14h，反应结束后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到化合物Mito-DAC。
3.如权利要求2所述的一种高亮度、高稳定性线粒体超分辨荧光染料的合成方法，其特征在于：步骤(1)中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺与6-胺基-1-己醇的质量比为1.25-5:1；4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量与乙醇的体积比为10-20:1mg/mL。
4.如权利要求2所述的一种高亮度、高稳定性线粒体超分辨荧光染料的合成方法，其特征在于：步骤(2)中，N-(6-羟己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与三溴化磷的质量比为1:1.7-5；
N-(6-羟己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与乙酸乙酯的体积比为20-30:1mg/mL。
5.如权利要求2所述的一种高亮度、高稳定性线粒体超分辨荧光染料的合成方法，其特征在于：步骤(3)中，N-(6-溴己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与三苯基膦的质量比为：1:2.7-8；
N-(6-溴己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与乙腈的体积比为15-30:1mg/mL。
6.如权利要求2所述的一种高亮度、高稳定性线粒体超分辨荧光染料的合成方法，其特征在于：步骤(4)中，N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐与1,2-环己二胺的质量比为：1.6-2.4:1；
N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与乙二醇甲醚的体积比为5.3-24:1。
7.如权利要求1所述的一种高亮度、高稳定性线粒体超分辨荧光染料在荧光成像、分子探针及荧光传感领域的应用。
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