CN111281883A - 牙髓间充质干细胞改善糖尿病的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牙髓间充质干细胞改善糖尿病的方法，首先制备牙髓间充质干细胞，由牙科医生对乳牙进行拔出后，通过冷链运输将牙齿在冷藏状态下运送到细胞制备中心，然后在GMP条件下的实验室中切开牙齿提取其中的牙髓组织，进行牙髓中干细胞的提取；提取出的牙髓干细胞培养在培养瓶中进行传代和扩增；将制备好的牙髓间充质干细胞回输入糖尿病患者体内，回输方式采用静脉注射，每次50～70万个单位/kg，每隔20天注射一次，共注射3～4次，持续观察患者的使用效果，后续决定是否继续采用该疗法改善。促进胰岛组织增殖再生，提高胰岛素分泌，降低血糖，纠正免疫因子紊乱，缓解炎症。可以使用脱落乳牙干细胞改善2型糖尿病和1型糖尿病。

Description

牙髓间充质干细胞改善糖尿病的方法

技术领域

本发明属于细胞治疗技术领域，具体的说是涉及一种牙髓间充质干细胞改善糖尿病的方法。

背景技术

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。糖尿病的病因有：1、遗传因素：1型或2型糖尿病均存在明显的遗传异质性，糖尿病存在家族发病倾向，1/4～1/2患者有糖尿病家族史。临床上至少有60种以上的遗传综合征可伴有糖尿病。1型糖尿病有多个DNA位点参与发病，其中以HLA抗原基因中DQ位点多态性关系最为密切。在2型糖尿病已发现多种明确的基因突变，如胰岛素基因、胰岛素受体基因、葡萄糖激酶基因和线粒体基因等。2、环境因素：进食过多，体力活动减少导致的肥胖是2型糖尿病最主要的环境因素，使具有2型糖尿病遗传易感性的个体容易发病。1型糖尿病患者存在免疫系统异常，在某些病毒如柯萨奇病毒，风疹病毒，腮腺病毒等感染后导致自身免疫反应，破坏胰岛素β细胞。

糖尿病的临床表现有：1、多饮、多尿、多食和消瘦。严重高血糖时出现典型的三多一少症状，多见于1型糖尿病。发生酮症或酮症酸中毒时三多一少症状更为明显。2、疲乏无力，肥胖。多见于2型糖尿病，2型糖尿病发病前常有肥胖，若得不到及时诊断，体重会逐渐下降。糖尿病的检查方法有：1、血糖：是诊断糖尿病的惟一标准，有明显三多一少症状者，只要一次异常血糖值即可诊断，无症状者诊断糖尿病需要两次异常血糖值，可疑者需做75g葡萄糖耐量试验。2、尿糖：常为阳性。血糖浓度超过肾糖阈（160～180毫克/分升）时尿糖阳性，肾糖阈增高时即使血糖达到糖尿病诊断可呈阴性。因此，尿糖测定不作为诊断标准。3、尿酮体：酮症或酮症酸中毒时尿酮体阳性。4、糖基化血红蛋白（HbA1c）：是葡萄糖与血红蛋白非酶促反应结合的产物，反应不可逆，HbA1c水平稳定，可反映取血前2个月的平均血糖水平，是判断血糖控制状态最有价值的指标。5、糖化血清蛋白：是血糖与血清白蛋白非酶促反应结合的产物，反映取血前1～3周的平均血糖水平。6、血清胰岛素和C肽水平：反映胰岛β细胞的储备功能，2型糖尿病早期或肥胖型血清胰岛素正常或增高，随着病情的发展，胰岛功能逐渐减退，胰岛素分泌能力下降。7、血脂：糖尿病患者常见血脂异常，在血糖控制不良时尤为明显，表现为甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平升高，高密度脂蛋白胆固醇水平降低。8、免疫指标：胰岛细胞抗体（ICA），胰岛素自身抗体（IAA）和谷氨酸脱羧酶（GAD）抗体是1型糖尿病体液免疫异常的三项重要指标，其中以GAD抗体阳性率高，持续时间长，对1型糖尿病的诊断价值大，在1型糖尿病的一级亲属中也有一定的阳性率，有预测1型糖尿病的意义。9、尿白蛋白排泄量：放免或酶联方法可灵敏地检出尿白蛋白排出量，早期糖尿病肾病尿白蛋白轻度升高。

糖尿病的诊断一般不难，空腹血糖大于或等于7.0毫摩尔/升，和/或餐后两小时血糖大于或等于11.1毫摩尔/升即可确诊。诊断糖尿病后要进行分型。1型糖尿病：发病年龄轻，大多小于30岁，起病突然，多饮多尿多食消瘦症状明显，血糖水平高，不少患者以酮症酸中毒为首发症状，血清胰岛素和C肽水平低下，ICA、IAA或GAD抗体可呈阳性。单用口服药无效，需用胰岛素治疗。2型糖尿病：常见于中老年人，肥胖者发病率高，常可伴有高血压、血脂异常和动脉硬化等疾病。起病隐袭，早期无任何症状，或仅有轻度乏力、口渴，血糖增高不明显者需做糖耐量试验才能确诊，血清胰岛素水平早期正常或增高，晚期低下。

糖尿病的鉴别诊断方法有：1、肝脏疾病：肝硬化患者常有糖代谢异常，典型者空腹血糖正常或偏低，餐后血糖迅速上升，病程长者空腹血糖也可升高。2、慢性肾功能不全：可出现轻度糖代谢异常。3、应激状态：许多应激状态如心、脑血管意外，急性感染、创伤，外科手术都可能导致血糖一过性升高，应激因素消除后1～2周可恢复。4、多种内分泌疾病：如肢端肥大症、库欣综合征、甲亢、嗜铬细胞瘤，胰升糖素瘤可引起继发性糖尿病，除血糖升高外，尚有其他特征性表现，不难鉴别。

目前尚无根治糖尿病的方法，但通过多种治疗手段可以控制好糖尿病。主要包括5个方面：糖尿病患者的教育、自我监测血糖、饮食治疗、运动治疗和药物治疗。1、糖尿病患者的教育：要教育糖尿病患者懂得糖尿病的基本知识，树立战胜疾病的信心，如何控制糖尿病，控制好糖尿病对健康的益处，根据每个糖尿病患者的病情特点制定恰当的治疗方案。2、自我监测血糖：随着小型快捷血糖测定仪的逐步普及，病人可以根据血糖水平随时调整降血糖药物的剂量。1型糖尿病进行强化治疗时每天至少监测4次血糖，血糖不稳定时要监测8次，强化治疗时空腹血糖应控制在7.2毫摩尔/升以下，餐后两小时血糖小于10mmol/L，HbA1c小于7％，2型糖尿病患者自我监测血糖的频度可适当减少。糖尿病的治疗方法可以分为药物治疗、胰岛素治疗、运动治疗和饮食治疗等四方面。但是现有技术中的这些治疗方法不是对身体副作用较大，就是治疗效果不理想，所以现针对糖尿病患者需研制出一种新型的治疗方法，用于改善糖尿病患者的生活质量。

世界卫生组织（WHO）发出警告，我国约有1.1亿名糖尿病患者，约占中国成年人总数的1/10,若不尽快采取行动，减少不健康饮食和缺乏运动等生活方式中的危险因素，预计该数将在2040年增至1.5亿人。糖尿病等非传染性疾病是中国首要的健康威胁，糖尿病和糖尿病并发症每年导致近100万人死亡；其中近40％的死亡为过早死亡，过早死亡即年龄在70岁以下人口的死亡。糖尿病是不可逆转的，目前，大家对于糖尿病治疗的目标都是尽量拖延糖尿病的进程，因为一旦得了糖尿病，人体内的β细胞就会逐渐凋亡，这也直接导致糖尿病病程不可逆。如果长期血糖控制不住，糖尿病会带来多种非常严重的并发症，最严重的可导致死亡。糖尿病的并发症有：冠心病、中风、截肢、失明和死亡，糖尿病权威治疗专家义明教授指出：干细胞治疗可以为糖尿病患者带来新希望。

细胞是生物体基本的结构和功能单位。人体是由220多种不同组织约40万亿个细胞组成的有机体，所有生命活动都是由细胞完成的。细胞治疗(cell therapy) 是指利用某些具有特定功能的细胞的特性，采用生物工程方法获取和/或通过体外扩增、特殊培养等处理后，再将这些细胞回输病人的一种治疗方式。干细胞（stem cell）是未充分分化、具有再生各种组织器官的潜在功能的一类细胞，干细胞主要用于组织器官修复和体内免疫调节，干细胞是一类具有自我更新复制和多向分化潜能的原始细胞，胚胎干细胞是一种全能干细胞，所有的细胞均起源于一个干细胞，成体干细胞是一种多功能或单功能的干细胞，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种多能成体干细胞，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞主要存在于结缔组织和器官间质中，包括：骨、脂肪、肌肉、脐带、肺、肝、胰腺等组织中。在体内或体外特定的条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞。间充质干细胞属于多功能干细胞，间充质干细胞可以粘附在塑料器皿表面贴壁生长，属于特定表面标记物，具有多向分化潜能，可以体外成骨、成软骨和成脂肪。

间充质干细胞的主要特性有：1、低免疫原性，低表达MHC-I，不表达MHC-II、FAS配体以及CD40L等共刺激因子，细胞输注后各种免疫标记物水平没有明显的变化，异体输注不会引起免疫排斥反应；2、损伤趋化作用，具有归巢功能，归巢作用能够主动迁移并聚集到损伤炎症部位，归巢作用与间充质干细胞表面表达的多种趋化因子受体，趋化因子受体相关；3、具有旁分泌作用和细胞滋养作用，促生长；间充质干细胞可以通过旁分泌或者以外泌体、微囊泡及凋亡小体的形式分泌多种生长因子、细胞因子、多肽、激素等细胞生长所需营养物质，从而促进细胞的生长；通过改善组织部位微环境，激活自身干细胞，促进分化新生细胞；4、具有抗凋亡作用，线粒体功能异常会引起活性氧产生增多以及细胞凋亡途径的激活，导致许多疾病的发生和发展，当人体细胞处于应激、损伤等状况时，会激活间充质干细胞将自身线粒体转移给受体细胞，从而修复受损细胞，防止细胞凋亡；5、免疫调节作用，可以根据体内免疫系统状况和炎症水平进行双向调节，抑制炎症反应，在大量炎症因子刺激下，MSCs会被激活转变为抗炎MSC2型，产生大量的NO、IDO等免疫调节因子以及趋化因子，通过抑制效应性T细胞功能，诱导Treg产生发挥免疫抑制作用；而在低水平的促炎因子或高水平的抗炎因子刺激下， MSCs会转变为促炎MSC1型，仅产生少量免疫调节因子，通过释放趋化因子募集淋巴细胞到达炎症发生部位，促进效应性T细胞增殖、激活和分化，抑制Treg的产生；6、体外增殖，易扩增传代，并保持稳定；贴壁后快速生长是间充质干细胞的一个重要特性，反映了细胞自我更新的能力；MSCs体外传代次数可以达到50代及以上；细胞活性随传代次数增加而降低，输注细胞一般使用6代以内的细胞。

发明内容

本发明为了克服现有技术存在的不足，提供一种牙髓间充质干细胞改善糖尿病的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种牙髓间充质干细胞改善糖尿病的方法，该牙髓间充质干细胞改善糖尿病的方法具体为：首先制备牙髓间充质干细胞，需要由牙科医生对乳牙进行拔出后，通过冷链运输将牙齿在冷藏状态下运送到细胞制备中心，然后在GMP条件下的实验室中切开牙齿提取其中的牙髓组织，进行牙髓中干细胞的提取；提取出的牙髓干细胞培养在培养瓶中进行传代和扩增，最后经过牙髓间充质干细胞鉴定检测，满足鉴定条件的细胞即为牙髓间充质干细胞；将制备好的牙髓间充质干细胞回输入糖尿病患者体内，回输方式采用静脉注射，每次50～70万个单位/kg，每隔20天注射一次，共注射3～4次，持续观察患者的使用效果，后续决定是否继续采用该疗法改善。

本发明牙髓间充质干细胞的鉴定条件为：呈梭状贴壁生长；细胞表面表达阳性Marker，不表达阴性Marker；具有牙髓和牙本质细胞分化能力；同时满足上述三个鉴定条件的即为牙髓间充质干细胞。

牙髓干细胞的制备方法：牙髓干细胞是一种来源于牙髓的成体间充质干细胞，它包括恒牙中的牙髓干细胞（DPSC）及乳牙中的脱落乳牙干细胞（SHED）两类。牙髓干细胞的提取过程为：首先需要由牙科医生对乳牙进行拔出后，通过冷链运输将牙齿在冷藏状态下运送到细胞制备中心，然后在GMP条件下的实验室中切开牙齿提取其中的牙髓组织，进行牙髓中干细胞的提取。提取出的牙髓干细胞培养在培养瓶中进行传代和扩增，最后经过间充质干细胞鉴定检测，1、呈梭状贴壁生长；2、细胞表面表达阳性Marker，不表达阴性Marker；3、具有成骨、成脂、成软骨分化能力。需同时满足上述三个鉴定条件的细胞即为牙髓干细胞。

牙髓干细胞的免疫表型：DPSCs与骨髓间充质干细胞（BMMSCs）具有相似的免疫表型。乳牙干细胞中STRO-1阳性细胞比例更高，STRO-1(+)细胞被证实为更原始的细胞亚群，其细胞增殖与分化潜能远远优于(-)细胞，在体内具有强大的造血支持和归巢能力。牙髓干细胞的增殖分化能力：与骨髓间充质干细胞相比，牙髓干细胞具有更高的集落形成率和增殖率，其中乳牙牙髓干细胞的增殖能力更强。牙髓间充质干细胞的增殖分化能力：增殖能力：SHED > DPSCs > BMMSCs；分化能力：SHED或DPSCs分化成牙髓和牙本质细胞；BMMSCs可以分化成软骨、肌肉等细胞。牙髓间充质干细胞的旁分泌或免疫调节能力：与DPSC相比，SHED中多种生长因子、细胞因子的基因表达有明显的上调，与DPSC和骨髓间充质干细胞相比，具有更强的免疫调节能力。牙髓间充质干细胞与神经相关：牙髓干细胞来源于头部神经嵴细胞，DPSC和SHED都可以在体外特定培养条件下分化为多种神经细胞，特别是功能性的神经元细胞；牙髓中的神经胶质细胞可以逆向转化成为牙髓间充质干细胞，最终分化成为牙本质细胞；牙髓干细胞与神经系统高度相关。

GMP实验室是采用符合国际细胞制备质量管理体系标准的一种生物实验室，GMP实验室能够为满足患者治疗疾病的需求提供干细胞的分离纯化、培养扩增、收集冻存、检测质控、细胞复苏、产品运输和细胞回输等技术应用。

本发明的有益效果是：牙髓间充质干细胞的特点：1、来源于外胚层的神经嵴；2、活性高，增殖速度快；3、免疫调节能力更强；4、来源丰富、容易获取；5、牙髓封闭腔结构，安全性好。牙髓干细胞改善糖尿病：促进胰岛组织增殖再生，提高胰岛素分泌，降低血糖，纠正免疫因子紊乱，缓解炎症。可以使用脱落乳牙干细胞改善2型糖尿病和1型糖尿病。本发明中使用的牙髓间充质干细胞是脱落乳牙干细胞，干细胞来源是6-12岁儿童脱落的乳牙，属于废弃物，采集过程不会对供者产生伤害，因此不存在伦理争议问题。另外牙髓腔是一个相对封闭的结构，乳牙从采集点运送到实验室的过程中可以保持很好的完整结构，牙齿切割和干细胞提取的过程都是在GMP实验室完成，因此其安全性与其他来源干细胞相比更高。2型糖尿病疗效评价：对20例糖尿病患者进行牙髓间充质干细胞疗法，治疗结束2～4个月，3例脱离胰岛素注射。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明作详细描述。

本发明公开了一种牙髓间充质干细胞改善糖尿病的方法，该牙髓间充质干细胞改善糖尿病的方法具体为：首先制备牙髓间充质干细胞，需要由牙科医生对乳牙进行拔出后，通过冷链运输将牙齿在冷藏状态下运送到细胞制备中心，然后在GMP条件下的实验室中切开牙齿提取其中的牙髓组织，进行牙髓中干细胞的提取；提取出的牙髓干细胞培养在培养瓶中进行传代和扩增，最后经过牙髓间充质干细胞鉴定检测，满足鉴定条件的细胞即为牙髓间充质干细胞；将制备好的牙髓间充质干细胞回输入糖尿病患者体内，回输方式采用静脉注射，每次50～70万个单位/kg，每隔20天注射一次，共注射3～4次，持续观察患者的使用效果，后续决定是否继续采用该疗法改善。

本发明牙髓间充质干细胞的鉴定条件为：呈梭状贴壁生长；细胞表面表达阳性Marker，不表达阴性Marker；具有牙髓和牙本质细胞分化能力；同时满足上述三个鉴定条件的即为牙髓间充质干细胞。

糖尿病病例1：王先生，69岁；病史资料：糖尿病十余合并肾脏受损。

临床现象：平时空腹血糖在服药的情况下维持在7.9─11 mmol之间，餐后2h血糖波动在18.mmol/L-23.0mmol/L之间。输注干细胞前检查空腹血糖10.2mmol/L ；糖化血红蛋白12.2% ；果糖胺411.0mmol/L；尿酮体＋＋＋，尿蛋白＋。用药情况：格列齐特缓释片90mg（3片）/次 3次/日二甲双胍缓释片500mg（1片）/次 3次/日。

2019年3月3日：第1次回输后两周随访，自感精力提升，有嗜睡现象，口干口渴症状减轻，检查空腹血糖在6.9-9.7mmol/L之间，感觉非常明显，停药一周测试干细胞的作用。2019年3月23日：第2次输注后二周随访，血糖在5.8-7.9mmol/L之间，持续监测10天，精神、活力增强，建议药物减量，格列齐特、二甲双胍各减1/3用量，继续监测血糖半个月。2019年4月27日：第3次输注后二周随访，血糖维持在7.0mmol/L左右，稳定，尿酮体阳性＋，尿蛋白消失。半年后随访，血糖基本控制在正常范围并稳定，肾功能检测指标全部正常，精神状态好，药物（格列齐特、二甲双胍）已减少（一半量）每次服一片，每日三次。2019年5月25日：第4次输注，输注后四周随访，外表变年轻，精神好，睡眠香，食欲佳，性功能增强，大小便正常，血糖接近正常稳定，药物一直维持原来水平的 25%的量，观察4周血糖无变化。

糖尿病病例2：张女士，59岁；糖尿病、高血压。

临床现象：糖尿病、高血压15年，哮喘二十余年，超重。平时血糖不稳定，血压控制在146╱90mmHg左右，秋天易哮喘，输注前检查，空腹血糖13.3mmol/L，糖化血红蛋白15.2%，血脂高，尿糖＋＋＋，尿酮体＋＋，尿蛋白＋。用药：二甲双胍缓释片500mg（1片）/次 2次/日，阿卡波糖 50mg（1片）/次 3次/日；甘精胰岛素注射早16u、晚12u。

2019年3月10日：第一次回输后两周随访，自述无明显感觉，血糖未检测，血压如常。2019年3月31日：第二次输注后二周随访，自述食欲增加，睡眠质量提高，精力提升，检测血糖8.9mmol/L，血压有下降140╱88mmHg，建议持续监测血糖10天，复查血糖、血脂、尿常规。2019年4月27日：第三次输注后二周随访，血糖检测基本稳定在7.6mmol/L左右，精神好，哮喘没有发作，皮肤变紧致细腻。三个月后复查血糖、血脂、尿常规，空腹血糖6.9，血脂异常值明显下降，尿糖、尿酮体、尿蛋白均转阴，体重减轻，精力充沛。

糖尿病病例3：孙先生，男，65岁，糖尿病+哮喘。

临床现象：上午7:00-8:00间监测空腹血糖，空腹血糖波动在7.0-7.2mmol之间；餐后：2h血糖波动在11.0mmol/L-13.0mmol/L之间。血液检查示：空腹血糖10.2mmol/L 糖化血红蛋白9.2% 果糖胺411.0mmol/L；药物治疗：格列齐特缓释片90mg（3片）/次 3次/日 二甲双胍缓释片500mg（1片）/次 3次/日。

2019年3月10日：第一次回输后两周：自感出现口干口渴症状 空腹血糖在6.9-9.7mmol/L之间，输注后一周随访：调整药物格列齐特2片/次，3次/日；二甲双胍 2片/次 3次/日；2019年3月31日：第二次回输后两周随访：3.17-3.29血糖呈下降趋势，波动在5.8-7.9mmol/L之间.；开始减量：格列齐特减量1片，1片/次，3次/日；二甲双胍减量1片 1片/次3次/日，自述精神状态变好；2019年9月31日，第二次回输后6个月随访：血糖波动在6.0-7.4mmol/L之间，药量再次减半：格列齐特1片/次，3次/日；二甲双胍1片/次，3次/日。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (2)

1.一种牙髓间充质干细胞改善糖尿病的方法，其特征在于：牙髓间充质干细胞改善糖尿病的方法具体为：首先制备牙髓间充质干细胞，需要由牙科医生对乳牙进行拔出后，通过冷链运输将牙齿在冷藏状态下运送到细胞制备中心，然后在GMP条件下的实验室中切开牙齿提取其中的牙髓组织，进行牙髓中干细胞的提取；提取出的牙髓干细胞培养在培养瓶中进行传代和扩增，最后经过牙髓间充质干细胞鉴定检测，满足鉴定条件的细胞即为牙髓间充质干细胞；将制备好的牙髓间充质干细胞回输入糖尿病患者体内，回输方式采用静脉注射，每次50～70万个单位/kg，每隔20天注射一次，共注射3～4次，持续观察患者的使用效果，后续决定是否继续采用该疗法改善。

2.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞改善糖尿病的方法，其特征在于：所述牙髓间充质干细胞的鉴定条件为：呈梭状贴壁生长；细胞表面表达阳性Marker，不表达阴性Marker；具有牙髓和牙本质细胞分化能力；同时满足上述三个鉴定条件的即为牙髓间充质干细胞。