CN111333712A - 一种具有抑制肿瘤细胞增殖功能的Ku70蛋白突变体、基因及应用 - Google Patents

一种具有抑制肿瘤细胞增殖功能的Ku70蛋白突变体、基因及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有抑制肿瘤细胞增殖功能的Ku70蛋白突变体、基因及应用。所述Ku70蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明利用Ku70蛋白对肿瘤细胞增殖的影响，通过人工改造，构造了可以有效抑制肿瘤增殖的变异型Ku70蛋白Mu4。体外抗肿瘤活性检测和动物实验都表明，改造后的蛋白表现出良好的抗肿瘤增殖特性，可用于研究Ku70参与肿瘤细胞增殖的作用机理，为开发抗肿瘤药物提供理论基础和模型。在医药领域具有一定的应用前景。

Description

一种具有抑制肿瘤细胞增殖功能的Ku70蛋白突变体、基因及 应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种具有抑制肿瘤细胞增殖功能的Ku70蛋白突变体、基因及应用。
背景技术
干扰素、白介素是在临床肿瘤治疗中的常用的蛋白药物，但这些药物疗效一般只对部分病人敏感，毒副作用严重还会产生剂量依赖性。随着技术的发展，越来越多的外源性蛋白用于临床肿瘤治疗。
Ku蛋白是一类分布广泛的核蛋白，是由Ku70和Ku80两个亚基组成的异源二聚体。近年国内外研究表明Ku70与细胞周期调控，细胞分化程度，细胞核形态以及双链断裂DNA修复相关。研究发现，Ku70之所以可以催化断裂DNA修复是因为它与双链DNA断端的链接是非序列依赖性的方式，DNA依赖的蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)和与之结合的蛋白激酶全酶可以通过Ku70招募，这是Ku70较为主要的功能。除此之外，Ku70通过和促凋亡因子Bax结合可以抑制细胞的凋亡；细胞周期检查点相关蛋白Rad3/Rad26途径中Ku70发挥作用可以维持端粒的稳定性。而DNA损伤，修复缺陷和细胞周期调控的异常所导致的基因不稳定常常发生在肿瘤组织中。多项研究表明作为重要的DNA修复蛋白Ku70与多种癌症相关，在宫颈癌，乳腺癌，肺癌等肿瘤组织中，Ku70的表达显著高于正常组织。
近年来，Ku70蛋白与肿瘤发生发展的关系被高度关注，是肿瘤治疗研究中的热点。
比如，公开号为CN1873410的发明公开了一种在食管癌病人血清中检测肿瘤相关标志物的方法，以血清为分子探针，免疫沉淀肿瘤细胞中潜在的肿瘤抗原，富集的肿瘤抗原-抗体复合物经SDS-PAGE电泳分离、考马斯亮蓝染色、特异蛋白条带的酶解消化，肽段抽提，反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离和电喷雾离子化偶联在线离子阱质谱(ESI-IT-MS)鉴定等综合技术路线，筛选食管癌血清标志蛋白。筛选到的Ku70蛋白经免疫印迹实验证实为新的食管癌候选标志物，Ku70蛋白表达明显增高与早期食管癌癌变相关。
公开号为CN104211770A的发明公开了一类与热休克蛋白结合的神经胶质瘤抗原，包括Survivin-2B抗原肽、Ku70抗原肽和Ku80抗原肽。说明Ku70与神经胶质瘤相关。
如果研究人员通过分子生物学方法对Ku70蛋白进行人工改造，开发出一种可抑制肿瘤细胞增殖的外源蛋白，将具有极其重要的药用价值。
发明内容
本发明提供了一种可抑制肿瘤细胞增殖的人工改造外源蛋白，通过体外扩增得到含有该外源蛋白基因的表达载体，通过脂质体转染的方法使得肿瘤细胞表达该蛋白，从而通过细胞增殖活率检测方法来证明该外源蛋白可抑制肿瘤细胞的增殖。
一种具有抑制肿瘤细胞增殖功能的Ku70蛋白突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明又提供了所述Ku70蛋白突变体在制备抗肿瘤药物中的应用。优选的，其中肿瘤为肺癌或宫颈癌。
本发明又提供了编码所述Ku70蛋白突变体的基因。优选的，所述的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了所述基因在制备抗肿瘤药物中的应用。优选的，其中肿瘤为肺癌或宫颈癌。优选的，该应用在实施时，将所述基因导入癌细胞内表达出所述Ku70蛋白突变体。
本发明利用Ku70蛋白对肿瘤细胞增殖的影响，通过人工改造，构造了可以有效抑制肿瘤增殖的变异型Ku70蛋白Mu4。体外抗肿瘤活性检测和动物实验都表明，改造后的蛋白表现出良好的抗肿瘤增殖特性，可用于研究Ku70参与肿瘤细胞增殖的作用机理，为开发抗肿瘤药物提供理论基础和模型。在医药领域具有一定的应用前景。
附图说明
图1为pBICEP-CMV-3的质粒图谱。
图2为GV248的质粒图谱。
图3为各组细胞的OD490值比较图。各组细胞分别转染入pBICEP-CMV-Mu4与pBICEP-CMV-Ku70质粒，48小时MTT检测细胞增殖水平，PC9、H1975、ShKu70/HeLa细胞，转染不同质粒组其增殖水平有明显差异；Bel-7402、Hep-G2、HCT-116、293T细胞转染不同质粒组其增殖水平未见明显差异。
图4为Mu4蛋白对PC9、H1975、ShKu70/HeLa细胞增殖抑制率柱状图。转染48h后MTT法检测并计算转染pBICEP-CMV-Mu4组与pBICEP-CMV-Ku70组相比细胞增殖抑制程度。ShKu70/HeLa细胞抑制率最高，有55.36％，PC9与H1975细胞的抑制率分别为21.63％和33.33％。表明Mu4对细胞增殖的抑制水平可能与细胞本底的Ku70表达水平相关。
具体实施方式
实施例1：Mu4蛋白表达载体pBICEP-N-Flag-Mu4克隆构建
根据Ku70蛋白的基因全序列(NM_001288977)设计缺失突变引物，用于构建缺失C末端37个氨基酸的变异型Ku70蛋白，突变引物的序列如表1所示。
表1突变引物
Figure BDA0002418959420000031
试验室保存的pBICEP-N-Flag-Ku70质粒，该质粒是在商品化质粒pBICEP-CMV-3(购自Sigma公司)的多克隆位点MIu I与BamH I之间插入野生型的全长Ku70基因序列(质粒图谱见图1)。
以pBICEP-N-Flag-Ku70质粒为模板，通过突变PCR方法获得pBICEP-N-Flag-Mu4质粒DNA片段，所述PCR反应体系如表2所示。
表2 PCR扩增体系
模板DNA 1μl
上游引物(10μM) 1μl
下游引物(10μM) 1μl
DreamTaq PCR Master Mix(2×) 25μl
Sterile Milli-Q Water 22μl
总体积 50μl
PCR反应条件：
95℃预变性2min；
95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，共18个循环；
72℃延伸10min。
将Ku70蛋白突变所得的突变体命名为Mu4蛋白，Mu4蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示；Mu4基因序列如SEQ ID No.2所示。
将得到的pBICEP-N-Flag-Mu4质粒DNA片段转化到感受态细胞JM109中扩增，提取阳性菌落并测序验证。获得真核表达载体pBICEP-N-Flag-Mu4。
实施例2：Mu4蛋白对ShKu70/HeLa细胞增殖抑制活性检测
(1)筛选ShKu70/HeLa细胞
采用脂质体转染的方法，向HeLa细胞内转入Ku70 ShRNA质粒。Ku70ShRNA质粒购自吉凯公司，质粒图谱(GV248质粒)如图2所示，在多克隆位点内插入Ku70 ShRNA的编码序列(如SEQ ID No.5所示)。该质粒转染入细胞内，可表达出靶向Ku70mRNA的ShRNA，从而抑制Ku70的表达，降低细胞内的Ku70蛋白水平。
转染24小时后，向培养基中加入1μg/ml的嘌呤霉素，以筛选出基因组内整合有转入质粒DNA的HeLa细胞。筛选1个月后，采用有限稀释法及单克隆挑选法，获得稳定抑制内源性Ku70表达的ShKu70/HeLa细胞。
(2)脂质体转染法向ShKu70/HeLa细胞转入pBICEP-N-Flag-Mu4质粒或pBICEP-N-Flag-Ku70质粒
ShKu70/HeLa细胞以1×104个接种于96孔板内，培养至50％-60％融合时进行转染。加入转染复合物，于培养48小时后采用MTT方法检测细胞增殖活率。
其中转染复合物的制备方法为：
选取无菌1.5ml EP管2支/孔，先使用5μL Opti-MEM培养基稀释0.2μL
Figure BDA0002418959420000041
试剂，充分混匀，之后使用5μL Opti-MEM培养基稀释0.1μgpBICEP-N-Flag-Mu4质粒或pBICEP-N-Flag-Ku70质粒制备为DNA预混液，然后添加0.2μLP3000TM试剂，充分混匀。在每管已稀释的
Figure BDA0002418959420000042
试剂中按照1∶1比例加入稀释的DNA。室温孵育10-15分钟。每孔加入10μL DNA-脂质体复合物至细胞中，在37℃孵育细胞。
(3)MTT比色法检测转染后不同时间点细胞活性转染后48小时进行MTT实验，每孔加MTT 20μL，继续孵育4小时；轻轻吸弃上清，加二甲亚砜200μL，振荡5min，用酶标仪在490nm波长处测其吸光度值(OD值)，同时设置对照孔(培养液)。
通过MTT实验对肿瘤细胞数目进行检测，MTT底物可被肿瘤细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶还原成蓝紫色产物，死细胞无此功能；肿瘤细胞越多，增殖活率越强，颜色越深；据此推断肿瘤细胞的增殖活率。结果如表3和图3、4所示，转染pBICEP-N-Flag-Mu4的ShKu70/HeLa细胞活力明显小于转染pBICEP-N-Flag-Ku70质粒的细胞，根据抑制率的计算公式：
抑制率＝((OD490(Mu4)-OD490(Ku70))/OD490(Ku70)×100％，
Mu4对ShKu70/HeLa细胞的增殖抑制率为55.36％。
我们在肺癌细胞系PC9、H1975、肝癌细胞系Hep-G2、Bel-7402、结肠癌细胞系HCT-116及非癌细胞系293T内重复了实施例2的实验操作，以验证Mu4蛋白对其他肿瘤细胞及非癌细胞系增殖的抑制作用。结果如表3和图3、4所示。
表3
Figure BDA0002418959420000051
如表3所示，PC9、H1975、ShKu70/HeLa细胞，分别转染入pBICEP-N-Flag-Mu4与pBICEP-N-Flag-Ku70质粒，48h后MTT检测结果显示，转染不同质粒的细胞，其细胞活力有明显差异。过表达Ku70蛋白的PC9细胞，OD490平均值为0.51，大于过表达Mu4蛋白的PC9细胞(OD490平均值为0.40)。转染48小时后，Mu4蛋白对PC细胞的增殖抑制率为21.63％。过表达Ku70蛋白的H1975细胞，OD490平均值为0.78，大于过表达Mu4蛋白的PC9细胞(OD490平均值为0.52)，Mu4蛋白对细胞增殖抑制率为33.33％；过表达Ku70蛋白的ShKu70/HeLa细胞，其细胞本底的Ku70蛋白水平较低，48h后OD490平均值为2.24，大于过表达Mu4蛋白的PC9细胞(OD490平均值为1.00)，Mu4蛋白对细胞增殖抑制率为55.36％。
Mu4蛋白对宫颈癌和肺癌细胞的抑制率较明显，且抑制作用效果可能与细胞本底的Ku70表达水平相关。
分别转染入pBICEP-N-Flag-Mu4与pBICEP-N-Flag-Ku70质粒的肝癌细胞Bel-7402、Hep-G2、结肠癌细胞HCT-116，非肿瘤细胞293T，在转染48h后MTT检测结果显示，转染不同质粒的细胞，其细胞活力没有明显差别。表明过表达Mu4蛋白对肝癌、结肠癌细胞系及非癌细胞系的细胞增殖水平可能没有明显的抑制效果。
综上，我们构建的Ku70蛋白突变体：Mu4蛋白，对宫颈癌和肺癌细胞系的增殖抑制效果明显，对肝癌、结肠癌细胞系及非癌细胞系没有明显的抑制效果，表明Mu4蛋白对于肿瘤细胞增殖的抑制作用具有肿瘤特异性，目前发现对肺癌、宫颈癌的抑制作用较明显，且该抑制效果与细胞本底Ku70蛋白表达水平相关。
序列表
<110> 杭州医学院
<120> 一种具有抑制肿瘤细胞增殖功能的Ku70蛋白突变体、基因及应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 572
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ser Gly Trp Glu Ser Tyr Tyr Lys Thr Glu Gly Asp Glu Glu Ala
1 5 10 15
Glu Glu Glu Gln Glu Glu Asn Leu Glu Ala Ser Gly Asp Tyr Lys Tyr
20 25 30
Ser Gly Arg Asp Ser Leu Ile Phe Leu Val Asp Ala Ser Lys Ala Met
35 40 45
Phe Glu Ser Gln Ser Glu Asp Glu Leu Thr Pro Phe Asp Met Ser Ile
50 55 60
Gln Cys Ile Gln Ser Val Tyr Ile Ser Lys Ile Ile Ser Ser Asp Arg
65 70 75 80
Asp Leu Leu Ala Val Val Phe Tyr Gly Thr Glu Lys Asp Lys Asn Ser
85 90 95
Val Asn Phe Lys Asn Ile Tyr Val Leu Gln Glu Leu Asp Asn Pro Gly
100 105 110
Ala Lys Arg Ile Leu Glu Leu Asp Gln Phe Lys Gly Gln Gln Gly Gln
115 120 125
Lys Arg Phe Gln Asp Met Met Gly His Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Ser
130 135 140
Glu Val Leu Trp Val Cys Ala Asn Leu Phe Ser Asp Val Gln Phe Lys
145 150 155 160
Met Ser His Lys Arg Ile Met Leu Phe Thr Asn Glu Asp Asn Pro His
165 170 175
Gly Asn Asp Ser Ala Lys Ala Ser Arg Ala Arg Thr Lys Ala Gly Asp
180 185 190
Leu Arg Asp Thr Gly Ile Phe Leu Asp Leu Met His Leu Lys Lys Pro
195 200 205
Gly Gly Phe Asp Ile Ser Leu Phe Tyr Arg Asp Ile Ile Ser Ile Ala
210 215 220
Glu Asp Glu Asp Leu Arg Val His Phe Glu Glu Ser Ser Lys Leu Glu
225 230 235 240
Asp Leu Leu Arg Lys Val Arg Ala Lys Glu Thr Arg Lys Arg Ala Leu
245 250 255
Ser Arg Leu Lys Leu Lys Leu Asn Lys Asp Ile Val Ile Ser Val Gly
260 265 270
Ile Tyr Asn Leu Val Gln Lys Ala Leu Lys Pro Pro Pro Ile Lys Leu
275 280 285
Tyr Arg Glu Thr Asn Glu Pro Val Lys Thr Lys Thr Arg Thr Phe Asn
290 295 300
Thr Ser Thr Gly Gly Leu Leu Leu Pro Ser Asp Thr Lys Arg Ser Gln
305 310 315 320
Ile Tyr Gly Ser Arg Gln Ile Ile Leu Glu Lys Glu Glu Thr Glu Glu
325 330 335
Leu Lys Arg Phe Asp Asp Pro Gly Leu Met Leu Met Gly Phe Lys Pro
340 345 350
Leu Val Leu Leu Lys Lys His His Tyr Leu Arg Pro Ser Leu Phe Val
355 360 365
Tyr Pro Glu Glu Ser Leu Val Ile Gly Ser Ser Thr Leu Phe Ser Ala
370 375 380
Leu Leu Ile Lys Cys Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Cys Arg Tyr
385 390 395 400
Thr Pro Arg Arg Asn Ile Pro Pro Tyr Phe Val Ala Leu Val Pro Gln
405 410 415
Glu Glu Glu Leu Asp Asp Gln Lys Ile Gln Val Thr Pro Pro Gly Phe
420 425 430
Gln Leu Val Phe Leu Pro Phe Ala Asp Asp Lys Arg Lys Met Pro Phe
435 440 445
Thr Glu Lys Ile Met Ala Thr Pro Glu Gln Val Gly Lys Met Lys Ala
450 455 460
Ile Val Glu Lys Leu Arg Phe Thr Tyr Arg Ser Asp Ser Phe Glu Asn
465 470 475 480
Pro Val Leu Gln Gln His Phe Arg Asn Leu Glu Ala Leu Ala Leu Asp
485 490 495
Leu Met Glu Pro Glu Gln Ala Val Asp Leu Thr Leu Pro Lys Val Glu
500 505 510
Ala Met Asn Lys Arg Leu Gly Ser Leu Val Asp Glu Phe Lys Glu Leu
515 520 525
Val Tyr Pro Pro Asp Tyr Asn Pro Glu Gly Lys Val Thr Lys Arg Lys
530 535 540
His Asp Asn Glu Gly Ser Gly Ser Lys Arg Pro Lys Val Glu Tyr Ser
545 550 555 560
Glu Glu Glu Leu Lys Thr His Ile Ser Lys Gly Thr
565 570
<210> 2
<211> 1719
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtcagggt gggagtcata ttacaaaacc gagggcgatg aagaagcaga ggaagaacaa 60
gaagagaacc ttgaagcaag tggagactat aaatattcag gaagagatag tttgattttt 120
ttggttgatg cctccaaggc tatgtttgaa tctcagagtg aagatgagtt gacacctttt 180
gacatgagca tccagtgtat ccaaagtgtg tacatcagta agatcataag cagtgatcga 240
gatctcttgg ctgtggtgtt ctatggtacc gagaaagaca aaaattcagt gaattttaaa 300
aatatttacg tcttacagga gctggataat ccaggtgcaa aacgaattct agagcttgac 360
cagtttaagg ggcagcaggg acaaaaacgt ttccaagaca tgatgggcca cggatctgac 420
tactcactca gtgaagtgct gtgggtctgt gccaacctct ttagtgatgt ccaattcaag 480
atgagtcata agaggatcat gctgttcacc aatgaagaca acccccatgg caatgacagt 540
gccaaagcca gccgggccag gaccaaagcc ggtgatctcc gagatacagg catcttcctt 600
gacttgatgc acctgaagaa acctgggggc tttgacatat ccttgttcta cagagatatc 660
atcagcatag cagaggatga ggacctcagg gttcactttg aggaatccag caagctagaa 720
gacctgttgc ggaaggttcg cgccaaggag accaggaagc gagcactcag caggttaaag 780
ctgaagctca acaaagatat agtgatctct gtgggcattt ataatctggt ccagaaggct 840
ctcaagcctc ctccaataaa gctctatcgg gaaacaaatg aaccagtgaa aaccaagacc 900
cggaccttta atacaagtac aggcggtttg cttctgccta gcgataccaa gaggtctcag 960
atctatggga gtcgtcagat tatactggag aaagaggaaa cagaagagct aaaacggttt 1020
gatgatccag gtttgatgct catgggtttc aagccgttgg tactgctgaa gaaacaccat 1080
tacctgaggc cctccctgtt cgtgtaccca gaggagtcgc tggtgattgg gagctcaacc 1140
ctgttcagtg ctctgctcat caagtgtctg gagaaggagg ttgcagcatt gtgcagatac 1200
acaccccgca ggaacatccc tccttatttt gtggctttgg tgccacagga agaagagttg 1260
gatgaccaga aaattcaggt gactcctcca ggcttccagc tggtcttttt accctttgct 1320
gatgataaaa ggaagatgcc ctttactgaa aaaatcatgg caactccaga gcaggtgggc 1380
aagatgaagg ctatcgttga gaagcttcgc ttcacataca gaagtgacag ctttgagaac 1440
cccgtgctgc agcagcactt caggaacctg gaggccttgg ccttggattt gatggagccg 1500
gaacaagcag tggacctgac attgcccaag gttgaagcaa tgaataaaag actgggctcc 1560
ttggtggatg agtttaagga gcttgtttac ccaccagatt acaatcctga agggaaagtt 1620
accaagagaa aacacgataa tgaaggttct ggaagcaaaa ggcccaaggt ggagtattca 1680
gaagaggagc tgaagaccca catcagcaag ggtacgtga 1719
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagctgaaga cccacatcag caagggtacg tgaggatcct ctagatctgt taactccggg 60
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccggagtta acagatctag aggatcctca cgtacccttg ctgatgtggg tcttcagctc 60
<210> 5
<211> 118
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
accggcgtca gattatactg gagaaactcg agtttctcca gtataatctg acgtttttgb 60
aattcaaaaa cgtcagatta tactggagaa actcgagttt ctccagtata atctgacg 118

Claims (8)

1.一种具有抑制肿瘤细胞增殖功能的Ku70蛋白突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
2.如权利要求1所述Ku70蛋白突变体在制备抗肿瘤药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，肿瘤为肺癌或宫颈癌。
4.编码如权利要求1所述Ku70蛋白突变体的基因。
5.如权利要求4所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.如权利要求4或5所述基因在制备抗肿瘤药物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，肿瘤为肺癌或宫颈癌。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，将所述基因导入癌细胞内表达出所述Ku70蛋白突变体。
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