CN111297765B - 一种刺梨提取物及其抗菌用途 - Google Patents

Abstract

本申请公开了植物提取物中的一种刺梨提取物及其用途。具体而言，本发明涉及刺梨提取物作为抗菌剂的用途，特别是美容或抗菌组合物的抗菌剂的用途。此外，本发明还涉及一种抗菌组合物，其包含本发明的刺梨提取物、和任选的苯甲酸或其美容上可接受的可溶性盐和/或任选的乙二胺四乙酸或其美容上可接受的可溶性盐。本发明还涉及所述刺梨提取物的制备方法。

Description

一种刺梨提取物及其抗菌用途

技术领域

本发明涉及一种植物提取物，具体涉及一种刺梨提取物及其抗菌用途，本发明的刺梨提取物特别适合在美容或化妆产品中用作抗菌剂，其包含本发明的刺梨提取物和任选的苯甲酸或其美容上可接受的可溶性盐和/或任选的乙二胺四乙酸或其美容上可接受的可溶性盐，所述抗菌组合物特别适用于美容或化妆产品，另外，本发明还涉及制备所述刺梨提取物的方法。

背景技术

目前市售的大部分美容品或化妆品的剂型均属水溶性，水分含量高，且含有大量糖类、蛋白质或脂质等营养物质，因而提供微生物良好的养分和生长环境。这些美容品或化妆品使用过程或保存方式不当就容易滋生微生物而导致污染。产品一旦遭受到病原菌的污染，除了可能因活性成分降解而导致产品变质，还有可能直接感染使用者，严重危害消费者的健康。

化学防腐剂能有效地控制微生物的生长，防止微生物对化妆产品造成污染，常用于化妆品和食品的化学防腐剂包括：咪唑烷基脲、咪唑烷-2,4-二酮、异噻唑啉酮、羟基苯甲酸乙酯、苯甲酸及其衍生物等化学防腐剂。然而，这些化学防腐剂可具有例如导致皮肤发炎等副作用，有一些更具有神经毒性和致癌作用。因此，这些化学防腐剂都不受消费者所欢迎，同时也是监管部门审查的重点，这常常影响产品的市场推广。由于防腐剂或抗菌剂在化妆品或美容品配方中占有很重要的角色，因此开发新的天然抗菌剂和抗菌组合物对化妆品工业具有迫切的需要和实际的意义。

刺梨，为蔷薇科多年生落叶灌木缫丝花的果实，又名山王果、刺莓果，是滋补健身的营养珍果，是一种稀有的果实。刺梨主要生长在贵州的龙里县、毕节、六盘水、黔南、铜仁等地。据悉，刺梨的药用价值被报道的甚微，目前更没有任何文献或报道关于刺梨提取物用作抗菌剂，特别是用作化妆品或美容品的抗菌剂。

发明内容

本发明的目的可包括提供一种天然的抗菌剂，特别是从植物中提取的天然抗菌剂。这样的抗菌剂没有化学抗菌剂的致敏感和致炎甚至神经毒性和致癌等副作用，因此特别适用于局部施用或皮肤施用，例如美容或化妆用途。当天然提取物被用于美容或化妆产品时，还要求该提取物不显著影响产品的物理性质(例如颜色、气味和稳定性)，否则会影响消费者对产品的购买意欲，导致产品市场价值下降。

本发明的目的还可包括提供一种制备这样的天然提取物的方法。此外，本发明的目的还可包括提供一种包含所述天然抗菌剂的抗菌组合物和美容或化妆组合物。

本发明的技术问题通过提供一种刺梨提取物来解决，该刺梨提取物通过本文描述的特定方法(例如特定的提取和洗脱过程)来制备。由于制备该提取物的方法有别于现有技术中的制备方法，因此本发明刺梨提取物中的成分及其含量不同于现有技术中的刺梨提取物。

总体而言，本文提供了一种刺梨提取物，其通过水提取和乙醇水溶液洗脱来制备。该提取物对各种细菌(包括革兰氏阳性细菌和革兰氏以阴性细菌)和真菌(包括酵母等)都具有显示出抑制效果，因此具有较为广谱的抑菌活性。此外，本发明的刺梨提取对于美容/化妆品的物理性质不构成负面影响，而且对人体皮肤具有安全性。另外，本发明的提供的抗菌组合物具有更广谱的抑菌活性，并且其中所含的化学抗菌剂的含量可以进一步减少。

具体的，所述的刺梨提取物包括以下步骤的方法制备：步骤(1)用水提取经碎片化的刺梨以获得水提物，步骤(2)使所述水提物通过大孔吸附树脂，并且随后用乙醇水溶液洗脱。在一个方面，本发明的刺梨提取物可以呈溶液形式或冻干形式(例如冻干粉)。

在上述步骤(1)中，可使用本领域公知的设备或方法将刺梨进行碎片化，其中粉碎程度例如可为至少4目，优选至少10目，优选至少20目，例如30-200目，例如40目。在步骤(1)中，在向碎片化的刺梨加入水后，进行加热回流提取，其中加热时间为至少30分钟，优选至少1小时，更优选1.5-10小时，例如2小时。

在上述步骤(2)中，使所述水提物通过大孔吸附树脂是使活性成分吸附到所述大孔吸附树脂的过程。在该过程中使用色谱或层析分离技术，优选液相色谱或层析。使用的大孔吸附树脂可为弱极性大孔吸附树脂，更优选弱极性苯乙烯型大孔吸附树脂，最优选AB-8大孔吸附树脂。所述大孔吸附树脂是大孔吸附树脂柱的形式。在所述步骤(2)中，用乙醇水溶液洗脱是使活性成分从所述树脂中洗脱下来从而获得洗脱液的过程。在所述步骤中，使用10%-50%的乙醇水溶液，优选20%-40%的乙醇水溶液，更优选30%的乙醇水溶液，例如10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%的乙醇水溶液。在所述步骤中，收集流经大孔吸附树脂的所述乙醇水溶液的洗脱液。

在一个方面，上述方法还可包括以下步骤：步骤(3)将从步骤(2)中获得的洗脱液中的乙醇去除。在所述步骤(3)中，可以用本领域已知的任何方法去除乙醇，例如使用旋转蒸发仪。

在一个方面，上述方法还可包括以下步骤：步骤(4)将从步骤(3)中获得洗脱液进行浓缩和任选的定容，从而获得呈溶液形式的提取物。

在一个方面，上述方法还可包括以下步骤：步骤(5)将从步骤(4)中获得刺梨提取物冷冻干燥处理，从而获得呈冻干粉末形式的提取物。

在一个方面，本发明涉及一种抗菌组合物，其包含本发明所述的刺梨提取物。在该方案中，所述抗菌组合物可以进一步包含苯甲酸或其美容上可接受的可溶性盐。所述苯甲酸在所述抗菌组合物可以按可溶的形式或者离子的形式存在。例如，所述抗菌组合物可进一步包含苯甲酸钠或苯甲酸钾，优选苯甲酸钠。在另一方面，所述抗菌组合物可以进一步包含乙二胺四乙酸或其美容上可接受的可溶性盐。所述乙二胺四乙酸在所述抗菌组合物可以按可溶的形式或者离子的形式存在。例如，所述抗菌组合物可进一步包含乙二胺四乙酸钠盐或乙二胺四乙酸钾盐，优选乙二胺四乙酸二钠。在一个方面，所述组合物可包含本发明的刺梨提取物、苯甲酸或其美容上可接受的可溶性盐、以及乙二胺四乙酸或其美容上可接受的可溶性盐。在一个方面，所述组合物还可包含溶剂，优选水。在一个方面，所述组合物可由上述抗菌组分和溶剂(例如水)组成。

在上述抗菌组合物中，基于所述抗菌组合物计算，所述刺梨提取物的重量百分比可为1%-10%，优选2%-8%，更优选5%-6%，例如5.0%、5.2%、5.4%、5.6%、5.8%或6.0%。在所述抗菌组合物中，基于所述抗菌组合物计算，所述苯甲酸或其美容上可接受的可溶性盐的重量百分比可为0.01%-2%，优选0.05%-1%，更优选0.1%-0.5%，例如0.10%、0.20%、0.30%、0.40%或0.50%。在所述抗菌组合物中，基于所述抗菌组合物计算，所述乙二胺四乙酸或其美容上可接受的可溶性盐的重量百分比可为0.025%-1%、更优选0.05%-0.5%，更优选0.075%-0.35%，优选0.1%-0.3%，例如0.1%、0.2%或0.3%。

在一个方面，本发明涉及上述刺梨提取物或抗菌组合物用作局部或皮肤施用的产品(例如美容产品或化妆产品)的抗菌剂的用途。在一个方面，本发明涉及一种美容或化妆组合物，其包含上述刺梨提取物或者抗菌组合物。优选地，所述美容或化妆组合物是基于水的美容或化妆组合物，例如洗液(护肤液)、乳液(例如保湿乳液)、精华液等。所述基于水的美容或化妆组合物较容易受到微生物的污染，因此本发明的抗菌剂特别适用于这样的组合物。

根据一些实施方式，美容或化妆组合物为用于传统皮肤外部制剂的任何形式，包括但不限于面部美容诸如洗液(护肤液)、乳液、霜剂、和美容涂敷剂；补妆美容诸如预补妆、粉底、颊着色、唇膏、唇霜、眼睑膏、眼线笔、睫毛膏、和遮光剂；体用美容；香味美容；皮肤清洁剂诸如补妆去除剂、面部清洁剂、和体用香波；气溶胶、粉饼、霜剂、软膏、乳剂、香精、泡沫、凝胶、洗液、摩丝、糊剂、药膏(补片)、笔、浆液、溶液、小毛巾、面膜、体膜、或喷雾剂。例如，所述美容或化妆组合物可为溶液剂或混悬剂，例如基于水的溶液剂或混悬剂。

还考虑的是，除了美容或化妆组合物之外，本发明的刺梨提取物或抗菌组合物可用于其他局部施用的组合物、皮肤施用的组合物或者口腔组合物，例如局部施用或皮肤施用的药物，包括如外用溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂或贴剂等；和例如口腔清洁产品或牙齿清洁用品，包括牙膏、牙粉、漱口水、口腔喷雾剂或牙线等。

本文所述的术语“抗菌剂”或“抗微生物剂”可以互换使用，是指对细菌、酵母和霉菌等微生物的生长和繁殖具有抑制作用甚至杀伤所述微生物的物质。在本发明中，抗菌剂可以包括刺梨提取物或者抗菌组合物。被本发明抗菌剂抑制或杀伤的细菌包括：革兰氏阳性细菌例如金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，和革兰氏阴性细菌例如肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌。被本发明抗菌剂抑制或杀伤的酵母包括白色念珠菌。被本发明抗菌剂抑制或杀伤的霉菌包括黑曲霉。

本文所述的刺梨提取物或抗菌组合物可以用作防腐剂。本发明所述的“防腐剂”是指用于加入食品、药品、特别是化妆/美容品等的物质，以延迟在这些工业产品中微生物生长引起的腐败。当用作防腐剂时，期望的是这种防腐剂对于各种微生物（包括细菌、酵母和霉菌）具有广谱的抑制效果。

文本所述的术语“美容上可接受的可溶性盐”是指所提供的浓度施用于皮肤时对人体是安全的、通常不干扰组合物中其他成分的活性、且在组合物中是可溶性的盐。所述盐可以是钠盐、钾盐等。

对于美容或化妆组合物而言，抗菌剂具有广谱的抑菌活性是特别有利的，由此可以减少其他类型抗菌剂的加入。同时，还需要考虑广谱抗菌剂自身在用于美容或化妆组合物时不会对皮肤或人体产生副作用，因此天然抗菌剂相对于化学抗菌剂显然更有利。现有技术的难题在于找到一种既广谱、又不会产生副作用、同时与美容/化妆组品相容(例如保持产品的稳定性、均一性和良好外观)的抗菌剂。这样的技术难题通过提供本发明的刺梨提取和抗菌组合物得以解决。

附图说明

图1为铜绿假单胞菌和黑曲霉在不同浓度苯甲酸钠处理后，生长曲线后移，生长变缓效应的示意图；

图2为铜绿假单胞菌和黑曲霉在实施例7的防腐/抗菌组合物A、B、C处理后，生长停滞现象的示意图；

图3为大肠杆菌在不同浓度苯甲酸钠处理后，生长曲线后移，生长变缓效应的示意图；

图4为大肠杆菌在实施例7的防腐/抗菌组合物A、B、C处理后，生长停滞现象的示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

实施例1 刺梨提取物及其冻干粉的制备

1.取100 g刺梨，用粉碎机粉碎至40目，按照质量体积料液比1:10加入蒸馏水，加热回流提取2 h。

2.3000 r/min离心10 min，收集上清，沉淀物重复提取两次，合并上清，获得刺梨水提物。

3.上AB-8大孔树脂柱纯化，分别用质量分数为10%、20%、30%、40%和50%的乙醇进行洗脱，收集各个浓度乙醇下分别获得的洗脱部分，将洗脱液用旋转蒸发仪脱除乙醇。

4.将刺梨洗脱液浓缩定容至1L，放在-80℃冰箱保存。

可将通过以上步骤获得的刺梨提取物进一步冻干，获得刺梨提取物的冻干粉。

实施例2 抗菌剂SGT的检测

根据微生物生长曲线，我们可以确定从滞后期进入指数期的时间，即开始生长时间(Start Growing Time, SGT)。微生物在加入抗菌剂后存活数量会减少，且细胞也受到一定程度的破坏，导致滞后期延长，SGT增加(即生长曲线右移)。把加入了试验药物的微生物生长曲线的SGT与空白对照组的SGT比较，便可知道组合物对于微生物的抑制效果。

分别使用实施例1制备的刺梨水提物，检测对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的SGT，青霉素/链霉素作为阳性对照，结果如下。

表1. 不同浓度的刺梨水提物对于金黄色葡萄球菌的抑制能力

	12.8 mg/ml 刺梨水提物	25.6 mg/ml 刺梨水提物	空白	阳性
					SGT (小时)	> 6.5	> 8.5	0.75	> 4.5

表2. 不同浓度的刺梨水提物对于大肠杆菌的抑制能力

	12.8 mg/ml 刺梨水提物	25.6 mg/ml 刺梨水提物	51.2 mg/ml 刺梨水提物	空白	阳性
						SGT(小时)	>3.5	>4.5	> 6.0	0.75	> 4.5

实施例3 使用存活菌数测定刺梨提取物的抗菌活性

采用中国药典(2015版)第四部通则1121《抑菌效力检测法》中表1所示的试验菌株和按照表内的培养条件进行培养。把各个菌种分成4份并在无菌操作下培养，直至菌种接菌量达105-106 cfu/mL。根据通则表2-2的要求把供试的试验菌株加入供试样本中培养2天、7天及14天。使用平皿法(包括倾注法及涂布法)——中国药典(2015版)第四部通则1105，计算各试验组的平均菌落数。

分别使用实施例1描述的方法制备的刺梨的水提液(未经色谱分离)、10%乙醇洗脱液、20%乙醇洗脱液、30%乙醇洗脱液、40%乙醇洗脱液、50%乙醇洗脱液，和化妆品常用化学防腐剂GPL，检测他们对代表性细菌(包括革兰氏阳性和阴性细菌)。结果如表3所示。

表3. 利用平皿法比较刺梨提取物与传统化学防腐剂在不同菌种上的抑菌能力

	金黄色葡萄球菌	肺炎克雷伯氏菌	枯草芽孢杆菌	白色念珠菌
					刺梨水提液	+	+	++	++
刺梨10%乙醇洗脱液	++	+	++	+++
					刺梨20%乙醇洗脱液	++	++	+++	++++
刺梨30%乙醇洗脱液	++++	++++	+++	++++
					刺梨40%乙醇洗脱液	++++	++	++	+++
刺梨50%乙醇洗脱液	+++	+++	++	+++
					阳性对照GPL	+++	++	++	++

此外，刺梨的30%乙醇洗脱液对于大肠杆菌的抑菌能力达到++++的级别，而阳性对照GPL是+++，“+”单位面积中的平均菌落数，菌落数越少，抑菌能力越强。。

实施例4 刺梨提取物与乙二胺四乙酸二钠组合的抑菌效果

乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)通常在化妆品中用作稳定剂。发明人发现，使用刺梨提取物(30%乙醇提取物)的冻干粉与EDTA-2Na组合能够增强抗菌的广谱性。使用以下成分的组合，检测它们对铜绿假单胞菌和黑曲霉的抑制效果。

表4. 包含刺梨提取物和EDTA-2Na的组合物

成分	组合物A	组合物B	组合物C
				刺梨提取物冻干粉	9.99g	9.98g	9.97g
EDTA-2Na	0.01g	0.02g	0.03g

实施例5 刺梨提取物与苯甲酸钠组合的抑菌效果

苯甲酸及其钠盐是常用的化学防腐剂，期望可以减少其在化妆品中的用量同时可以保留防腐剂的抑菌效果。分别制备0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%的苯甲酸钠水溶液，使用实施例2所述的方法检测它们分别对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的SGT。

表5. 刺梨提取物中添加的苯甲酸钠水溶液的SGT

防腐剂	添加量(%)	金黄色葡萄球菌 SGT	大肠杆菌SGT
				苯甲酸钠	0.10	4.50	3.80
苯甲酸钠	0.20	5.00	4.00
				苯甲酸钠	0.30	5.15	4.40
苯甲酸钠	0.40	5.85	5.15
				苯甲酸钠	0.50	6.30	5.25
阳性对照GPL	0.50	>4.00	>3.00
				空白对照 (水)	0.00	1.75	1.60

其中，阳性对照为只含有GPL的水溶液，GPL为常用的化学防腐剂之一，在此用来证明含苯甲酸钠的刺梨提取物抑菌效果明显优于市场上常用的防腐剂；空白对照为纯的刺梨提取物。

实施例6 抗菌组合物的抑菌效果

根据以下成分和配比配制本发明的抗菌/防腐组合物。

表6. 不同成份含量的抗菌/防腐组合物

成分	每100 g 组合物A 含	每100 g 组合物B 含	每100 g 组合物C 含
				刺梨洗脱液	6.00g	5.50 g	5.50 g
苯甲酸钠	0.50 g	0.30 g	0.10 g
				乙二胺四乙酸二钠	0.20 g	0.20 g	0.20 g

将刺梨30%乙醇洗脱液、苯甲酸钠、乙二胺四乙酸二钠和余量的水加入小烧杯中，升温至40-60℃，搅拌至全溶后降至室温即得；或继续过滤，分装。

1.实验菌株

实验菌株包括：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉。

2.牛津杯法测定抑菌圈的步骤：

A.将细菌活化，并传代培养至OD595为0.3-0.5，稀释至106 cfu/ml。分别均匀涂布在LB琼脂平板上；将真菌活化培养，并稀释至105 cfu/ml，分别均匀涂布在孟加拉红琼脂平板上。

B.将组合物A、B、C分别溶解于蒸馏水中，定容至100 mL。

C.将牛津杯放置在平板表面，在每个牛津杯内分别加入100 μL抑菌组合物溶液，平行三个。

D.平稳的移入恒温培养箱中，37℃静置培养16小时。用游标卡尺测量透明抑菌圈的直径。

3.测定结果

实验结果如下表，通过牛津杯法检测组合物的抑菌效果，结果表明组合物A、B、C分别对细菌、酵母和霉菌都具有较好的抑制效果。苯甲酸钠单独作用时，不能抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在平板上生长，未能形成透明抑菌圈；当刺梨、EDTA-2Na和苯甲酸钠复配使用时，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等微生物的增长起到抑制作用。

表7.本发明的防腐/抗菌组合物对于各种细菌、酵母和霉菌的抑制效果

以上结果表明本发明的抗菌组合物具有较广谱的抑菌活性。

实施例7 根据生长曲线确定抗菌组合物的抑菌效果

根据微生物生曲线确定0.1%、0.3%和0.5%的苯甲酸钠水溶液以及由实施例6中制备的组合物A、B和C存在下铜绿假单胞菌、黑曲霉和大肠杆菌的生长曲线。50 µg/ml卡那霉素作为阳性对照。

1.微生物生长曲线的绘制包括如下步骤：

A.取10 µL微生物菌悬液，至5 mL LB培养基中，37℃培养16小时。

B.第二天分别取10 uL的菌悬液转移至5mL含有试验药物、空白对照与阳性对照（50 µg/ml卡那霉素）LB培养基中，37℃培养16小时。

C.第三天把包括试验药物、空白对照与阳性对照的所有培养液按 5,000 RPM离心处理 5 分钟，倒掉上清液。再分別用5mL新鲜LB培养基重新配制成菌悬液。重复由离心处理至重新配制成菌悬液的步骤两次以确保培养基中药物成分均被移除。

D.取200 µL菌悬液至96孔板中，每15分钟读取595 nm下吸光值。按吸光值及时间点绘制微生物在不同试验药物、空白对照与阳性对照中的生长曲线。

2.测定结果

生长曲线滞后越多，表示药物或组合物对微生物的破坏能力越强，说明该药物或组合物的抑菌防腐效果越好。图1. 铜绿假单胞菌和黑曲霉在不同浓度苯甲酸钠处理后，生长曲线后移，生长变缓效应。图2. 铜绿假单胞菌和黑曲霉在实施例7的防腐/抗菌组合物A、B、C处理后，生长停滞现象。图3. 大肠杆菌在不同浓度苯甲酸钠处理后，生长曲线后移，生长变缓效应。图4.大肠杆菌在实施例7的防腐/抗菌组合物A、B、C处理后，生长停滞现象。

Claims (3)

1.一种抗菌组合物，其特征在于，包含刺梨提取物、苯甲酸钠和乙二胺四乙酸钠，所述刺梨提取物的重量百分比为5.5%~6%，所述苯甲酸钠的重量百分比为0.1%~0.5%，所述乙二胺四乙酸钠的重量百分比为0.2%；所述刺梨提取物通过以下方法制备：取刺梨用粉碎机粉碎至40目，按照质量体积料液比1:10加入蒸馏水，加热回流提取2h； 3000r/min离心10min，收集上清，沉淀物重复提取两次，合并上清，获得刺梨水提物，上AB-8大孔树脂柱纯化，用质量分数为30%的乙醇进行洗脱，收集洗脱部分，将洗脱液用旋转蒸发仪脱除乙醇，获得相应洗脱浓度的刺梨提取物。

2.根据权利要求1所述的抗菌组合物用作美容或化妆产品的抗菌剂的用途。

3.一种局部施用或皮肤施用的组合物，其包含权利要求1所述的抗菌组合物。

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