CN111315396A - 癌症联合疗法 - Google Patents

Abstract

一种治疗癌症患者的方法和组合，通过联合2种不同免疫治疗方案以在共同时间段内给患者施用，包括检查点抑制剂抗体组分如通过输注施用的PD‑1或PD‑L1抗体以及皮下施用的TAA/ecdCD40L疫苗组分，其中初始抗体组分施用后是至少数次相继的抗体加强，初始疫苗组分施用后是至少数次相继的疫苗加强，每一种的初始和加强都在至少所述共同时间段内施用，其中与2种不同免疫治疗组成方案中任一种作为单一疗法单独施用时的治疗效果相比，所述2种不同免疫治疗方案的联合施用提供增强的治疗效果。

Description

癌症联合疗法

相关申请的交叉引用

本申请要求35 USC 119下，基于2017年9月1日提交的美国临时申请号62/553,363；2017年9月25日提交的62/562,636；2017年12月6日提交的62/595,106，和2018年1月29日提交的美国申请号15/882,181的优先权和权益，所述申请的公开内容在此通过引用整体纳入。

发明领域

本发明涉及提高人体自身免疫系统以使身体能增强针对癌细胞的免疫应答，这是通过采用由抗检查点抑制抗体与TAA/ecdCD40L治疗疫苗组成的癌症联合疗法，施用于单独的癌症患者实现的。申请人疫苗与抗检查点抑制抗体疗法联用时的累加效应，就消除癌变肿瘤而言，提供了比疫苗或抗检查点抑制抗体疗法作为单一疗法时更有效的治疗方法。

发明背景

如本文所述，申请人的实验设计成：(i)在第一实验(实验1)中，通过给不同对象多次分开施用，比较单一疗法皮下注射Ad-sig-hMUC-1/ecdCD40L疫苗载体疗法与单一疗法腹腔内注射抗PD-1检查点抑制抗体疗法(目前市售可得)，然后(ii)在第二实验(实验2)中，测试多次施用2种疗法(疫苗载体疗法与检查点抑制剂PD-1抗体疗法)组合是否比这2种疗法任一种单独施用时对小鼠乳腺癌E3细胞系生长速率的抑制更大，该细胞系是人MUC-1抗原阳性的。在其他标准中，申请人的目标是确定联用TAA/ecdCD40L疫苗与PD-1抗体是否增加进入肿瘤结节的抗原特异性T细胞数目，造成(i)通过肿瘤细胞死亡数显示的功效增加，个体中的正常组织(非癌变肿瘤)破坏减少，(ii)个体生存期增加和(iii)允许在相对较短时间段内降低抗体剂量水平。

众所周知，目前使用抗PD-1检查点抑制抗体疗法，以从肿瘤细胞上PD-L1配体与T细胞上PD-1受体的相互作用中释放T细胞，所述相互作用抑制CD8效应T细胞响应肿瘤细胞。申请人的疫苗平台目前以肿瘤抗原特异方式使用免疫刺激蛋白CD40L，以激活树突细胞，其进而活化身体的CD8+T细胞和CD4+T细胞，从而攻击携带靶抗原的其他细胞。

在当前的实验研究中，Ad-sig-hMUC-1/ecdCD40L疫苗载体疗法(单独和联合抗PD-1检查点抑制抗体疗法)的抗肿瘤活性在荷有同系E3小鼠乳腺癌细胞系的免疫活性BALB/c小鼠中评估，该细胞系是人MUC-1基因阳性的。E3鼠乳腺癌细胞系用作同系肿瘤模型以测试免疫疗法相关产物的功效。研究进行约16-18周，常规观测肿瘤体积、生存和体重。尽管在此特定实验中，腺病毒表达载体用作疫苗，但仍会讨论数种疫苗替代形式。

申请人的疫苗载体包括编码可分泌多肽的转录单元，所述多肽包括CD40配体胞外域(ecd)、肿瘤抗原(位于所述CD40配体ecd上游)分泌信号序列(位于所述肿瘤抗原上游)，所述CD40配体ecd基本上失去所有跨膜域，使得CD40L可分泌。还提供通过施用有效量的疫苗载体针对表达肿瘤抗原的细胞产生免疫应答的方法。

定义

“TAA”指靶相关抗原和/或肿瘤相关抗原。TAA是感兴趣的抗原。例如，其可以是粘蛋白抗原。

“癌症”或“肿瘤”指任何类型的癌症和实体或非实体癌症类型的癌转移，选自(whether)癌、肉瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病。

“Ad”指腺病毒载体，然而，当体内施用能进入靶细胞并表达所编码蛋白时，可采用任何病毒或非病毒表达载体。参见如下“载体”定义。

“ecd”指CD40配体胞外域且至少明确排除抑制分泌的跨膜域。

“MUC-1”指一种粘蛋白类型，但是可使用任何其他形式的粘蛋白。

“sig”指分泌信号。

“AB”指抗体。

“μg”指微克。

“mg”指毫克。

“mm”指毫米。

“sc”指皮下。

“VPU”指每单位的病毒颗粒。

“DC”指树突细胞。

“基线”指实验1和2在第1天的肿瘤体积(TV)。研究开始第1天的50-100mm³的TV选择参见表1和2的随机化和研究开始。

“有效量”指根据本发明教导的癌症药剂(agent)施用和/或治疗的量，所述量在本文所述的癌症治疗受者中有效地产生(或有助于产生)免疫应答。“有效量”或剂量水平取决于多种因素且可根据如下变化：所治疗病症、特定化合物的活性、施用途径、病毒载体清除速率、与病毒载体联合或同时使用的药物、疾病严重性、患者临床史、患者年龄、体重、性别、饮食、身体状况和/或一般健康状况、治疗持续时间等。有效量能多于或少于实验所用特定量，且取决于确定治疗有效量的考虑因素。确定治疗有效量的多个一般性考虑是本领域技术人员已知的，并描述于例如Gilman et al,eds.,Goodman and Gilman’s“ThePharmacological Bases of Therapeutics”,Pergamon Press；和Remmington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,PA。

“联合疗法”、“联合治疗”或“联合”指至少疫苗和检查点抑制剂治疗，在规定时间段内同时和/或不同时间，用至少所述2种不同治疗剂。

“检查点抑制剂”和/或“抗体”指任何一种或多种经设计的商业药物和/或非商业药物，无论是否商业化和/或销售以施用给个体(或动物)，且无论如何施用，用于开启体内检查点，其可部分或全部阻止免疫系统用身体T细胞攻击癌。

“PD-1”指检查点抑制剂抗体的一个示例。

“细胞系”在本申请的示范性实验中，指BALB/c小鼠中的hMUC-1阳性E3小鼠乳腺癌细胞系(Victoria Carr-Brendel等,Cancer Research 60:2435,2000；EL-Nasir Lalani等,JBC 266:15420,1991)。

“PFU”指每单位体积能形成噬斑的颗粒数。

“TGI”指肿瘤生长抑制。

“MHC”指主要组织相容性复合体。

“SEM”指结构方程建模。

“Kaplan-Meier”或“K-M”指Kaplan-Meier估计量，也称为乘积极限估计量，是用于从寿命数据估算生存函数的非参数统计。在医学研究中，其通常用于测量治疗后存活一段时间的患者部分。该估计量以Edward L.Kaplan和Paul Meier命名，他们各自向Journal ofthe American Statistical Association提交了类似稿件。

“MDSC”指髓源性抑制细胞。

“CD11b”是髓性抑制细胞的标记物。

“ORR”指总反应率。

“TAA”指肿瘤/靶相关抗原。

“分泌”用于融合蛋白TAA/ecdCD40L，指融合蛋白包括引起TAA/ecdCD40L融合蛋白出现分泌的元件(如分泌或信号序列)，与诸如不允许分泌出现的细胞跨膜域等元件相反。

“抗原”泛指人、哺乳动物、鸟或其他动物对其能产生免疫应答的任何抗原或其部分。本文所用的抗原泛指含有至少一个抗原决定簇的分子，免疫应答针对所述抗原决定簇。免疫应答可以是细胞介导、体液的或两者都有。

术语“载体”是含有转录单元(亦称“表达载体”)，本文用于指体内施用时能进入靶细胞并表达编码的蛋白的病毒和/或非病毒表达载体。适合外源蛋白体内递送及表达的病毒载体已熟知且包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体等。优选使病毒载体在正常细胞中为复制缺陷型。例如，参见美国专利号6,669,942；6,566,128；6,794,188；6,110,744和5,133,029。载体能肠道外施用，如静脉内、动脉内、肌肉内、皮下等。施用还可以是口头、经鼻、直肠、透皮或雾化吸入。载体可作为大药丸(bolus)或缓慢灌注施用。本申请的载体优选皮下施用。

如本文所用，“转录单元”与表达载体相关，指作为单一、连续mRNA链由RNA聚合酶转录并包括转录起始和终止信号的一段DNA。转录单元与转录和/或翻译表达控制元件可操作连接，如启动子和可选的任何上游或下游增强子元件。有用的启动子/增强子是巨细胞病毒(CMV)立早启动子/增强子。参见美国专利号5,849,522和6,218,140。

如本文所用，“CD40配体”(CD40L)指称为CD154或TNF5的分子全长或部分。CD40L是II型膜多肽，具有N末端的胞质域、跨膜区和随后C末端的胞外域(“ecd”)。除非另有说明，全长CD40L在本文表示为CD40L。来自小鼠和人的CD40L核苷酸及氨基酸序列为本领域熟知。CD40L含义也包括序列变化，包括但不限于保守氨基酸变化等，其不改变配体引发融合蛋白相关的免疫应答的能力。

TAA/ecdCD40L疫苗平台

TAA/ecdCD40L靶向疫苗平台由至少申请人之一充分描述于多项专利和出版物。CD40L是免疫刺激蛋白。改良型CD40L蛋白即胞外域(ecd)附着TAA到树突细胞(DC)上的CD40受体以激活树突细胞和促进(使用选定粘蛋白片段)MHC I类以及II类上的人MUC-1抗原呈递，进而活化可攻击并杀死人MUC-1阳性癌细胞的T细胞。例如，参见美国专利号8,119,117,美国专利号8,299,229,和/或美国专利号9,533,036。TAA(目标相关抗原和/或肿瘤相关抗原)是用于特定癌症患者类型的感兴趣的靶抗原。在美国专利号8,299,229中，TAA是人粘蛋白抗原片段，且人MUC-1尤其是感兴趣靶抗原。因此，TAA/ecdCD40L是靶向感兴趣肿瘤(抗原特异性)的靶疫苗，与抗PD-1检查点抑制抗体相反，后者尽管结合T细胞上的PD-1受体，但不被任何特定肿瘤相关抗原(抗原非特异性)靶向。

有数种形式的此疫苗可用于本发明：(a)其中TAA/ecdCD40L转录单元包埋于复制缺陷型腺病毒载体(Ad-sig-TAA/ecdCD40L)，其用作初始引发注射，然后是至少2次皮下注射TAA/ecdCD40L蛋白；(b)其中疫苗仅由TAA/ecdCD40L蛋白组成，和(c)其中TAA/ecdCD40L蛋白的转录单元插入质粒DNA表达载体。TAA经接头连接有效免疫刺激信号CD40配体(CD40L)胞外域的氨基末端。用于本发明的优选的TAA/ecdCD40L蛋白包括粘蛋白抗原片段且是腺病毒表达载体Ad-sig-hMUC-1/ecdCD40L。用于本发明的腺病毒表达载体Ad-sig-hMUC-1/ecdCD40L构建可收集自或源自美国专利号8,299,229，本申请人之一被列作该专利的共同发明人。参见所述‘229专利的第13–16栏，其中提出了所述腺病毒载体构建的重要细节。同样，参见整个专利申请及附图中表达载体和腺病毒表达载体的讨论和描述。

TAA连接CD40L可完成两件事：(a)TAA/ecdCD40L蛋白结合树突细胞(DC)以及B细胞和T细胞上的CD40受体，激活这些细胞，从而取代CD40L信号，该信号在年长个体的CD4辅助T细胞质膜上缺失；和(b)一旦TAA/ecdCD40L蛋白结合DC的CD40受体，完整TAA/ecdCD40L蛋白内化到树突细胞(DC)中，所用方式允许TAA经I类以及II类MHC呈递途径加工。加载经活化的TAA的DC随后迁移到区域淋巴结(8)，在该处其能激活和诱导TAA特异性CD8效应T细胞的扩增。

这些抗原特异性CD8效应细胞在淋巴结中的数目增加，从淋巴结出来进入外周血。抗原特异性CD8效应T细胞离开血管内区室并进入炎症或感染的血管外位点。除了显示此疫苗增加炎症位点的抗原特异性CD8效应T细胞，已显示通过TAA/ecdCD40L蛋白活化和扩增B细胞可提高血清中的TAA特异抗体水平。

如美国专利9,533,036所示，相较于年轻、健康个体对抵御癌抗原或感染原抗原的疫苗接种，申请人的疫苗使个体的免疫应答提升，所述个体具有显示CD40配体水平降低的CD4 T细胞(这种情况中不仅包括年长个体，而且包括CD40配体水平降低的年轻个体)。这是通过给个体施用有效量的表达载体完成的，所述载体具有编码可分泌融合蛋白的转录单元，具有癌症或感染原抗原及ecdCD40配体，其中初始施用表达载体疫苗，然后是多次后续加强疫苗。同样也指出，该疫苗疗法提供至少一年的长期记忆。

尽管不想受到任何理论约束，认为皮下注射载体附近感染的细胞释放粘蛋白抗原/CD40配体融合蛋白，其随后结合抗原呈递细胞上的CD40受体，该结合的融合蛋白随之被抗原呈递细胞吸收，如Ad-sig-hMUC-1/ecdCD40L疫苗表达载体感染的细胞附近的树突细胞。然后，内化的人粘蛋白抗原在蛋白酶体中消化，所得粘蛋白抗原肽运送到内质网，在该处其会结合I类MHC分子。最终，树突细胞会在树突细胞表面上呈递结合I类MHC分子的人粘蛋白抗原。活化的、负载肿瘤抗原的抗原呈递细胞(DC)随后迁移到携带淋巴细胞的次级淋巴器官，如区域淋巴结或脾，其处于疫苗表达载体初始注射位点的淋巴引流区域。

在2周连续释放人粘蛋白抗原/ecdCD40L蛋白期间，通过存在活化和负载抗原的树突细胞，CD8细胞毒性T细胞淋巴细胞在淋巴结和脾中得到扩增，该淋巴细胞能够识别和杀死携带肿瘤相关抗原的细胞。认为通过连续从载体感染细胞中释放来持续性刺激和扩增粘蛋白抗原特异性细胞毒性T细胞，可产生免疫应答的幅度大于(greater in magnitudethan)用携带融合蛋白编码转录单元的载体所可能的，该融合蛋白由连接非分泌、未修饰的CD40配体的人粘蛋白抗原组成。在用于实验的示例中，TAA是来自人MUC-1的人粘蛋白抗原肽，尽管也能使用其他肽和其他抗原。例如，在美国专利号8,119,117中，显示使用HPV的E6或E7蛋白。在美国专利号8,299,229中，表1的第8列显示能用作TAA的粘蛋白肽。

在优选的实施方式中，所述免疫-治疗表达载体可以是病毒表达载体或非病毒表达载体；如腺病毒表达载体；抗原片段来自选自下组的粘蛋白：MUC1、MUC2、MUC3、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8、MUC9、MUC12、MUC13、MUC15、MUC16、MUC17和MUC19–MUC22；粘蛋白抗原包括来自粘蛋白胞外域的片段；或至少一个粘蛋白串联重复序列；用于本发明的粘蛋白抗原片段来自MUC1；且转录单元包括编码肿瘤抗原与CD40配体之间接头的序列。合适接头的长度和组成可变。表达载体可包括人巨细胞病毒启动子/增强子以控制转录单元的转录。肿瘤细胞可以是粘蛋白家族以外的，可以是任何种类或特点的癌细胞，所述方法引起产生细胞毒性CD8⁺T细胞针对癌细胞或粘蛋白的其他事件。癌症可以是经历失控生长、侵入或转移的对象中的任何细胞。癌症可以是骨髓性白血病、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、神经系统癌症、头颈癌、头颈鳞状细胞癌、肾癌、肺癌如小细胞肺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、结肠癌等。

检查点抑制剂

免疫应答系统的一个重要能力是其区分体内正常细胞与其视作“外来的”细胞如癌细胞的能力。此能力使免疫系统能攻击癌(外来)细胞，同时使正常细胞不受损。免疫应答所用的一种这类机制是一类(the class of)免疫“检查点”——分子，如CD8效应T细胞淋巴细胞上存在的PD-1受体。当PD-1配体在身体正常细胞上表达时，或在癌症患者的情况中，肿瘤细胞上的PD-L1结合T细胞上的PD-1受体，那些T细胞受到抑制并最终死亡。这是身体正常细胞免受免疫应答攻击的机制。这也是癌细胞能逃离免疫应答攻击的机制。施用可阻断T细胞上PD-1受体与癌细胞上PD-L1配体相互作用的抗PD-1或PD-L1抑制性抗体(包括但不限于初始施用抗体，后续多次加强抗体)，导致抑制PD-L1阳性肿瘤细胞的生长。CTLA-4是一些T细胞上用作“开关”类型的另一蛋白，其作为“开关”以保持免疫系统受控制。

PD-1是免疫细胞(称为T细胞)上的检查点蛋白。经活化的T细胞上有数种不同类型的抑制受体检查点。PD-1仅是一个示例。其正常用作一种“开关”，帮助阻止T细胞攻击体内正常细胞。但当效应T细胞上PD-1受体附着肿瘤细胞上的PD-L1时，该细胞受保护。当PD-1结合PD-L1时，其主要告诉T细胞不理携带PD-L1的细胞。一些癌细胞具有大量帮助其逃避免疫攻击的PD-L1。靶向PD-1或PD-L1的单克隆抗体能阻断此结合，从而加强针对癌细胞的免疫应答。这些抗体很有希望治疗某些癌症。当前通行做法是在2年时间段中每2到3周施用检查点抑制剂疗法，一般通过静脉输注(尽管可使用其他药物递送方法，例如通过使用纳米技术)，以达到功效。

药物递送通常关注药物存在的量和持续时间。其可包括医疗装置或药物装置组合产品。药物递送技术改变药物释放曲线、吸收、分布和消除以用于提高产物功效和安全性以及患者方便和依从性的益处。最常见的施用途径包括优选的非侵入性的口服(经口)、局部(皮肤)、经粘膜(如直肠)和吸入途径。许多药物易受酶降解影响或不能有效吸收到体循环中，这归因于出于治疗有效考虑的分子大小和电荷问题。为此，许多蛋白和肽药物必须通过注射或纳米针阵列递送。无论如何，认为用于检查点抑制剂的任意合适药物递送机制可以是除了输注以外且可以是除了使用申请人的疫苗的皮下施用方式以外。

不幸地是，检查点抑制剂抗体疗法尽管在一些癌症治疗上取得显著进步，但不靶向肿瘤特异抗原。此外，大量癌症患者不能响应这些新的免疫疗法，而这引起深入研究联合疗法以克服这类和其他问题。目前有许多进行中的研究，通过联合检查点抑制剂疗法与众多其他可能治疗选择以确定如何最大地增加检查点抑制剂功效。一些研究认为联合检查点抑制剂疗法与放疗是一种选择。其他是联合检查点抑制剂疗法与化疗。还有的探索与化放疗组合。其他一些研究使用数种新型分子。大部分专家未把免疫疗法视作传统疗法如手术、放疗和化疗的替代。同样，已知检查点抑制剂施用和安排是成本动因。申请人认为通过联合施用非靶向的PD-1检查点抑制剂抗体受体与靶向特异性肿瘤抗原(如MUC-1)的TAA/ecdCD40L疫苗，有可能这种组合会增加抗肿瘤免疫应答幅度，同时，可能减少给药和/或给药安排，这可能额外降低对患者的任何潜在毒性，包括任何副作用。

申请人认为，“冷(cold)”或非炎症性(低水平浸润CD8效应T细胞)肿瘤会响应TAA/ecdCD40L疫苗与抗PD-1抗体疗法的组合，只要用TAA/ecdCD40L疫苗疗法适当刺激，该疗法是增加小鼠TAA⁺皮下(sc)肿瘤结节中TAA特异性CD8 T细胞的靶向疗法。参见Tang YC等,(Journal of immunology 177:5697-5707,2006)中5705页的图4和5B。尽管如此，申请人理解这两种不同免疫治疗方法在其施用(皮下和输注或其他所用递送方式)和其运行方式上显著不同。检查点抑制剂是非抗原特异性的，施用抗PD-1或PD-L1抑制抗体以阻断T细胞上PD-1受体与癌细胞上PD-L1配体之间的相互作用。相反，TAA/ecdCD40L疫苗疗法是抗原特异性，经树突细胞活化来发挥作用。显然，药物开发不是一门可预测的科学。出于多种原因，联合使用2种经完全不同机制工作的独特疗法可能彼此不相容。因此，本实验的目的是评估这两种独特疗法的相容性并确定其联合使用是否相容，以及如果这样，是否可能导致任何无法接受或难以耐受的毒性副作用。为此，一些实验使患者响应至少一种药物的可能性最大化，这是通过依序治疗患者而不是同时，从而降低复合的副作用，使有效的更高剂量可行，且可能产生更低的治疗成本。实验的另一目的是观察加入或组合TAA/ecdCD40L疗法与抗PD-1抗体疗法是否实际上不仅使肿瘤从冷转变成热(hot)，并且从而增加对PD-1抗体疗法的总反应率，除了单独疫苗疗法产生的治疗效果之外。

实验方案要求用150万E3小鼠乳腺癌细胞系(对人MUC-1为阳性)注射BALB/c小鼠，允许肿瘤生长到75-100mm³(可感知)并用Ad-sig-hMUC-1/ecdCd40L疫苗和抗PD-1抗体分开处理，然后用两者组合处理并与无治疗的对照小鼠或E2对照无治疗小鼠比较，以帮助确定对一个或多个实验目的的答案。

本发明涉及在共同时间段内联合施用抗PD-1检查点抑制抗体疗法和TAA/ecdCD40L疫苗疗法，在大量的实验后，发现其在小鼠模型中提高对肿瘤结节生长的抑制效果，从而该组合对TAA阳性癌细胞的抑制效果明显高于抗体或疫苗单独用作单一疗法时的效果。阻断T细胞上PD-1受体与癌细胞上PD-L1或PD-L2配体之间相互作用的检查点抑制剂抗体示例包括例如派姆单抗(Pembrolizamab)、纳武单抗、阿特朱单抗、阿维鲁单抗(Avelumab)、替西木单抗(Tremelimumab)、易普利姆玛和德瓦鲁单抗(Durvalumab)。任何一种或多种上述示范性抗体或类似抗体在本文中命名为“检查点抑制剂”，所述抗体从检查点抑制剂的抑制效果中释放T细胞，从而使T细胞能够攻击体内肿瘤细胞。

实验描述

因此，此结果描述疫苗疗法与PD-1抗体疗法组合时，促进CD8效应T细胞进入癌性肿瘤组织，并因而认为其使冷的非炎症性癌性肿瘤组织转变成更高响应的癌性肿瘤组织。

材料和测试系统

物种 ：小家鼠(Mus musculus)

品系 ：BALB/c

来源 ：Envigo

性别和年龄 ：雌性；5-6周

体重 ：20-22g

组数 ：8

动物数/组 ：n＝10

癌细胞系 ：hMUC-1阳性的E3小鼠乳腺癌细胞系

细胞接种密度 ：在100μl无血清培养基(含20％基质胶)中，1.5x10⁶细胞/动物

细胞注射位置 ：乳腺脂肪垫(第4对)

研究开始 ：肿瘤体积(50-100mm³)

研究持续时间 ：16-18周

测试项目 ：Ad-sig-hMUC-1/ecdCD40L疫苗载体；*抗PD-1抗体

贮藏条件 ：Ad-sig-hMUC-1/ecdCD40L:-60℃

(注：这些小瓶保存于-60℃的Revco冰箱。当小瓶解冻时，小瓶在37℃水浴中涡漩，直至冰的中央核心几乎难以察觉且随后从水浴中移出)。

抗体PD-1抗体：2-8℃

剂量和给药安排：Ad-sig-hMUC-1/ecdCD40L疫苗载体-0.1X 10⁸PFU、1X 10⁸PFU、10X 10⁸PFU，在第1、8、22、40和60天

抗PD-1抗体-20μg、100μg和250μg/动物，在第1、4、7、10、13、17、20、23、40和60天

施用途径 ：皮下-Ad-sig-hMUC-1/ecdCD40L疫苗载体腹膜内-抗PD-1抗体

肿瘤体积和体重测量：每2天一次

肿瘤终点 ：注射肿瘤细胞后60天，或当肿瘤结节尺寸大于1cm(1000mm³)直径

注：抗PD-1抗体获自BIOXCELL–VivoMAb抗小鼠PD-1(CD279)；克隆:RMP1-14产品目录#:BE0146

E3细胞系

提供用于申请人实验的E3细胞系以用于此实验目的，由CRT(Cancer ResearchTechnology,Limited)授权。材料被称为E3细胞系，是人MUC-1阳性的E3小鼠乳腺癌细胞系，其细节发表于Victoria Carr-Brendel等,Cancer Research 60:2435,2000；El-NasirLalani等,Journal of Biological Chemistry266:15420,1991。

研究细节

实验的研究细节如下表I所列：

注：实验1中，给予疫苗表达载体(Ad-sig-hMUC-1/ecdCD40L)和抗PD-1抗体(组I-IV)剂量以作为单一疗法分开测试小鼠，按照上表I所示值，显示部分抑制hMUC-1阳性E3小鼠乳腺癌细胞系的生长率，在第40天，选择上面鉴定的2种治疗组合即组A和组B，用于实验2的组合疗法实验。

给药安排：尽管优选的给药安排治疗组合(疫苗和抗体)如上表1和下表2所示，用于低剂量和高剂量治疗组合，但替代的不同时间段施用可用于乳腺癌细胞系和/或不同种类的癌症，其可另外确定用于最佳总反应和总存活、测量的每个免疫相关的反应标准。优选的施用量以及施用之间的时间，也可以优选是在疫苗和抗体的单独临床应用中分开测定的那些。例如，在一些示例中，抗体施用量也可变化毫克数/每千克患者体重，其中施用是每2周或3周一次。

制备肿瘤细胞-实验1

本实验的所有细胞培养过程在层流超净台中按照无菌技术进行。E3细胞系在补充有10％胎牛血清(FBS)的培养基中生长，使用T75和T150mm培养瓶。

疫苗或抗PD-1抗体如下施用：剂量水平是已知的小鼠中治疗水平(1亿VP疫苗和100微克抗PD-1抗体)，在他情况下，剂量低于小鼠中治疗水平(1千万VP疫苗和20微克抗PD-1抗体)。动物剂量水平也可以多至250μg，这是已知的小鼠治疗水平。

与下表所示的相当的人剂量水平通常在0.1x10¹¹ VPU-1.0x10¹¹载体颗粒(VP)范围内，而抗PD-1抗体的相当的人抗体剂量水平通常在20mg-250mg范围内。一些抗体(无论PD-1、PD-L1和/或CTLA 4)的施用剂量水平是基于人体重的。例如，一些抗体的人剂量水平一般可以是2mg/kg-12mg/kg之间的任意值。

施用任何疗法和/或药物时，需要仔细考虑毒性的可能性，因此，仔细评估所提供任何治疗的多个剂量是重要的。出于这种考虑，本发明选定的剂量水平倾向于使实验剂量水平最小化，而不是最大化，应理解这些可能用作人类联合疗法施用的指南。因此，申请人在实验中选择使用申请人在未遇到毒性问题的人临床试验所用的较低的等同疫苗剂量水平，以及认为毒性作用低于人应用的较低当量疫苗剂量水平。

抗PD-1抗体的毒性：已经综述了抗PD-1抗体的毒性(J.Naidoo,DB Page和BT Li等，Toxicities of the antni-PD-1and anti-PD-1immune checkpointantibodies.Annals of Oncology 26:2375-2391,2015.)。这些副作用包括皮肤、肝、肺、胃肠道以及内分泌腺的炎症状态，其类似轻度自身免疫性疾病。因此，就治疗而言，如果有效，优选使用最低可能剂量水平的抗PD-1抗体。

申请人认为在实验2中选择性组合其TAA/ecdCD40L疫苗与检查点抑制抗体，有可能这些抗PD-1抗体相关毒性问题中的一些会减少，因为抗PD-1抗体与TAA/ecdCD40L疫苗联合时可能在低许多的剂量上有效，和/或可能需要更低剂量的抗PD-1抗体。

表2：治疗性施用和相关考虑

*第1天是乳腺脂肪垫hMUC-1阳性小鼠乳腺癌肿瘤结节

达到50-100mm³的日子。

观察和终点

·研究期间，每2天一次测量体重和肿瘤体积。

·肿瘤体积用下式计算：

肿瘤体积(mm³)＝V＝Pi/6(LD)(PD)2，其中LD＝最长径和PD＝垂直于LD的直径

·计算％肿瘤生长抑制(TGI)并与载剂对照进行统计学对比。

·同样列出并描述存活数据。

·尸检：收集肿瘤：在实验期结束时(第100天)，对所有活着的动物实施无痛致死术并从乳腺脂肪垫收获肿瘤结节。

·组织学：肿瘤组织在10％中性缓冲的福尔马林中固定24小时。然后，肿瘤组织进行处理，并制备石蜡包埋组织块。取5微米厚的薄切片，并用苏木精和伊红染色。病理学家就形态学和肿瘤中的炎症变化、多形性、

纤维血管基质、有丝分裂象和坏死区等筛选切片(slide)。

·IHC：未染色的多聚-l-赖氨酸切片用于小鼠CD8效应T细胞的IHC检测。

附图说明

图1图示了实验1中，5组(4个单一疗法组和对照)的每一组的肿瘤体积(mm³)生长vs天数(从第1天到第57天，其中在第55天，所有对照小鼠死亡)。

图1A图示了实验1中，5组(4个单一疗法组和1个对照)的每一组的肿瘤体积(mm³)生长vs多至第99天的天数，在第99天时，实验1终止。

图2是图1中图示的列表，用于图1中各单一疗法组在第一实验部分第57天的肿瘤体积，和第55天即对照组动物生命最后一天的TGI(肿瘤生长抑制)。

图3是肿瘤体积生长动力学以及实验1和实验2多至第55天的图示，描述肿瘤体积(mm³)生长vs天数。

图4是图3中图示的列表，其中所示肿瘤体积列是在实验2第55天，％T/C(肿瘤体积vs对照体积)代表第55天的肿瘤生长百分比。

图5以图示了以下的肿瘤生长动力学相比天数：仅实验1的2个单一疗法高剂量组和实验2的组合高剂量以及2个对照，直到对照动物生命最后的第55天。

图5A图示了描述以下的肿瘤生长动力学：高剂量组(实验2)，和其各高剂量单一疗法(实验1)，以及2个对照，直到实验1在第99天终止和实验2在第113天终止。

图6是图5中以下图示的列表：仅实验1和2的高剂量组及对照，以及第55天的％T/C。

图7图示了以下的肿瘤生长动力学：仅实验1的2个单一疗法低剂量组和实验2的组合低剂量以及2个对照，直到第55天。

图7A图示了以下的肿瘤生长动力学：低剂量组合(实验#2)，和其各单一疗法(实验#1)，以及2个对照，直到实验1在第99天终止和实验2在第113天终止。

图8是图7中以下图示的表格表示：仅实验1和2的低剂量组及2个对照，以及第55天的％T/C。

图9图示了以下的治疗处理(图形和表格形式)：高剂量和低剂量组合的疫苗及PD-1抗体，以及仅实验2的对照，抑制小鼠模型中E3乳腺癌的肿瘤体积生长，直到第113天。

图10图示了实验1和2的生存中值百分比，用于对照、单一疗法和高剂量组合对比，仅用于自然死亡的小鼠。

图10A图示了实验1和2的生存中值百分比，用于对照、单一疗法和低剂量组合对比，仅用于自然死亡的小鼠。

图11和11A共同描述以下的列表：E3荷瘤小鼠的生存中值KM(Kaplan-Meier)估量的处理组，用于2个对照、4个单一疗法组、高剂量组合和低剂量组合，用于自然死亡的小鼠。

图12的柱状图描述实验2中，与对照相比，用高剂量和低剂量疫苗与PD-1抗体组合治疗的E3 SC肿瘤结节小鼠中对CD8阳性细胞的细胞百分比。

图13的柱状图描述实验2中，与对照相比，用高剂量和低剂量疫苗与PD-1抗体组合治疗的E3 SC肿瘤结节小鼠中对CD11b阳性细胞的细胞百分比。

图14是图12和13中实验2描述的列表，用疫苗和PD-1抗体治疗的E3 SC肿瘤结节小鼠中对CD8及CD11b呈阳性的细胞百分比。

实验中的值表示为实验1中1-10只动物和实验2中1-5只动物的均值+/-SEM。统计分析如下进行：二因素方差分析，然后进行Bonferroni事后检验，采用Graph Pad Prism(版本5)。

关于上面参考图的所有图示，肿瘤生长曲线的突然改变归因于图中来自各分组的一只或多只动物的死亡/人道主义安乐死。

实验1评估/结果

实验1-研究TAA/ecdCD40L疫苗和抗PD-1抗体作为单一疗法(各自分开给予)施用对人MUC-1阳性E3小鼠乳腺癌细胞系生长率的影响：作为本实验总体考虑的第一部分，申请人测试TAA/ecdCD40L疫苗平台和抗PD-1抗体，施用这些中的每一个即疫苗和抗体以在各疗法单独用作单一疗法且未用于联合疗法时，分开确定其抑制肿瘤生长的治疗能力。这些治疗处理分开施用时控制本功效研究中肿瘤生长动力学的能力如图1所示，其中“y”轴代表以立方mm³计的肿瘤生长且其中“x”轴代表以天数计的时间，以及如图2所示的表格，另外以表格形式列出图1所记录的数据。

如本说明书的表1和2所部分反映的，首先用E3乳腺细胞系注射小鼠，然后在约40天后，当肿瘤生长约为76mm³时，开始组合研究。0.1x10⁸PFU与AB20的低剂量组合组以及1.0x10⁸PFU与AB100的高剂量组合组在实验2的第1天各自随之开始。初始可应用载体疫苗皮下注射(高或低剂量组合组)，各自接下来是第8、22、40和60天的其各(高或低剂量)载体疫苗加强。同时，初始PD-1抗体施用(腹膜内)也在第1天开始(用于各高剂量和低剂量组合组)，随后其分别(高剂量或低剂量)加强在第4、7、10、13、17、20、23、40和60天施用。应注意尽管疫苗加强也是载体，融合蛋白加强可在第一载体疫苗注射后施用，如申请人于2014年9月9日提交的美国专利号8,828,957所示。应理解尽管本实验中的组合施用期为60天，但组合施用期可以是例如120天、180天、360天和/或2年。或者，疫苗与药物的组合施用能在任何时间点停止，例如在初始6天阶段后，从而任一检查点抑制剂或疫苗可随后作为单一疗法继续。根据毒性和其他确定在对象最大利益范围内的问题，考虑所有这些可能性。

如所示，实验的这一部分进行57天的时期，到第55天，所有对照动物死亡。如所示，与对照组所示未处理对照小鼠的肿瘤结节生长相比，TAA/ecdCD40L疫苗与抗PD-1抗体测试的所有剂量抑制正在生长的肿瘤结节的生长。实验1进行57天的时期，从基线或第1天开始，其中如前所述，y轴的基线肿瘤体积是图1上的76mm³。

尽管其他图描述实验继续和覆盖超过55天阶段，认为该55天时期是实验1的更具代表性图片，因为对照小鼠存活直至第55天，从而在55天阶段后没有与对照相比的比较。然而，就实验1以及实验2而言，生存和辅助考虑是继续试验超过第100天的基础。

在实验1中，有5个实验组，各有10只小鼠。有“对照”组VI，其中没有给予治疗。有2个不同的疫苗剂量组。一个疫苗剂量组I是0.1x10⁸VP且另一疫苗剂量组II是1.0x10⁸VP。有2个PD-1抗体剂量水平组。第一抗体组III用20μg处理，第二抗体组IV用100μg处理。如图1和图2所示，各个治疗性单一疗法处理(疫苗和PD-1抗体)都具有减缓或抑制肿瘤生长的能力。各疫苗和抗体的剂量水平越高，显示对引起肿瘤生长减慢更有效。然而，肿瘤生长仍在所有情况下发生。此示例中，当治疗剂在第1天初始施用时，基线读数是图1所示的76mm³。图1A描述当实验1终止时，从第55天到第99天达到的单一疗法生长动力学。

在图2的表格中，在题为“肿瘤体积(mm3)”的中间列内，数字“n”指仍然活着的动物数目。应注意在该第一实验的第57天，肿瘤生长导致一些动物死亡。基于图1所示肿瘤生长曲线的观察，决定在第40天从多个肿瘤生长曲线中选择用于实验2的组合(PD-1剂量和疫苗剂量)疗法。在此基础上，确定组合低剂量疫苗0.1x10⁸PFU与AB20μg作为A组联合疗法以用于实验2，另外，组合高剂量疫苗1.0x10⁸PFU与AB100μg作为B组联合疗法以用于实验2。对照命名为组C以用于实验2。这三组在实验2中的小鼠数各是5只小鼠。用于实验2的小鼠与实验1所用小鼠是同一来源和同一物种及品系。因此，实验2在实验1的第40天开始，而实验1继续。

实验2评估/结果。

联合治疗性施用试验：肿瘤生长：图3和4描述用于实验1和2每一个的2条对照曲线，实验1的疫苗和抗体单一疗法曲线，以及高剂量组(1.0x10⁸PFU和AB100ug)和低剂量组(0.1x10⁸和AB20μg)的2种联合疗法。当疫苗疗法和抗体AB疗法联合时，即作为联合疗法在共同时间段内施用，其中所述2种组合疗法在同一时间和/或不同时间施用，不仅该组合确实成功抑制或增加抑制肿瘤生长超过分开施用疫苗或抗体单一疗法所实现的，而且高剂量疫苗与AB100组联合甚至能在早期引起肿瘤退行低于基线，大致在第8天到第20天之间，如图3所示。

如上表1和2所部分反映的，且类似于实验1，小鼠首先用E3乳腺细胞系注射，然后在约40天后，当肿瘤生长约为75mm³时，研究如下开始：皮下注射载体疫苗与抗体组合以用于各动物组A和B(高和低剂量组合)，然后是分别在第8、22、40和60天用载体疫苗剂量水平，以及在第4、7、10、13、17、20、23、40和60天用PD-1抗体剂量水平的加强(适合不同动物组的高和低剂量)。应再次注意，尽管疫苗加强也是载体，融合蛋白加强可在初始载体疫苗注射后施用，如申请人的美国专利号8,828,957所示。如所述，联合疗法在第1、40和60天施用。初始剂量在同一天施用且最后的2个剂量在同一天施用(第40和60天)。剩余的治疗加强(疫苗和抗体)尽管在共同时间框内施用，但各自在不同日子施用。

图4的列表描述图3的结果，实验2第55天与实验1第55天比较，包括实验1和2的对照(组VI和组C)，单一疗法分开施用疫苗和抗体以用于高剂量和低剂量(组I-IV)，联合疗法用于(组A和B)的每一组。从代表第55天肿瘤体积的图4肿瘤体积列中，从T/C百分比(第55天的肿瘤体积相对对照体积)中，联合疗法的优势显示超过叠加。事实上，在高剂量和低剂量的各情况中，所述增长接近或大于2倍增长。例如，在图4的右侧列中，高剂量％T/C(肿瘤生长相对于对照生长的百分比)是20％，而高剂量单一疗法(0.1x10⁸PFU疫苗和AB20)分别为36％和37％。

从不同角度和稍微提前一些看，在实验1的第43天和实验2的第43天，通过各用于实验1单一疗法和实验2联合疗法的近似测量，单一疗法高剂量疫苗肿瘤体积均值为228mm³，单一疗法AB100高剂量肿瘤体积均值为237mm³，而联合疗法高剂量肿瘤体积均值为116mm³。尽管后一种联合疗法的肿瘤抑制能力是本实验充满希望的一个目标，然而，由于本说明书推进的许多原因，没有预料到抑制程度是令人惊讶的。

而另一示例，在实验1的第43天和实验2的第43天，通过各用于实验1单一疗法和实验2联合疗法的的近似测量，单一疗法低剂量疫苗肿瘤体积均值为323mm³，单一疗法AB20低剂量肿瘤体积均值为343mm3，联合疗法低剂量肿瘤体积均值为153mm³。

图5和6提供实验2中单独高剂量组合与实验1中高剂量疫苗和抗体单一疗法分开施用的比较。图5A描述高剂量图形(用于各单一疗法和联合疗法)，延长至第113天当实验2终止时。类似地，到第55天，图7和8提供实验2中低剂量组合与实验1中低剂量疫苗和抗体单一疗法分开施用的比较。图7A描述延长至第113天当实验2终止时的低剂量图形。图9另外描述低和高剂量联合疗法的生长动力学，与实验2的对照比较，其中实验2持续到第113天，出于生存考虑，申请人继续发现所示高剂量组合是更优选的组合，描述显著更好生长抑制。

联合治疗施用：生存：对于高剂量组合联合试验中的动物存活，如图10所示，同样令人惊讶和意外的是，高剂量组合治疗的小鼠生存相当长的时间，如图11A所示，其中使用E3荷瘤小鼠生存中值的Kaplan-Meier估量，高剂量组合组A的KM生存中值为99.5，显著超过所有其他组。图10A和11(KM生存中值表)描述低剂量联合疗法的生存情况。

作为实验的一部分，在所有治疗组的肿瘤切片免疫组化分析后进行CD8和CD11b阳性细胞的定量评价，以评估观察到的病理变化。开发用于各CD8和CD11b染色的方案。在每一种情况中，就各切片而言，针对CD8和CD11b标记计数来自3个不同显微视野的300个细胞。针对CD8和CD11b标记，从300个细胞计算阳性细胞百分比。

如图12所示，实验2中，每一种情况下疫苗疗法与PD-1抗体疗法的联合治疗处理明显诱导阳性CD8效应T细胞百分比相较于对照增加。高剂量组合的CD8阳性细胞百分比略高于低剂量组合。对照(无治疗)组中没有观察到阳性CD8细胞。较高剂量组的误差条没有与未治疗对照小鼠的误差条重叠。因而，此结果描述疫苗疗法与PD-1抗体疗法联合时，促进CD8效应T细胞进入癌性肿瘤组织，并因此认为其使从冷的非炎症性癌性肿瘤组织转变成更高响应的癌性肿瘤组织。

同时，如图13所示，较高剂量组合的抗体与疫苗疗法治疗引起CD11b阳性细胞百分比相较于对照减少。低剂量组合治疗的CD11b阳性细胞百分比略高于高剂量组合治疗。对照(未治疗)组的CD11b阳性细胞最多。CD11b是髓系抑制细胞的标记。因此，TAA/ecdCD40L疫苗-PD-1抗体组合治疗改变E3肿瘤结节的微环境，如图13所示。因而，认为TAA/ecdCD40L疫苗与PD-1抗体的组合治疗使免疫调节环境从抑制性转变成免疫刺激性。这进一步描述于图14的列表，显示相较于对照，CD8效应T细胞百分比增加和CD11b阳性细胞百分比减少。

CD11b细胞(也称为髓源性抑制细胞或MDSC)百分比减少是正指标，因为其已知抑制T细胞增殖和活化。在慢性炎症疾病(病毒和细菌感染)或癌症情况下，髓系分化偏向MDSC扩增。这些MDSC浸润炎症位点和肿瘤，在该处其通过抑制例如T细胞和NK细胞(自然杀伤细胞)来终止免疫应答。MDSC也通过表达细胞因子和诸如TGF-β等因子来加速血管生成、肿瘤进展及转移。临床和实验证据显示有高浸润MDSC的癌性组织与患者预后差和对治疗有抗性相关。因此，它们成为关键靶标，在本情况中，提供关于联合疗法相比单一疗法显著改善的额外支持。

尽管不想受任何理论约束，但根据实验结果，认为不响应非靶向的抗PD-1抗体疗法的非炎症性或冷肿瘤(低水平的浸润CD8效应T细胞)变成响应PD-1抗体疗法与组合靶向疫苗疗法的热肿瘤，增加小鼠TAA皮下肿瘤结节中的TAA特异性CD8 T细胞。也认为由于靶向和非靶向方式与不同类型治疗施用(皮下和腹膜内)在一起，这产生想要的效果，在功效和生存方面具有显著治疗作用。

总之，尽管如此，主张全部实验结果证明Ad-sig-hMUC-1/ecdCD40L疫苗疗法，除了其诱导治疗反应的自身能力外，还用作催化剂和/或刺激剂以能够增加对PD-1抗体疗法的总治疗反应率，包括存活时间增加以延长生命。显然，2种疗法之间相互作用和/或协作以在不可预测的癌症免疫治疗领域产生意外显著改善，并提交其作为治疗癌症患者的新型方法。因此，申请人的发明提供疫苗疗法，与PD-1抗体疗法联合时，认为显示双重治疗能力。

当然，应理解额外疫苗加强、额外抗体加强和/或其他叠加形式的疗法可能在上面所鉴定共同时间段内和/或之外另外施用，这碰巧选定用于实验目的的60天。同样，联合疗法应用的共同时间段可能是90、120或甚至180天或更长。用于任意一个或多个患者的联合疗法可能持续到长至目前仅施用检查点抑制剂抗体疗法的规定时间段，对于许多来说是2年的时期。还可能有剂量变化。例如，尽管初始剂量可以是载体，加强能是融合蛋白。其他变化可包括不同剂量水平的剂量加强。例如，初始抗体剂量可以是100mg，相继的抗体加强可以是80mg。上面实验的目的是确定TAA/ecdCD40L疫苗与抗体疗法的组合如果在共同时间框内应用，是否能生成一些形式的相互作用和/或协同作用，和/或用作催化剂，而不产生严重副作用，会提高对癌症患者的治疗和/或存活效果。

实验研究的一些结论

1.疫苗与PD-1抗体的组合具有抑制E3肿瘤细胞生长的效力，是任一单独疗法的至少2倍。

2.两种疗法的组合提供一种或多种在各疗法用作单一疗法时无法获得的益处。

3.联合疗法中的每一种都提供有意义的贡献，以大幅提高组合的总体效果(功效、持续时间和/或安全性)。

4.Ad-sig-hMUC-1/ecdCD40L治疗的小鼠(组II)存活长于(71天)未治疗的对照小鼠(组VI或C，分别为56天和62.5天)。

5.抗PD-1治疗的小鼠(组IV)存活长于(75天)未治疗的对照小鼠(56天或62.5天)。

6.TAA/ecdCD40L疫苗与抗体(组A)组合治疗的小鼠存活(99.5天)长于用疫苗单一疗法(71天)或抗体单一疗法(75天)单独治疗的小鼠。

7.TAA/ecdCD40L疫苗与抗PD-1抗体组合治疗可在肿瘤结节中诱导CD8效应T细胞增加，并另外促进髓源性抑制细胞(MDSC)减少，从而使免疫调节环境从抑制性转变成免疫刺激性。

多重优势

如申请人实验所证实，认为在以本说明书所述方式使用Ad-sig-hMUC-1/ecdCD40L疫苗与检查点抑制剂(例如PD-1)的联合治疗方式时发现一些显著优势，例如：

与当前常规或标准时间段的PD-1治疗用药相比，TAA/ecdCD40L疫苗疗法与检查点抑制剂抗体疗法共同增加进入肿瘤结节的抗原特异性T细胞数目，引起功效增强，对象中正常组织(非癌性肿瘤)的破坏减少，这归因于抗原靶向疫苗和使用剂量水平可能减少的抗体和/或在较短时间段内施用剂量。或者，更大人群的癌症患者可能被所述组合成功治疗。

可获得更长的生存期，同时功效提高。

通过使用较低剂量水平和/或数目的抗体施用/输注与治疗性TAA/ecdCD40L疫苗施用组合，减少患者的毒性问题而不削弱临床功效。

减少施用检查点抑制剂疗法的患者所需的剂量频率可能降低抗体施用相关成本而不削弱功效，所述患者目前在2年时期内每2-3周施用。

采用TAA/ecdCD40L疫苗平台与检查点抑制剂的组合，可通过生存更长时间段使患者受益，因为疫苗疗法先前显示额外提供免疫治疗记忆。

如下增加总体治疗效力：a)靶向感兴趣的肿瘤抗原和b)扩大响应联合免疫疗法的患者百分比，与会响应单独疫苗单一疗法或单独抗体单一疗法的患者百分比相反。

疫苗疗法与PD-1抗体疗法组合时，被认为使冷的非炎性的癌性肿瘤组织转变成更高响应的热的且炎性的癌性肿瘤组织。

上述多种优势强调2种疗法以适当剂量水平组合使用时的相互作用，产生的总协同和/或互补效应大于2种疗法各自单独用作单一疗法时的总和。

Claims (38)

1.一种治疗个体中癌症的免疫治疗方法，所述方法包括在共同时间段内给个体联合施用TAA/ecdCD40L疫苗疗法和检查点抑制剂抗体疗法，包括在所述共同时间段内多次施用各所述疗法的相继的加强，以产生大于疫苗或检查点抑制剂单独用作单一疗法时的治疗效果。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述TAA/ecdCD40L疫苗疗法包括表达载体Ad-sig-hMUC-1/ecdCD40L。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述疫苗疗法是抗原特异性的且是皮下施用的，并且所述检查点抑制剂抗体疗法是抗原非特异性的且是经输注施用的。

4.如权利要求1所述的方法，其中初始疫苗疗法施用是在所述共同时间段的第1天，然后是至少4次相继的疫苗疗法加强，且初始检查点抑制剂抗体疗法施用是在所述共同时间段的第1天，然后是至少9次相继的检查点抑制剂抗体疗法加强，所述初始施用和加强都在所述共同时间段内施用，所述共同时间段是至少60天的时期。

5.如权利要求2所述的方法，其中所述疫苗疗法的剂量水平范围是0.1x 10¹¹VPU-1.0x10¹¹VPU。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述检查点抑制剂抗体疗法的剂量水平范围是20mg-250mg。

7.如权利要求5所述的方法，其中所述检查点抑制剂抗体疗法的剂量水平范围是2-12mg/千克(kg)。

8.一种治疗个体癌症的药物免疫疗法组合，包括适合给个体施用的检查点抑制剂抗体疗法组分，包含其额外加强，和适合给个体施用的TAA/ecdCD40L疫苗疗法组分，包含其额外加强，其中在所述组分的每一种的有效治疗量，与通过任一所述疗法组分单独施用的个体免疫应答的任何增加相比，联合施用具有增加个体免疫应答以治疗癌症的能力。

9.如权利要求8所述的药物免疫疗法组合，其中所述检查点抑制剂抗体疗法组分配置成通过输注施用且所述TAA/ecdCD40L疫苗疗法组分配置成皮下施用。

10.如权利要求8所述的药物免疫疗法组合，其中与用作单一疗法的2种治疗组分中任一种相比，各剂量水平的2种治疗组分联合施用能抑制癌生长和增加生存能力。

11.如权利要求8所述的药物免疫疗法组合，其中所述各剂量水平的2种治疗组分配置成产生联合治疗效果，所述效果会(a)与2种治疗组分中任一种用作单一疗法时会诱导的相比，诱导针对癌的CD8 T细胞数目增加，和(b)与用作单一疗法的2种治疗组分中任一种相比，诱导髓源性抑制细胞减少。

12.如权利要求8所述的药物免疫疗法组合，其中所述疫苗疗法组分的剂量水平范围是0.1x 10¹¹VPU-1.0x 10¹¹VPU。

13.如权利要求12所述的药物免疫疗法组合，其中所述抗体疗法组分剂量水平范围是20mg-250mg。

14.如权利要求12所述的药物免疫疗法组合，其中所述检查点抑制剂抗体疗法组分剂量水平范围是2-12mg/kg。

15.如权利要求9所述的药物免疫疗法组合，其中所述检查点抑制剂抗体疗法组分是PD-L1抗体且所述TAA/ecdCD40L疫苗疗法组分是表达载体Ad-sig-hMUC-1/ecdCD40L。

16.如权利要求9所述的药物免疫疗法组合，其中所述检查点抑制剂疗法抗体组分是PD-1抗体且所述TAA/ecdCD40L疫苗疗法组分是表达载体Ad-sig-hMUC-1/ecdCD40L。

17.一种用权利要求8所述的药物免疫疗法组合治疗癌症患者的方法，其中所述单独治疗组分的每一种在共同时间段内施用，其中所述组分的每一种能在不同时间施用或同时施用，但在所述共同时间段内施用，其中两种组分都在共同时间段的第1天初始施用。

18.如权利要求17所述的治疗癌症患者方法，其中所述共同时间段是至少60天，且其中各疗法的2次或更多次加强在同一天施用，而其他的所述各疗法加强不在同一天施用。

19.一种治疗癌症患者的药物组合，所述组合包括2种单独的免疫治疗组分，包括多个以一种剂量水平输注施用的抗原非特异性检查点抑制剂抗体疗法组分，和多个以第二剂量水平皮下施用的抗原特异性TAA/ecdCD40L疫苗疗法组分，其中TAA是粘蛋白片段，所述疫苗疗法组分与检查点抑制剂抗体疗法组分联合施用，所述组分的每一种分别配置成在所述第一和第二剂量水平的有效量，通过增加检查点抑制剂疗法组分效力来增强患者免疫应答，提供与用作单一疗法的各组分相比提高的免疫应答益处。

20.如权利要求19所述的药物组合，其中所述组合包括疫苗疗法剂量水平的疫苗治疗组分初始注射和至少4次疫苗加强，以及抗体疗法剂量水平的检查点抑制剂抗体治疗组分初始输注和至少10次抗体加强。

21.如权利要求19所述的药物组合，其中所述TAA/ecdCD40L疫苗疗法组分是表达载体Ad-sig-hMUC-1/ecdCD40L。

22.如权利要求20所述的药物组合，其中所述有效剂量水平的2种组分联合施用诱导组合治疗效果，能够抑制癌性肿瘤生长和延长患者生存时间，超过用作单一疗法的所述治疗组分。

23.如权利要求21所述的药物组合，其中所述疫苗疗法组分的剂量水平范围是0.1x1.0¹¹VPU-1.0x 10¹¹VPU。

24.如权利要求21所述的药物组合，其中所述检查点抑制剂抗体疗法组分的剂量水平是20mg-250mg或2-12mg/kg范围内的PD-1或PD-L1抗体。

25.如权利要求19所述的药物组合，其中所述有效剂量水平的2种组分组合能够诱导联合治疗效果，比2种组分中任一种单独作用产生更大数目的CD8 T细胞。

26.如权利要求1所述的方法，其中所述2种疗法可在不同时间施用或同时施用，但在所述共同时间段内施用。

27.一种通过联合2种不同免疫疗法治疗在至少60天的共同时间段内给患者施用的治疗患者癌症的方法，所述方法包括体内输注施用的检查点抑制剂抗体治疗以提供阻断患者T细胞结合的疗法，和体内皮下施用的表达载体Ad-sig-hMUC-1/ecdCD40L疫苗治疗以通过患者树突细胞激活而诱导治疗，其中初始检查点抑制剂抗体以第一剂量水平施用，然后是与第一剂量水平相同的至少数次相继的抗体加强，其中初始疫苗以第二水平施用，然后是与第二剂量水平相同的至少数次相继的疫苗加强，所述初始施用都在所述60天阶段的第1天发生，所述加强在所述共同时间段施用。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述疫苗治疗的剂量水平范围是0.1x 10¹¹VPU-1.0x 10¹¹VPU。

29.如权利要求27所述的方法，其中所述检查点抑制剂抗体是PD-1抗体且治疗剂量水平范围是20mg-250mg。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述检查点抑制剂抗体是PD-L1抗体且治疗剂量水平范围是2mg/kg-12mg/kg。

31.如权利要求27所述的方法，其中所述视作冷的患者癌性肿瘤通过所述疫苗治疗转变成视作热的癌，从而增加患者癌症治疗的总反应率。

32.如权利要求8所述的药物免疫治疗组合，其中所述视作包括冷肿瘤的个体的癌症可通过所述疫苗疗法组分从冷肿瘤转变成热肿瘤，从而增加患者对所述检查点抑制剂抗体疗法组分的总反应率。

33.一种用于治疗患者的药物免疫治疗组合，所述组合由第一剂量水平的抗原特异性疫苗组分Ad-sig-hMUC-1/ecdCD40L和第二剂量水平的抗原非特异性抗体组分组成，所述抗原特异性疫苗组分包括多次单独疫苗皮下治疗加强，所述抗原非特异性抗体组分包括多次抗体组分输注治疗加强，其中所述疫苗组分和抗体组分配置成有效剂量水平的量，从而能够使疫苗组分用作催化剂以增加抗体组分功效，其中与用做单一疗法的任一所述组分相比，所述组合适合增强患者针对癌症的免疫应答。

34.如权利要求33所述的药物免疫治疗组合，其中所述配置的剂量水平的量能够诱导CD8效应T细胞百分比增加和诱导髓源性抑制细胞(MDSC)百分比减少。

35.如权利要求33所述的药物免疫治疗组合，其中所述抗体组分是PD-1或PD-L1抗体。

36.如权利要求33所述的药物免疫治疗组合，其中所述剂量水平的抗原特异性疫苗组分具有使视作冷的癌症患者肿瘤转变成视作热的肿瘤的能力，从而与用做单一疗法的抗体相比，增加癌对抗体的总反应率。

37.如权利要求33所述的药物免疫治疗组合，其中通过各剂量水平的疫苗组分和抗体组分实现所述患者免疫系统增强，所述组分配置成协助促进免疫调节环境从抑制性转变成免疫刺激性。

38.如权利要求4所述的方法，其中所述疫苗疗法加强在第8、22、40和60天施用，所述抗体加强在第4、7、10、13、17、20、23、40和60天施用。

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