CN111329876A - 纳米硒及其修饰物在制备抗过敏药物或抗过敏制剂中的应用 - Google Patents

纳米硒及其修饰物在制备抗过敏药物或抗过敏制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了纳米硒及其修饰物在制备抗过敏药物或抗过敏制剂中的应用。本发明发明人发现，纳米硒及其修饰物通过抑制过敏反应中起主要效应的肥大细胞脱颗粒，以及相关细胞因子和环氧合酶2的合成，达到阻断过敏反应的作用；纳米硒生物相容性好，毒性低，与现在抗过敏药物相比，毒副作用小，可制成药物，也是作为日化用品的添加剂。从而，纳米硒及其修饰物在制备抗过敏药物或抗过敏制剂中的应用，具有广阔市场前景。

Description

纳米硒及其修饰物在制备抗过敏药物或抗过敏制剂中的应用
技术领域
本发明涉及一种，特别涉及纳米硒及其修饰物在制备抗过敏药物或抗过敏制剂中的应用。
背景技术
过敏性疾病是由机体接触致敏物质(如药物、食物、化妆品、刺激性气味、花粉、尘螨、动物毛发等)而引起的过敏反应或变态反应疾病，其中最为常见的有过敏性鼻炎、支气管哮喘、特应性皮炎、荨麻疹、过敏性肠炎等。近年来，过敏性疾病的发生率在全球范围内逐年上升，世界卫生组织已将其列为当今世界性重大卫生问题之一。2014年，全球范围内患过敏性疾病的人数已经超过3亿，成为第6大全球疾病的[Dharmage S C，et al.Atopicdermatitis and the atopic march revisited.Allergy，2014，69(1):17]，且很难根治。过敏性疾病病因复杂，涉及多种免疫细胞和细胞因子的参与。不同个体的遗传基础和环境因素对过敏反应的临床表现均会产生影响，增加了治疗过敏性疾病的难度。
对于过敏性疾病的治疗，目前主要的药物有：糖皮质激素类药物、抗组胺药物、过敏相关细胞因子的抑制剂或拮抗剂。但目前这些药物治疗方案仅仅是对症治疗，能减轻过敏反应的症状，并未针对病因进行治疗，因此无法达到根治效果，疾病经常反复发作。长期使用这些药物，对机体具有较强的毒副作用，如长期使用糖皮质激素类药物会导致水、盐、糖、蛋白质及脂肪代谢紊乱，出现向心性肥胖、骨质疏松、股骨头坏死、影响儿童生长发育等症状。抗组胺药物的副作用包括中枢神经抑制、心脏副作用、体重增加等。近年来免疫疗法在治疗过敏性疾病中受来越来越多的重视，逐渐成为一线治疗方法被各国指南推荐使用。变应原特异性免疫治疗是目前唯一针对病因治疗过敏性疾病的治疗方法。与药物对症治疗不同，其具有明确的远期疗效，可改变疾病进程，阻止变应性疾病的发展并预防新发过敏。目前常用的特异性免疫治疗方法主要包括皮下免疫疗法(SCIT)和舌下免疫疗法(SLIT)两种方法。这两种方法虽然疗效肯定，但存在着疗程长、治疗频繁、费用高昂及存在不良反应等弊端。临床实验中，不足50％的尘螨过敏性鼻炎患者能够坚持完成完整的皮下免疫治疗，有近1/3患者在皮下免疫治疗第1年脱落[EGERT-S CHMIDT A M,et al.Patient PreferAdherence,2014,8:1475-1481；DIBONAD,PLAIA A,et al.Journal of Allergy andClinical Immunology,2012,130:1097-1107.]。这些因素严重制约了免疫治疗的应用和发展。
因此，有必要继续研发更为安全、更为有效的抗过敏药物。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供纳米硒及其修饰物在制备抗过敏药物或抗过敏制剂中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：纳米硒及其修饰物在制备抗过敏药物或抗过敏制剂中的应用，是基于本发明发明人发现，纳米硒及其修饰物通过抑制过敏反应中起主要效应的肥大细胞脱颗粒，以及相关细胞因子和环氧合酶2的合成，达到阻断过敏反应的作用。纳米硒生物相容性好，毒性低，与现在抗过敏药物相比，毒副作用小，可制成药物，也是作为日化用品的添加剂。
所述的纳米硒是通过氧化还原法制备得到的纳米硒，优选为通过如下步骤制备得到：以水为介质，将无机硒和还原剂混合，反应，得到纳米硒；更优选通过如下步骤制备得到：以水为介质，将无机硒和还原剂混合，反应，透析，得到纳米硒。
所述的水的用量以能充分溶解或分散反应物为宜；优选为按无机硒的反应终浓度为4～6mM计算。
所述的无机硒优选为亚硒酸、亚硒酸盐和二氧化硒中的一种或至少两种。
所述的亚硒酸盐为亚硒酸钠(Na2SeO3)、亚硒酸钾(K2SeO3)和亚硒酸锌(ZnSeO3)中的一种或至少两种。
所述的还原剂优选为维生素C、硼氢化钠、巯基乙醇和五水硫代硫酸钠中的一种或至少两种。
所述的无机硒和所述的还原剂的用量按还原剂过量为宜，从而能将无机硒充分还原；更优选为按摩尔比1:3～10配比计算。
所述的反应的温度优选为0～10℃；更优选为3～5℃；最优选为4℃。
所述的透析优选为使用6000～10000Da透析膜进行；更优选为使用8000Da透析膜进行。
所述的透析的条件优选为使用去离子水透析12～36h；更优选为使用去离子水透析24h。
所述的纳米硒的粒径优选为500nm以下；更优选为50～300nm。
所述的修饰物是用修饰剂修饰纳米硒得到的物质，该物质具有更好的稳定性、生物相容性和生物利用度。
所述的修饰物的粒径优选为500nm以下；更优选为50～300nm。
所述的修饰剂包括但不限于多糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮。
所述的多糖优选为香菇多糖和壳聚糖中的一种或两种。
所述的修饰物优选为通过如下步骤制备得到：以水为介质，将无机硒和修饰剂混合，再与还原剂混合，反应，透析，得到修饰物；更优选通过如下步骤制备得到：以水为介质，将无机硒和修饰剂混合，再与还原剂混合，反应，透析，将透析得到的产物和保护剂混合，得到修饰物。
所述的水的用量以能充分溶解或分散反应物为宜；优选为按无机硒的反应终浓度为4～6mM计算。
所述的无机硒优选为亚硒酸、亚硒酸盐和二氧化硒中的一种或至少两种。
所述的亚硒酸盐为亚硒酸钠(Na2SeO3)、亚硒酸钾(K2SeO3)和亚硒酸锌(ZnSeO3)中的一种或至少两种。
所述的还原剂优选为维生素C、硼氢化钠、巯基乙醇和五水硫代硫酸钠中的一种或至少两种。
所述的修饰剂包括但不限于多糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮。
所述的多糖优选为香菇多糖和壳聚糖中的一种或两种。
所述的无机硒和所述的还原剂的用量按还原剂过量为宜，从而能将无机硒充分还原；更优选为按摩尔比1:3～10配比计算。
所述的修饰剂的用量按无机硒：修饰剂＝1mmol：1～3g计算；更优选按无机硒：修饰剂＝1mmol：2g计算。
所述的反应的温度优选为0～10℃；更优选为3～5℃；最优选为4℃。
所述的透析优选为使用6000～10000Da透析膜进行；更优选为使用8000Da透析膜进行。
所述的透析的条件优选为使用去离子水透析12～36h；更优选为使用去离子水透析24h。
所述的干燥优选为真空干燥。
所述的保护剂优选为麦芽糊精或乳糖。
所述的保护剂的用量按透析得到的产物：保护剂＝质量比1：40～60配比；更优选按透析得到的产物：保护剂＝质量比1：50配比。
纳米硒及其修饰物在制备抗过敏药物中的应用，包括将纳米硒及其修饰物作为抗过敏的药物单独使用或与其他现有药物联合使用。
纳米硒及其修饰物在制备抗过敏制剂中的应用，包括将纳米硒及其修饰物添加到日化用品中，使其具有抗过敏作用或降低其本身致敏性。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
当前使用的抗过敏药物不能根治过敏，需要长期使用，毒副作用比较大，而免疫疗法虽然效果好，但疗程长、治疗频繁且费用高。本发明发明人发现纳米硒，特别是纳米硒修饰物可以通过抑制MAPK通路、Ca离子动员和抑制炎症相关细胞因子和环氧合酶2的合成等方式发挥抗过敏作用，效果显著；而且相比现有的抗过敏药物，纳米硒及其修饰物的毒副作用更低，材料价廉易得、合成方法简便。从而，纳米硒及其修饰物在制备抗过敏药物或抗过敏制剂中的应用，具有广阔市场前景。
附图说明
图1为纳米硒的电镜图；其中，A乳糖为辅料的香菇多糖纳米硒(Lac-SeNPs)，左图的比例标尺为500nm，右图的比例标尺为200nm；B麦芽糊精做为辅料的香菇多糖纳米硒(Mal-SeNPs)，左图的比例标尺为500nm，右图的比例标尺为200nm。
图2为Lac-SeNPs和Mal-SeNPs两种纳米硒的Zeta电位图。
图3为SeNPs、Lac-SeNPs和Mal-SeNPs三种纳米硒一周内的粒径大小变化的检测结果图。
图4为RBL-2H3细胞对不同纳米硒的吸收结果图；其中：A为加入载香豆素-6的纳米硒不同时间后RBL-2H3细胞的荧光照片图；B为加入纳米硒不同时间后，RBL-2H3细胞内的硒含量的检测结果图。
图5为加入载香豆素-6的纳米硒与溶酶体在不同时间后在RBL-2H3细胞内的定位情况的荧光照片图。
图6为纳米硒对RBL-2H3细胞的毒性检测结果图；其中，A为未修饰纳米硒(SeNPs)，B为Lac-SeNPs，C为Mal-SeNPs。
图7为纳米硒对过敏原引起RBL-2H3细胞脱颗粒的抑制作用结果图。
图8为纳米硒对过敏原引起RBL-2H3细胞释放组胺的抑制作用结果图；组别包括对照组(control)、IgE+DNP-HAS处理组、香菇多糖(Lentinan)组，未修饰纳米硒(SeNPs)组，Lac-SeNPs组，Mal-SeNPs组。
图9为纳米硒对过敏原引起RBL-2H3细胞释放β-氨基己糖苷酶的抑制作用结果图；组别包括对照组(control)、IgE+DNP-HAS处理组、香菇多糖(Lentinan)组，未修饰纳米硒(SeNPs)组，Lac-SeNPs组，Mal-SeNPs组。
图10为纳米硒对过敏原引起RBL-2H3细胞ROS上升的抑制作用结果图。
图11为RBL-2H3细胞ROS的荧光图片图。
图12为纳米硒对过敏原引起RBL-2H3细胞线粒体断裂的抑制作用结果图。
图13为纳米硒对过敏原引起RBL-2H3细胞钙离子动员的抑制作用结果图。
图14为纳米硒对过敏原引起RBL-2H3细胞炎症细胞因子上调的抑制作用结果图。
图15为纳米硒对过敏原引起RBL-2H3细胞MAPK通路激活(A)和COX2(B)表达的抑制作用结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：纳米硒的合成与表征
本实施例用氧化还原法合成了纳米硒，利用维生素c(Vc)还原亚硒酸(H2SeO3)或者亚硒酸钠(Na2SeO3)，并在其中添加香茹多糖进行修饰。制得纳米硒后，对其进行透析，去除未反应的原料，具体步骤如下：
(1)纳米硒制备：在4℃下，将2mL的Na2SeO3(终浓度5mM)放入小烧杯中，滴加2mL Vc(50mM)溶液，在4℃反应1小时，然后用8000Da透析膜在去离子水透析24小时，得到未修饰的纳米硒(SeNPs)。
(2)香茹多糖SeNPs制备：在2mL Na2SeO3(终浓度5mM)溶液小烧杯中加入香茹多糖(终浓度10mg/ml，陕西森弗天然制品有限公司，CAS号37339-90-5)，混合均匀，滴加2mL Vc(50mM)反应1小时，用8000Da透析膜在去离子水中透析24小时，即得产物香茹多糖-SeNPs。在规模生产中，得到的纳米硒经透析后，可分别加入50：1(质量比，麦芽糊精或乳糖：纳米硒)的麦芽糊精和乳糖做为辅料，进行真空喷雾干燥，便于长期存储。在后文的实施例中，麦芽糊精做为辅料进行干燥的香菇多糖纳米硒缩写为Mal-SeNPs，乳糖做为辅料的称为Lac-SeNPs。
通过电镜拍摄纳米硒(Mal-SeNP和Lac-SeNPs)的形态，结果如图1所示，所合成的纳米硒近似球形，分散较均匀。通过对纳米硒(Mal-SeNP和Lac-SeNPs)的zeta电位进行测定，发现纳米硒表面带较弱的负电荷，结果如图2所示。通过对纳米硒(SeNPs、Mal-SeNP和Lac-SeNPs)连续一周的粒径监测，结果如图3所示，刚合成的纳米硒粒径相似，匀为100nm左右；未修饰的纳米硒稳定性较差，1天之后便发生聚集，粒径急剧增大，随后发生沉淀，粒径有所减小，在300nm左右；而经香菇多糖修饰的纳米硒稳定性良好，粒径几乎未发生变化，说明未产生聚集而沉淀。
实施2：肥大细胞RBL-2H3对纳米硒的吸收及纳米硒在细胞中的定位
本案例测定过敏反应中主要的效应细胞肥大细胞对纳米硒的吸收，以及纳米硒在细胞中的定位。本实例及后文用到的鼠源肥大细胞RBL-2H3购于赛百慷(上海)生物技术股份有限公司。用含10％(v/v)FBS(Gibco，Life technology)的EMEM培养基(维森特生物技术(南京)有限公司)培养于含5％CO2、37℃细胞培养箱中。本实例中用到带荧光的纳米硒为在合成过程中加入了绿色荧光染料香豆素-6(coumarin-6)的纳米硒。
(1)载香豆素-6的纳米硒、Mal-SeNP和Lac-SeNPs的制备：
A、载香豆素-6的纳米硒制备：4℃下，在2mL盛Na2SeO3(终浓度5mM)溶液小烧杯中加入香豆素-6(终浓度20μM)混匀，滴加2mL Vc(50mM)，在4℃反应1小时，透析24小时，得到载有香豆素-6的纳米硒。
B、载香豆素-6的香菇多糖SeNPs制备：在2mL Na2SeO3(终浓度5mM)溶液小烧杯中加入香豆素-6(终浓度20μM)和香茹多糖(终浓度10mg/mL)，混匀，滴加2mL Vc(50mM)反应1小时，用8000Da透析膜在去离子水中透析24小时，即得产物香茹多糖-SeNPs。在规模生产中，得到的纳米硒经透析后，可分别加入50：1(质量比，麦芽糊精或乳糖：纳米硒)的麦芽糊精和乳糖做为辅料，进行真空喷雾干燥，便于长期存储。在后文的实施例中，麦芽糊精做为辅料进行干燥的香菇多糖纳米硒缩写为Mal-SeNPs，乳糖做为辅料的称为Lac-SeNPs。
(2)细胞吸收实验：
RBL-2H3细胞培养至对数生长期，经0.25％(w/v)胰酶(含0.02％EDTA)消化，计数后，取2×106个细胞(共5mL)接种到6-cm培养皿中。贴壁后，加入纳米硒(终浓度为100μM)。分别孵育0、1、2、4、8小时，然后去掉培养基，用PBS(0.01M，pH7.4，下面涉及的PBS的浓度与pH均同此)将细胞洗两次，再用0.25％(w/v)胰酶消化，收集细胞；与5ml酸液(浓度为68％的浓硝酸和浓度为70％的高氯酸按体积比3：1配比混合得到)混合后，放入硝化炉中180℃硝化2h，加入约3ml浓度为6mol/L盐酸还原30min，最后定容至10mL，用原子荧光光谱仪检测硒的含量。结果如图4所示，修饰后的纳米硒(Mal-SeNP和Lac-SeNPs)比未修饰的纳米硒被细胞吸收更快，量更多。
为检测纳米硒进入细胞后在细胞内的分布，RBL-2H3细胞2×104/ml铺于2-cm玻璃细胞培养皿中(每皿2ml)，经24h贴壁后，加入溶酶体荧光染料
Figure BDA0002424440210000061
Red DND-99(molecular
Figure BDA0002424440210000062
life technologiesTM，终浓度50nM)孵育30min，再分别加入载香豆素-6的纳米硒(终浓度40μM)和载香豆素-6的香菇多糖纳米硒(终浓度40μM)，孵育0、1、2、4、8小时。孵育结束前5min加入DAPI(终浓度300nM)，5min后弃掉培养基，PBS洗一次后换新鲜培养基，用荧光显微镜(EOVS FL AUTO,life technologiesTM)拍照。实验结果如图5所示，随着时间延长，纳米硒进入细胞越多。进入细胞后纳米硒主要与溶酶体共定位。
实施例3：纳米硒对肥大细胞RBL-2H3的毒性测定
本实例利用MTT(噻唑蓝)法评价合成的纳米硒对RBL-2H3细胞的毒性，本实施例中用到的纳米硒的制备过程同实施例1。RBL-2H3细胞培养至对数生长期，经0.25％(w/v)胰酶(含0.02％EDTA)消化，计数后，以接种到96孔板中，每孔接种4000个细胞，培养基体积为100μL。置于培养箱中24小时，待细胞贴壁。然后每孔加入用培养基稀释的不同浓度的纳米硒各100μl，每个药物浓度均分三组平行。对照组加入100μL EMEM培养基。每个处理至少铺3个复孔，细胞置于37℃、5％CO2培养24小时或72小时后，每孔加入30μl MTT(5mg/ml)孵育3.5小时后抽去每个孔的上清，并再次向每个孔加入150μl DMSO，振荡摇匀10分钟，用多功能酶标仪测定570nm的吸光值，并计算不同细胞不同药物处理组的存活率和半抑制浓度(IC50，存活率为50％时的药物浓度)。细胞的存活率按以下公式计算：存活率＝处理组吸光值/对照组吸光值×100％。
实验结果如图6所示：处理24小时，三种纳米硒对RBL-2H3细胞的毒性较低，几乎需要在100μM以上才对细胞生长产生明显的抑制作用。处理72小时，未修饰的纳米硒对RBL-2H3的IC50大于80μM，而两个修饰后的纳米硒(Mal-SeNP和Lac-SeNPs)IC50相似，约为20μM。修饰与未修饰的纳米硒对RBL-2H3细胞毒性的差异或因RBL-2H3细胞对它们的吸收率不一样所致。修饰的纳米硒较稳定，不易聚沉，更易被细胞吸收，发挥生物学效应。
实施例4：纳米硒对RBL-2H3细胞脱颗粒抑制作用的检测
为检测纳米硒对RBL-2H3细胞脱颗粒抑制作用，本实例通过中性红染料染色观察RBL-2H3细胞脱颗粒后的形态变化，同时检测培养基中的组胺含量和β-氨基己糖苷酶活性，对细胞脱颗粒程度进行测定；本实施例中用到的纳米硒的制备过程同实施例1。
2mL浓度为10000个细胞/mL RBL-2H3细胞接种于2-cm玻璃培养皿中。贴壁后，加入抗DNP IgE(DNP14-M,Alpha Diagnostic International Inc，终浓度为0.5μg/mL)处理24小时使细胞致敏，然后加入纳米硒(终浓度20μM)预处理2小时，再加入的DNP-HSA(AV-9330-HSA，Alpha Diagnostic International Inc，终浓度为10μg/mL)激发，使细胞脱颗粒。2小时后，去除细胞培养液，用PBS洗涤一次。加入200μL浓度为0.33％(w/v)的中性红染色液，染色5分钟。用PBS洗涤1次后，在显微镜下进行观察和拍照。实验结果如图7所示，未加药组的细胞被激发后，脱颗粒程度严重，细胞内出现大量空泡；单独香菇多糖对细胞的脱颗粒并没有抑制作用；未修饰的纳米硒由于不稳定，容易沉淀，因此不易被细胞吸收，发挥生物学效应，对脱颗粒的抑制作用微弱；而经Mal-SeNPs和Lac-SeNPs两种纳米硒预处理，均能显著抑制了RBL-2H3细胞脱颗粒现象。
检测组胺和β-氨基己糖苷酶的实验中，RBL-2H3细胞铺于24孔板中，5×104个/孔，细胞处理与上述一致。处理结束后，收集细胞培养液，用于检测培养液中的组胺含量和β-氨基己糖苷酶活性。剩下的细胞经PBS洗涤一次后，每孔加200μL浓度为0.5％的Triton X-100细胞裂解液，冰浴30min，收集裂解液，3000r/min离心1min，收取上清，用于测定细胞内的β-氨基己糖苷酶活性。组胺含量利用美国Cloud-Clone公司试剂盒CEA927Ge检测，β-氨基己糖苷酶活性利用美国Cell Biolabs公司的试剂盒MET-5095检测，具体操作步骤按照试剂盒的说明书进行。实验结果如图8所示，未处理的细胞培养基上清中几乎不含组胺，经IgE和DNP-HSA刺激后，细胞释放到培养基中的组胺含量达20ng/mL。香菇多糖(Lentinan)并不能抑制组胺的释放。未修饰纳米硒可将组胺的释放量抑制到14ng/mL，而Mal-SeNPs和Lac-SeNPs纳米硒对组胺释放量抑制极为显著，组胺含量为2-3ng/mL。β-氨基己糖苷酶活性的测定结果与组胺释放的结果类似(图9)。可见香茹多糖对RBL-2H3细胞受过敏原刺激后的脱颗粒过程无影响，未修饰的纳米硒对脱颗粒具有抑制作用，但因其易沉淀不易进入细胞发挥作用，其抑制作用有限。而香茹多糖修饰的纳米硒较为稳定，易被细胞大量吸收，因此能极大地抑制RBL-2H3细胞的脱颗粒。
实施例5：纳米硒抑制过敏原引起的RBL-2H3细胞活性氧产生
文献报道，肥大细胞受激活发生脱颗粒时，伴随着细胞内的活性氧升高(Shuichiro Endo，et al.Cellular Immunology 271(2011)488–495)。本案例检测纳米硒处理对RBL-2H3细胞激活时细胞内ROS的影响；本实施例中用到的纳米硒的制备过程同实施例1。RBL-2H3以细胞8×104/ml密度接种于96孔板，每孔100μl。待细胞贴壁后，加入IgE(终浓度为0.5μg/mL)，孵育24小时。洗去IgE后，加入100μL用培养基稀释的纳米硒(终浓度20μM)，孵育2小时。洗去后，加入100μL浓度为10μM的DCFH-DA(2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯)，染色30分钟。洗去染料后，加入DNP-HAS(终浓度为10μg/mL)，立即用多功能酶标仪读取激发波长为488nm，发射波长为525nm的荧光强度强度，然后分别在之后1、5、10、20、40分钟时，读取荧光值。各组的荧光强度除以对照组的荧光强度后，结果如图10所示，受过敏原激发后，RBL-2H3细胞内ROS水平上升明显，纳米硒(Mal-SeNP和Lac-SeNPs)的加入显著抑制了ROS的上升。在60分钟时显微镜拍摄的荧光照片也验证了这一结果(图11)，说明纳米硒可有效抑制过敏反应中肥大细胞的ROS上升。
实施例6：纳米硒抑制过敏原引起的RBL-2H3细胞线粒体断裂
本案例检测纳米硒对活性氧升高后引起的细胞线粒体断裂的抑制作用；本实施例中用到的纳米硒的制备过程同实施例1。将2×104个RBL-2H3细胞铺于共聚焦显微镜拍照用的玻璃培养皿中。24小时细胞贴壁后，加入终浓度为0.5μg/mL的IgE，孵育24小时。洗去IgE后，加入2mL含纳米硒(终浓度20μM)的培养基孵育2小时。结束前30分钟，加入线粒体染料MitoTracker Green(molecular
Figure BDA0002424440210000081
life technologiesTM，终浓度为300nM)和细胞核染料DAPI(终浓度300nM)染色30分钟。吸去培养基，用PBS洗一次，换上新鲜培养基。加入DNP-HAS(终浓度为10μg/mL)，用共聚集显微镜(LSM800,Zeiss)拍摄细胞线粒体图片。实验结果如图12所示，未处理的对照组细胞，线粒体呈长条丝状分布于细胞中。经过anti-DNP IgE致敏和DNP-HSA激发的细胞由于产生大量ROS使线粒体损伤断裂，细胞内的线粒体形态呈点状分布于细胞中。用纳米硒预处理的两组细胞，再受DNP-HSA激发后，线粒体的断裂程度显著受到抑制，说明纳米硒可抑制过敏反应中ROS的产生及其引发的线粒体断裂。
实施例7：纳米硒抑制过敏原引起RBL-2H3细胞的钙离子动员
过敏反应过程中，过敏原引起肥大细胞FcεRI受体交联，激活下游通路。其中钙离子动员在脱颗粒和炎症介质释放的过程中起重要作用。为进一步证实纳米硒对过敏反应的抑制作用，本实例检测纳米硒对过敏原激发后RBL-2H3细胞内的钙离子浓度变化；本实施例中用到的纳米硒的制备过程同实施例1。RBL-2H3以细胞1×105个/mL密度接种于6孔板，每孔2mL。待细胞贴壁后，加入IgE(终浓度为0.5μg/mL)，孵育24小时。洗去IgE后，加入2mL含纳米硒(终浓度20μM)的培养基，孵育2小时。用胰酶将细胞从孔板中消化起来，重悬于无Ca2+的PBS中，加入终浓度为4μM、含0.04％Pluronic F127的钙离子染料Fluo 3-AM(molecular
Figure BDA0002424440210000082
life technologiesTM)，于37℃孵育30分钟。离心洗去染料后再用PBS重悬细胞，于流式细胞仪中检测Fluo 3-AM荧光强度。前20秒检测值做为基线，随后加入浓度为10μg/mL的DNP-HSA，混匀，立即上机检测，再收集40秒观察荧光强度变化。实验结果如图13所示，未加纳米硒的对照组细胞，在加入DNP-HSA的短时间内，Fluo 3-AM的荧光强度急剧上升，表明细胞内的钙离子浓度快速升高，而加入纳米硒预处理的细胞，虽然荧光强度有所增加，但与对照组相比变化显著降低，说明纳米硒可以抑制过敏反应中钙离子的动员。
实施例8：纳米硒抑制过敏原引起RBL-2H3细胞的炎症相关因子的表达
过敏反应中，肥大细胞除了发生脱颗粒释放已存在的炎症介质之外，还会新表达合成如IL-6、IL-13和TNF-α等细胞因子。本实验例检测纳米硒对该过程的抑制作用；本实施例中用到的纳米硒的制备过程同实施例1。RBL-2H3以细胞1×105个/mL密度接种于6孔板，每孔2mL。待细胞贴壁后，加入IgE(终浓度0.5μg/mL)，孵育24小时。洗去IgE后，加入2mL含纳米硒(终浓度20μM)的培养基，孵育2小时，再加入DNP-HAS(终浓度为1μg/mL)孵育24小时。处理结束后，去除细胞培养基，用PBS洗两次后，每孔加入500μL Trizol(Invitrogen)裂解细胞。转移至1.5mL EP管中，颠倒混匀，然后静置5分钟。每管加入100μL氯仿震荡混匀，然后静置10分钟。置于离心机中，12000g、4℃离心15分钟。小心吸取上层水相至新的离心管中，然后每管加入250μL异丙醇，上下颠倒混匀，静置10分钟。12000g、4℃离心10分钟后，弃去上清。在沉淀中加入1mL浓度为75％(v/v)乙醇，颠倒离心管洗涤沉淀。7500g、4℃离心5分钟后，去除上清液，将离心管倒置于滤纸上10分钟自然干燥。随后用20μL DEPC水融解沉淀，得到RNA。经Nano Drop 2000定量后，取1μg RNA进行逆转录(TaKaRa，RR047A试剂盒)和qPCR(biomake，2×SYBR Green qPCR Master Mix)，检测IL-6、IL13和TNF-α的mRNA表达水平。实验结果如图14所示，未处理的细胞，IL-6、IL13和TNF-α的表达处理于低水平，细胞受到激发后，三者的表达水平大幅提高，而纳米硒处理的细胞，三个基因表达上调的幅度受到了显著地抑制，提示纳米硒可抑制这些炎症因子的表达，减轻过敏的症状。
实施例9：纳米硒对MAPK通路和COX2表达的抑制作用
肥大细胞表面的FcεRI受体激活后，其对下游MAPK通路的激活在其信号转导过程中起着重要作用。环氧合酶2(COX2)在受过敏原刺激后会被诱导表达，从而催化合成大量的致炎性前列腺素(PG)，导致炎症，发热和疼痛等病理生理过程。因此，在本实施例中，我们检测纳米硒对MAPK通路和COX2表达的影响；本实施例中用到的纳米硒的制备过程同实施例1。将2×106个RBL-2H3细胞(10mL)接种于10cm培养皿中，待细胞贴壁后，加入IgE(终浓度0.5μg/mL)致敏24小时。洗去IgE后，加入2mL含纳米硒(终浓度20μM)的培养基预处理2小时。然后加入DNP-HAS(终浓度1μg/mL)处理10分钟，收集细胞提取总蛋白进行Western blot检测。检测COX2表达时，DNP-HSA处理时间为24小时。实验结果如图15所示，DNP-HSA刺激后，p-p38、p-AKT、p-Erk的水平均有所上升，其中p-p38上调最为显著。而纳米硒的加入能有效抑制这些蛋白的磷酸化，抑制通路的激活。同样，COX2的表达在DNP-HSA刺激后有所上调，且受到纳米硒的抑制。以上结果说明，纳米硒可以在多方向肥大细胞的受过敏原的激发，抑制过敏反应。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.纳米硒及其修饰物在制备抗过敏药物或抗过敏制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的纳米硒及其修饰物在制备抗过敏药物或抗过敏制剂中的应用，其特征在于：
所述的纳米硒通过如下步骤制备得到：将无机硒和还原剂混合，反应，得到纳米硒。
3.根据权利要求2所述的纳米硒及其修饰物在制备抗过敏药物或抗过敏制剂中的应用，其特征在于：所述的无机硒为亚硒酸、亚硒酸盐和二氧化硒中的一种或至少两种；
所述的还原剂为维生素C、硼氢化钠、巯基乙醇和五水硫代硫酸钠中的一种或至少两种。
4.根据权利要求1所述的纳米硒及其修饰物在制备抗过敏药物或抗过敏制剂中的应用，其特征在于：所述的纳米硒的粒径为500nm以下。
5.根据权利要求1所述的纳米硒及其修饰物在制备抗过敏药物或抗过敏制剂中的应用，其特征在于：所述的修饰物是用修饰剂修饰纳米硒得到的物质；
所述的修饰剂包括但不限于多糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮。
6.根据权利要求5所述的纳米硒及其修饰物在制备抗过敏药物或抗过敏制剂中的应用，其特征在于：所述的多糖为香菇多糖和壳聚糖中的一种或两种。
7.根据权利要求1所述的纳米硒及其修饰物在制备抗过敏药物或抗过敏制剂中的应用，其特征在于：所述的修饰物通过如下步骤制备得到：以水为介质，将无机硒和修饰剂混合，再与还原剂混合，反应，透析，得到修饰物。
8.根据权利要求1所述的纳米硒及其修饰物在制备抗过敏药物或抗过敏制剂中的应用，其特征在于：
所述的无机硒为亚硒酸、亚硒酸盐和二氧化硒中的一种或至少两种；
所述的还原剂为维生素C、硼氢化钠、巯基乙醇和五水硫代硫酸钠中的一种或至少两种；
所述的修饰剂包括但不限于多糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮；
所述的无机硒和所述的还原剂的用量按摩尔比1:3～10配比计算；
所述的修饰剂的用量按无机硒：修饰剂＝1mmol：1～3g计算。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：是将纳米硒及其修饰物作为抗过敏的药物单独使用或与其他现有药物联合使用。
10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于包括如下步骤：将纳米硒及其修饰物添加到日化用品中进行应用。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112451514A (zh) * 2020-11-26 2021-03-09 江西农业大学 二氢杨梅素纳米硒及其制备方法和应用
CN116042729A (zh) * 2022-12-30 2023-05-02 山东大学 一种用于强化光合细菌产氢的纳米硒生物制剂及其应用
CN116236416A (zh) * 2023-02-28 2023-06-09 广州今盛美精细化工有限公司 一种纳米负载的透明质酸钠及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109650350A (zh) * 2019-01-23 2019-04-19 广东暨创硒源纳米研究院有限公司 一种大规模制备多糖修饰纳米硒的方法及应用
CN109665914A (zh) * 2019-01-29 2019-04-23 广东暨创硒源纳米研究院有限公司 多糖复合纳米硒在富硒茶生产中的应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109650350A (zh) * 2019-01-23 2019-04-19 广东暨创硒源纳米研究院有限公司 一种大规模制备多糖修饰纳米硒的方法及应用
CN109665914A (zh) * 2019-01-29 2019-04-23 广东暨创硒源纳米研究院有限公司 多糖复合纳米硒在富硒茶生产中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARAKAWA, TOMOHIRO等: "Seleno-L-Methionine Suppresses Immunoglobulin E-Mediated Allergic Response in RBL-2H3 Cells", 《BIOLOGICAL & PHARMACEUTICAL BULLETIN》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112451514A (zh) * 2020-11-26 2021-03-09 江西农业大学 二氢杨梅素纳米硒及其制备方法和应用
CN116042729A (zh) * 2022-12-30 2023-05-02 山东大学 一种用于强化光合细菌产氢的纳米硒生物制剂及其应用
CN116042729B (zh) * 2022-12-30 2024-06-07 山东大学 一种用于强化光合细菌产氢的纳米硒生物制剂及其应用
CN116236416A (zh) * 2023-02-28 2023-06-09 广州今盛美精细化工有限公司 一种纳米负载的透明质酸钠及其制备方法和应用

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