CN111303268A

CN111303268A - 子宫肌瘤新抗原、其应用和子宫肌瘤疫苗

Info

Publication number: CN111303268A
Application number: CN202010160459.3A
Authority: CN
Inventors: 陶英亮; 毛力真
Original assignee: Jiangsu Lanen Biotherapy Technology Research Institute Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Lanen Biotherapy Technology Research Institute Co Ltd
Priority date: 2020-03-10
Filing date: 2020-03-10
Publication date: 2020-06-19
Anticipated expiration: 2040-03-10
Also published as: CN111303268B

Abstract

本发明公开一种子宫肌瘤新抗原，其选自氨基酸序列如SEQ ID NO：1至9中任一项所示的多肽中的至少一种。本发明提供的子宫肌瘤新抗原可用于制备预防子宫肌瘤和/或治疗子宫肌瘤和/或预防子宫肌瘤复发的药物。本发明还提供了一种子宫肌瘤疫苗，其包括本发明的子宫肌瘤新抗原以及一种或多种医药上可接受的载体。本发明提供的子宫肌瘤疫苗的靶向性好、效果显著、副作用小。

Description

子宫肌瘤新抗原、其应用和子宫肌瘤疫苗

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及子宫肌瘤新抗原、子宫肌瘤新抗原在制备预防子宫肌瘤和/或治疗子宫肌瘤和/或预防子宫肌瘤复发的药物中的应用和一种子宫肌瘤疫苗。

背景技术

子宫肌瘤，又称子宫平滑肌瘤，是妇科常见的一种良性肿瘤，多发于30岁-50岁之间的女性，发病率高达20％-40％，其临床主要症状为：腹胀、腹痛、尿频、尿急，不规则性阴道出血导致月经出血过多，时间过长。经期腹胀腹痛最为严重，性交时伴有出血、性欲减退等症状。症状的轻重与肌瘤的大小和生长的部位都有一定的关系。患者一旦被查出患有子宫肌瘤，一般还会出现情绪紧张、睡眠质量下降等症状，工作、生活学习、夫妻生活都会受到一定影响，必需采取积极有效的治疗方案。

目前，子宫肌瘤临床上多以手术治疗为主，而子宫肌瘤容易复发，75-95％会在手术后2-3年复发，为了防止复发，常采取将整个子宫全部切除的治疗方案。然后，子宫切除后，人体的整个血液循环以及女性特有功能都会有所改变，并伴随有精神上的打击，最终可能会导致人体提前衰老，且严重影响夫妻生活，甚至可能导至婚姻破裂。切除子宫是子宫肌瘤患者万不得已的选择。因此，需要找到更好地治疗子宫肌瘤、预防子宫肌瘤复发的新方法。

免疫治疗通过调动机体的免疫系统，调动T细胞和免疫记忆来杀伤肿瘤细胞，具有靶向性好、副反应低、无损伤等优势。肿瘤新抗原疫苗是免疫治疗的一种，是一种精准的医疗策略，通过找出患者肿瘤组织特有的体细胞突变，分析出这些突变产生的新抗原，制备能够被患者组织相容性复合体(MHC)特异识别的新抗原疫苗，注入患者体内，激活特异性T细胞应答和免疫风暴，可以特异性靶向癌细胞，理论上可以做到消除所有肿瘤及其转移灶，防止肿瘤复发。

新抗原(neoantigens)，是指在正常组织中不表达，而仅在肿瘤组织表达的抗原，包括致瘤病毒整合进基因组产生的抗原和突变蛋白产生的抗原。新抗原不仅具有高特异性，而且因其未经胸腺阴性筛选还具有强免疫原性。目前肿瘤新抗原研究，都是集中在恶性肿瘤，良性肿瘤或癌前病变中肿瘤新抗原的表达鲜少涉及。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能有效应用于预防子宫肌瘤和/或治疗子宫肌瘤和/或预防子宫肌瘤复发的新抗原以及疫苗。

根据本发明的一个方面，提供了一种子宫肌瘤新抗原，其选自氨基酸序列如SEQID NO：1至9中任一项所示的多肽中的至少一种。

本发明提供的子宫肌瘤新抗原针对的是存在于MED12基因或NT5DC1基因的特异性突变，主要针对MED12-G44V突变和NT5DC1-C399Y突变，但不仅局限于这两种突变。

本发明提供的子宫肌瘤新抗原可用于制备预防和/或治疗人类或其他哺乳动物的子宫肌瘤、或者预防人类或其他哺乳动物的子宫肌瘤复发的药物。

在一些实施方式中，可应用于制备预防子宫肌瘤和/或治疗子宫肌瘤和/或预防子宫肌瘤复发的疫苗。

根据本发明的另一个方面，提供了一种子宫肌瘤疫苗，包括上述的子宫肌瘤新抗原以及一种或多种医药上可接受的载体。

本发明提供的子宫肌瘤疫苗，不仅可以用于治疗子宫肌瘤，而且还可以用于预防子宫肌瘤的发生和复发。当未患子宫肌瘤的健康人或手术后的子宫肌瘤患者注射本发明的疫苗后，体内会产生靶向本发明中子宫肌瘤新抗原对应的突变位点的特异性杀伤性T细胞和记忆T细胞，在正常细胞基因突变的过程中，若产生相关的突变，体内已存在的T细胞能够迅速识别并清除携带突变的细胞，从而有效的预防子宫肌瘤的发生。

在一些实施方式中，载体可以为抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)。

在一些实施方式中，抗原提呈细胞可以选自树突状细胞(dendritic cells，DC)、B淋巴细胞、单核-巨噬细胞等APC中的一种或多种。

在一些实施方式中，APC可以来自患者本身，也可以来源于异体供者。

在一些实施方式中，可以通过将子宫肌瘤新抗原与抗原提呈细胞共培养，以将子宫肌瘤新抗原负载在抗原提呈细胞上，从而获得预防子宫肌瘤和/或治疗子宫肌瘤和/或预防子宫肌瘤复发的疫苗。

在一些实施方式中，子宫肌瘤疫苗的组成还可以包括免疫佐剂。

在一些实施方式中，免疫佐剂可以选自TLR9的激动剂、poly-ICLC(CAS：59789-29-6)、γ-干扰素中的一种或多种。

在一些实施方式中，TLR9的激动剂可以为全硫代修饰的富CpG序列的非甲基化寡聚脱氧核苷酸，其中，富CpG序列的非甲基化寡聚脱氧核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。

在一些实施方式中，每1×10⁴个抗原提呈细胞，子宫肌瘤疫苗中子宫肌瘤新抗原的添加量可以为50-500μg，TLR9的激动剂的添加量可以为20-150μg，γ-干扰素的添加量可以为0-1800单位。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明对良性肿瘤子宫肌瘤的肿瘤新抗原进行了研究，发现了子宫肌瘤的新抗原，并应用其预防子宫肌瘤和/或治疗子宫肌瘤和/或预防子宫肌瘤复发，提供了一种新的预防子宫肌瘤和/或治疗子宫肌瘤和/或预防子宫肌瘤复发的方法。肿瘤新抗原是区分肿瘤细胞和正常细胞的特异性靶点，是肿瘤免疫细胞治疗的最佳靶点，与其它治疗方法相比，运用新抗原疫苗对子宫肌瘤进行预防或治疗，靶向性更好、副作用更小。

(2)本发明提供的子宫肌瘤新抗原针对的是存在于MED12基因或NT5DC1基因的特异性突变，主要针对MED12-G44V突变和NT5DC1-C399Y突变，但不仅局限于这两种突变。MED12基因突变发生在70％的子宫肌瘤，因此，利用本发明提供的子宫肌瘤新抗原制备的子宫肌瘤疫苗与其他肿瘤疫苗相比，更具有普适性和通用性。

(3)本发明提供的9条子宫肌瘤新抗原，两条或以上新抗原组合运用制备得到的子宫肌瘤疫苗的免疫效果强于利用单条新抗原制备得到的子宫肌瘤疫苗。利用多条新抗原制备得到的子宫肌瘤疫苗，多条疫苗肽在体内被酶切成的短多肽，这些短多肽，有些可以被I型HLA递呈刺激CD8⁺细胞的产生，有些可以被II型HLA递呈刺激CD4⁺细胞的产生。CD4⁺细胞分泌的细胞因子会刺激更多的CD8⁺细胞产生并聚集，从而更有效的杀伤肿瘤细胞。CD4⁺细胞和CD8⁺细胞与HLA之间的协同增效作用，能够产生更强的免疫反应。

(4)目前针对肿瘤治疗的靶向药大多数是靶向单个靶点，长时间的用药容易产生耐药性。本发明提供的子宫肌瘤疫苗可以通过不同靶点的新抗原的组合使用，使制得的子宫肌瘤疫苗可以同时靶向2个靶点，双靶点的治疗方案可以有效降低肿瘤的耐药发生概率，使得治疗效果更佳更持久。

(5)本发明提供的子宫肌瘤疫苗，运用时，不需要经过基因组测序、数据分析及疫苗定制等步骤，只需要简单的个别突变位点检测，就能够直接用于携带有突变的患者，将患者等待治疗的时间从70-90天缩短到1-2天，能够避免患者错过最佳治疗的时间，也可以大幅度降低医疗成本。

附图说明

图1表示利用ELISPOT法检测的子宫肌瘤新抗原激活的CTL的活性；

图2表示子宫肌瘤疫苗对子宫肌瘤细胞的杀伤活性。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。

本发明实施例中，外周血、子宫肌瘤肿瘤组织、非子宫肌瘤正常组织等标本取自于2019年1月至8月在常州武进人民医院进行子宫肌瘤手术治疗的8例经病理确诊的子宫肌瘤患者，均知情同意并签署书面书，8名患者年龄25-55岁。通过对患者子宫肌瘤肿瘤细胞和非子宫肌瘤正常组织细胞进行基因组全外显子测序发现，8例患者子宫肌瘤肿瘤细胞中均同时存在MED12-G44V突变和NT5DC1-C399Y突变。

实施例1新抗原与相应的MHC的结合能力

利用亲和力分析软件NetMHC软件对SEQ ID NO：1至9所示的新抗原以及其对应的野生型多肽与相应的主要组织相容性分子(MHC)的结合能力进行分析，结果如表1所示。新抗原与相应MHC的结合能力通过达到稳定MHC-抗原多肽结合所需要的抗原多肽最低浓度表示。浓度(亲和力数值)越低，表示新抗原与MHC分子的结合越稳定，其抗原原性就越强，能更好地刺激特异性T细胞的增殖。

表1新抗原以及其对应的野生型多肽与相应的MHC的结合能力

由表1的结果可知，SEQ ID NO：1至9所示的子宫肌瘤新抗原与相应MHC的结合能力均显著高于其对应的野生型多肽与MHC的结合能力。

实施例2新抗原的合成

9条新抗原的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1至9所示，委托金斯瑞生物科技有限公司合成，纯度大于99％，HPLC级，无RNA酶。

实施例3全硫代修饰的富CpG序列的非甲基化寡聚脱氧核苷酸的合成

选择TLR9的激动剂--全硫代修饰的富CpG序列的非甲基化寡聚脱氧核苷酸作为子宫肌瘤疫苗的佐剂之一，富CpG序列的非甲基化寡聚脱氧核苷酸的核苷酸序列为：5’-TCGTCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT GGG G-3’(SEQ ID NO：10)。委托金斯瑞生物科技有限公司合成并全硫代修饰该富CpG序列的非甲基化寡聚脱氧核苷酸，即得全硫代修饰的富CpG序列的非甲基化寡聚脱氧核苷酸，一次合成21.8mg，约等于600OD。

实施例4子宫肌瘤疫苗的制备

在患者知情同意的情况下，分别针对每位患者进行操作。

I、PBMC制备

(1)取患者外周血10mL；

(2)取50mL离心管中，加入15mL分离液(人全血单个核细胞FICOLL分离液，购于上海华精生物高科技有限公司)，然后用25mL移液管吸取外周血样本加在分离液液面上，600g离心25min；

(3)用10mL移液管小心吸取第一层血浆，弃掉，然后吸取第二层乳白色淋巴细胞并转移到新的50mL离心管中；

(4)向淋巴细胞中加入质量分数为0.9％的生理盐水，使每管液体总量为40mL，混匀细胞，250g离心8min，弃上清；

(5)用10mL质量分数为0.9％的生理盐水重悬细胞，250g离心8min，弃上清；

(6)重复洗涤3次；最后一次洗涤，弃上清后用2mL PBMC细胞培养基重悬细胞，即得外周血单个核细胞(PBMC)；其中，PBMC细胞培养基配方为：GT-T551培养液+rhGM-CSF100ng/mL+rhIL-4 100ng/mL；

II、DC疫苗制备

(1)取PBMC，调整细胞密度为2-5×10⁶cells/mL，然后加入到24孔板；

(2)于37℃、5％CO₂的培养箱中培养2h后分离悬浮细胞和贴壁细胞，取贴壁细胞继续培养，设取血当天为D0天，D3天时半量换液，约D5天时细胞分化为半悬浮状态时即为未成熟DC；

(3)根据DC的数量，按每1×10⁴cells分别加入实施例2制得的新抗原100μg和实施例3制得的TLR9的激动剂90μg，刺激未成熟DC，然后继续培养24h，将新抗原和免疫佐剂负载在DC上，最后收集全部的细胞(包括PBMC和悬浮的成熟DC)作为混合DC；混合DC即为子宫肌瘤疫苗。

试验例1 ELISPOT法检测子宫肌瘤新抗原激活的CTL的活性

应用子宫肌瘤疫苗进行治疗时，疫苗中的新抗原在APC帮助下激活体内T淋巴细胞，使T淋巴细胞活化成特异性攻击含该新抗原的肿瘤细胞的T淋巴细胞(CTL)。CTL的数量和功能状态(即活性)常用ELISPOT法检测。

1、PBMC预刺激：参考实施例4的方法，分别取氨基酸序列如SEQ ID NO：1至9所示的新抗原(依次记为新1至新9)、其对应的野生型多肽(依次记为野1至野9)和对照肽(HIV病毒的包膜蛋白的一个肽段)，和实施例3制得的TLR9的激动剂一起用于刺激未成熟的DC，收集负载了多肽和免疫佐剂的混合DC作为刺激细胞，取新制备的PBMC 5×10⁶个，加入1×10⁶个刺激细胞，以含70μg/mL rhIL-2的GT-T551培养液继续培养，每7天应用1×10⁶个混合DC重复刺激PBMC 1次，共培养14d，最后收集所有细胞，得预刺激过的PBMC。

2、ELISPOT法检测CTL的活性：

(1)用70％的乙醇水溶液在常温润湿Elispot板1小时，随后采用PBS清洗2遍后，加IFN-γ包被抗体包被Elispot板，加板盖4℃孵育过夜，用PBS清洗，加封闭液封闭Elispot板中IFN-γ抗体未结合的位置，加板盖37℃孵育1小时；

(2)预刺激过的PBMC用无血清细胞培养液调整浓度为1-3×10⁶cells/mL，取100μL加入到包被好的Elispot板中，加板盖，于37℃、5％CO₂的培养箱中培养24h；其中，以对照肽预刺激过的PBMC作为阴性对照，以无肽刺激的PBMC作为空白对照，每个样本做3个平行孔；

(3)弃除无血清细胞培养液，分别用PBS、清洗液洗，加入生物素偶联的IFN-γ识别抗体，在37℃孵育1小时；

(4)清洗后，加入偶联链酶亲和素的辣根过氧化物酶，加盖37℃孵育1小时；

(5)清洗后，加入辣根过氧化物酶的底物，室温避光30分钟左右，用清水充分清洗板的正反面，晾干；

(6)用Elispot板分析器统计孔内免疫斑点数，结合每孔中PBMC的细胞总数，计算出一定数目PBMC中特异性识别子宫肌瘤新抗原并分泌功能细胞因子IFN-γ的子宫肌瘤新抗原特异性T细胞的数目，即识别子宫肌瘤新抗原特异性T细胞的比例，比例越高说明外周血中针对子宫肌瘤新抗原的免疫反应越强，子宫肌瘤新抗原的免疫原性也越强。

结果如图1所示。由图1的结果可知，野生型多肽不具备有效刺激T淋巴细胞活化成CTL的能力，即没有免疫原性，而患者外周血中能识别子宫肌瘤新抗原并分泌功能细胞因子IFN-γ的免疫细胞数目明显高于相应的非突变野生型肽或者阴性对照，表明本发明提供的子宫肌瘤新抗原具有免疫原性，能刺激患者外周血中的T淋巴细胞活化成特异性的T细胞，因此，本发明提供的子宫肌瘤新抗原可用于制备子宫肌瘤特异性T细胞或者子宫肌瘤疫苗应用于子宫肌瘤的治疗或预防。

试验例2 子宫肌瘤疫苗对子宫肌瘤细胞的免疫杀伤作用

本次试验过程中，分别针对每位患者进行操作，即检测子宫肌瘤疫苗对子宫肌瘤肿瘤细胞的免疫杀伤作用时，分别对应使用来源于同一患者的PBMC和肿瘤细胞进行试验。

1、效应细胞制备：参考实施例4的方法，按每1×10⁴cells分别加入新抗原100μg和实施例3制得的TLR9的激动剂90μg，刺激未成熟DC，然后继续培养24h，收集全部细胞作为混合DC，混合DC即为疫苗。取新制备的PBMC 5×10⁶个，加入1×10⁶个混合DC，以含70μg/mLrhIL-2的GT-T551培养液继续培养，每7天应用混合DC重复刺激PBMC 1次，共培养14d，最后收集所有细胞作为效应细胞。

其中，分别取氨基酸序列如SEQ ID NO：1至9所示的新抗原(记为新1至新9)、氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的新抗原和氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的新抗原按1∶1混合得到的混合新抗原(记为新1+新7)、氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的新抗原和氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的新抗原按1∶1混合得到的混合新抗原(记为新2+新8)作为制备疫苗的新抗原。

2、疫苗对子宫肌瘤细胞的免疫杀伤作用：

(1)肿瘤细胞的制备：取子宫肌瘤患者的新鲜活体肿瘤组织，挑选活力较好的部位活检取肿瘤组织，置于平皿中，用Hank′s液/PBS缓冲液洗涤3次，剔除周围脂肪、结缔组织、血液等。用无菌眼科手术剪将肿瘤剪成小块(1-2mm)，再用Hank′s液/PBS缓冲液洗涤3次，转移至50mL离心管中。加入5倍的0.25％胰酶液，37℃消化20-40min，每5min用吸管吹打1次，使细胞分离。加入2-5mL含血清RPMI 1640培养基，以终止胰酶消化作用，静置2-3min，使未分散的组织块下沉，将悬液转移到新的离心管中。用200目尼龙网过滤悬液2次，1000rpm离心5-10min，弃上清液。加入Hank′s液/PBS缓冲液5mL，冲散细胞，再次离心，弃上清液。加入1-2mL RPMI1640培养液将沉淀细胞调整到5×10⁵cells/mL左右，转移至25mL细胞培养瓶中，37℃培养。细胞贴壁密度大于90％时，用胰酶消化，按1∶5比例进行传代到新的培养瓶。用反复贴壁法去除成纤维细胞：根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，结合使用不加血清营养液传代，使细胞悬液反复贴壁而分离两类细胞，制得肿瘤细胞。

(2)以患者的肿瘤细胞作为靶细胞，以使用该患者的PBMC制得的效应细胞作为效应细胞，按效应细胞∶靶细胞数量比50∶1混合后共培养8h，收集上清液以乳酸脱氢酶释放法(LDH)测定效应细胞(主要是CTL)对肿瘤细胞的免疫抑杀活性。分别在靶细胞中加入等量的PBS、PBMC、PBMC+实施例3制得的TLR9的激动剂(记为佐剂PMBC)作为对照组。

细胞杀伤活性％＝100×(E-ES-TS)/(TM-TS)，E：杀伤检测孔OD值；ES：效应细胞酶自然释放孔；TS：靶细胞酶自然释放孔OD值；TM：靶细胞最大释放孔OD值。

结果如图2所示，由图2的结果可知，与对照组(PBS、PBMC、佐剂PBMC)相比，负载新抗原的疫苗有显著的肿瘤细胞杀伤活性，且负载组合新抗原的疫苗对肿瘤细胞免疫杀伤效应超过负载单条新抗原的疫苗。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏兰恩生物治疗技术研究院

<120> 子宫肌瘤新抗原、其应用和子宫肌瘤疫苗

<130> 2020

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Lys Gln Val Phe Asn Asn Gln Pro Ala Val

1 5 10

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Thr Ala Leu Asn Val Lys Gln Val Phe

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gln Val Phe Asn Asn Gln Pro Ala Val

1 5

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Asp Ser Leu Val Tyr Thr Trp Ser Tyr Lys

1 5 10

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Ser Leu Val Tyr Thr Trp Ser Tyr Lys

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Ser Tyr Lys Arg Ile Ser Thr Tyr Ser

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Ser Tyr Lys Arg Ile Ser Thr Tyr Ser Thr

1 5 10

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Trp Ser Tyr Lys Arg Ile Ser Thr Tyr

1 5

<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Glu Asn Thr Glu Asp Ser Leu Val Tyr Thr Trp Ser Tyr Lys Arg

1 5 10 15

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgttgggg 28

Claims

1.子宫肌瘤新抗原，选自氨基酸序列如SEQ ID NO：1至9中任一项所示的多肽中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的子宫肌瘤新抗原在制备预防子宫肌瘤和/或治疗子宫肌瘤和/或预防子宫肌瘤复发的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物为疫苗。

4.子宫肌瘤疫苗，包括权利要求1所述的子宫肌瘤新抗原以及一种或多种医药上可接受的载体。

5.根据权利要求4所述的子宫肌瘤疫苗，其特征在于，所述载体为抗原提呈细胞。

6.根据权利要求5所述的子宫肌瘤疫苗，其特征在于，所述载体选自树突状细胞、B淋巴细胞、单核-巨噬细胞中的一种或多种。

7.根据权利要求5或6所述的子宫肌瘤疫苗，其特征在于，还包括免疫佐剂。

8.根据权利要求7所述的子宫肌瘤疫苗，其特征在于，所述免疫佐剂选自TLR9的激动剂、poly-ICLC、γ-干扰素中的一种或多种。

9.根据权利要求8所述的子宫肌瘤疫苗，其特征在于，所述TLR9的激动剂为全硫代修饰的富CpG序列的非甲基化寡聚脱氧核苷酸，所述富CpG序列的非甲基化寡聚脱氧核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。

10.根据权利要求9所述的子宫肌瘤疫苗，其特征在于，每1×10⁴个抗原提呈细胞，子宫肌瘤疫苗中子宫肌瘤新抗原的添加量为50-500μg，TLR9的激动剂的添加量为20-150μg，γ-干扰素的添加量为0-1800单位。