CN111265673B - 一种对食蟹猴干细胞荧光示踪的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种对食蟹猴干细胞荧光示踪的方法，方法包括：通过食蟹猴皮肤建立纤维细胞系，对纤维细胞进行重编程，获得食蟹猴诱导多能干细胞；根据荧光素酶基因设计引物对，荧光素酶基因与引物对进行PCR反应；限制性内切酶对AAVS1载体质粒和PCR反应产物荧光素酶基因片段进行酶切，T4连接酶连接限制酶切后的产物得到重组AAVS1‑荧光素酶质粒，重组质粒插入食蟹猴诱导多能干细胞中；将获得荧光素酶标记基因的细胞和荧光素底物静脉注射进食蟹猴体内后，放入小动物活体成像仪体内进行荧光成像。采用本方法能够无创、有效监测细胞移植后在体内的存活能力、移动位置、分布情况与增殖情况等一系列生物学变化，为大型动物细胞移植的安全性和有效性提供实时性的参考数据。
Description
技术领域
本发明属于细胞移植技术领域，涉及一种对食蟹猴干细胞荧光示踪的方法。
背景技术
非人灵长类动物模型与人类在基因水平具有高度相似性，其与患者的症状比啮齿类动物模型和其他动物的症状更为接近，这对于理解疾病的机理，探究新的治疗方法的有效性具有巨大潜力。干细胞治疗已被广泛认为是治疗和治愈复杂疾病的一种新型治疗方法，食蟹猕猴多能干细胞(PSC)在形态，基因表达特征和生长特性方面与人多能干细胞相似，但与小鼠多能干细胞存在差异，这表明猕猴可能是回答某些关键问题的最佳模型。
传统研究细胞的移植效果主要是通过病理组织切片来进行评估,然而,这种方法不适用于监测细胞在活体内的生物学行为。荧光素与底物反应之后，在大动物体内难以通过小动物活体成像仪观察，本专利使用的荧光素酶是一种高灵敏度的新型荧光素酶，将荧光素酶标记的干细胞注射进食蟹猴体内，可有效的观察到干细胞在食蟹猴体内的分布情况与增殖情况，为临床前干细胞治疗提供参考。
生物发光成像技术被应用到细胞示踪领域,不仅可以无创、实时的评价干细胞移植情况,为客观动态评价干细胞在多种疾病治疗中的作用机制及生物学行为提供可能,还可以减少实验动物的数量以及由于实验动物个体差异而引起的误差。荧光素酶是一种具有生物活性的蛋白质,它在活体内无毒、无放射性、可代谢、可透过各种细胞膜和血脑屏障,且不会影响生物体正常生理功能。AAVS1位点是位于人19号染色体上PPP1R12C基因第一个内含子中的一段特定序列,在该区域内引入外源核苷酸序列已被证明不会影响PPP1R12C基因或其他内源基因的表达,并且对细胞的毒性小,是一个经过验证后确保插入靶基因正常转录且不影响邻近基因表达的安全港位点。CRISPR/Cas9系统在靶标基因组位点产生双链断裂位点后,可通过保真度高的同源重组修复将目的基因的敲入。通过核转仪将构建的质粒转入细胞核中，Cas9内切酶切割双链DNA，且有一段具有荧光素酶基因的高度同源的DNA修复模板存在的情况下，生物体内启动修复路径，将荧光素酶基因定点插入食蟹猴干细胞基因内部。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种对食蟹猴干细胞荧光示踪的方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案为：一种对食蟹猴干细胞荧光示踪的方法，包括以下步骤：
(1)通过食蟹猴皮肤建立纤维细胞系，通过重编程小因子对成纤维细胞进行重编程，获得食蟹猴诱导多能干细胞；
(2)根据荧光素酶基因设计引物对荧光素酶-F、荧光素酶-R；
(3)荧光素酶基因与引物对荧光素酶-F、荧光素酶-R进行PCR反应；
(4)PCR反应产物进行电泳获得荧光素酶基因片段，然后进行胶回收；使用SalI和MluI限制性内切酶对AAVS1载体质粒和PCR反应产物荧光素酶基因片段进行酶切；
(5)对酶切后的产物AAVS1-1载体质粒和荧光素酶-1基因片段电泳和胶回收，用T4连接酶连接酶切后的产物AAVS1-1载体质粒和荧光素酶-1基因片段，得到重组AAVS1-荧光素酶基因质粒；
(6)将多能干细胞消化成单细胞，再将重组AAVS1-荧光素酶基因质粒与单细胞混合后进行电转；测定核转后的多能干细胞基因序列,确定是否含有荧光素酶基因；电转产物中筛选出荧光素酶标记的细胞，用玻璃针将带有荧光素酶标记的细胞挑出转移到新的培养基中培养，多次传代扩大培养；
(7)麻醉食蟹猴后，将携带荧光素酶基因的多能干细胞消化成单细胞静脉注射进体内后；再注射荧光素底物，将食蟹猴放入小动物活体成像仪体内进行荧光成像。
优选的，所述引物对荧光素酶-F、荧光素酶-R序列为：
荧光素酶-F:5'-ACGCGTCGACGCCACCATGGAGGACGCCA-3'，
荧光素酶-R:5'-CGACGCGTTCACACGGCGATCTTGCCGT-3'。
优选的，所述PCR反应体积为50μl，扩增程序为:95℃ 3min；(95℃ 30s,65℃ 30s,72℃ 60s)×40；72℃ 5min，反应产物保存温度为4℃。
优选的，所述重组AAVS1-荧光素酶基因质粒转化到多能干细胞中方法如下：
(1)重组AAVS1-荧光素酶基因质粒与多能干细胞混合，冰浴5min，42度热激60秒；
(2)快速放入冰浴中2min后加入无抗的LB液体培养基；
(3)将含有多能干细胞的菌液加到对应抗性的LB平板上，均匀涂开培养。
优选的，所述LB液体培养基加入量为200ul，所述培养温度及时间为37℃过夜培养。
优选的，所述筛选荧光素酶标记细胞采用嘌呤霉素(1ug/ml)。
优选的，所述荧光底物为TokeOni(≥75nmol/g，MERK)，食蟹猴注射单细胞浓度为(2*105/ul，细胞总量≥1000个)。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：本方法的荧光素酶灵敏度高，穿透力强，少量细胞依然可以在大动物体内进行示踪观察。AAVS1位点是已经被证实的一个安全编辑位点，在AAVS1位点进行荧光素酶的插入并不会改变细胞的生存状态。因此本方法能够无创、有效监测细胞移植后在体内的存活能力、移动位置、分布情况与增殖情况等一系列生物学变化，为评估干细胞移植的安全性与有效性提供一种实时性的参考数据。
附图说明
图1为荧光素酶基因插入食蟹猴AAVS1位点示意图；
图2为荧光素酶标记的干细胞小动物活体成像示意图；
图3为通过PCR扩增出荧光素酶基因的琼脂糖凝胶电泳图；
图4为将荧光素酶标记的干细胞通过静脉注射入食蟹猴体内通过小动物活体成像示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：
如图1所示，一种对食蟹猴干细胞荧光示踪的方法，包括以下步骤：
(1)通过食蟹猴皮肤建立纤维细胞系，通过重编程小因子对成纤维细胞进行重编程，获得食蟹猴诱导多能干细胞；
(2)根据荧光素酶基因设计引物对荧光素酶-F、荧光素酶-R；
(3)荧光素酶基因与引物对荧光素酶-F、荧光素酶-R进行PCR反应；
(4)如图3所示，PCR反应产物进行电泳获得荧光素酶基因片段，然后进行胶回收；
电泳采用琼脂糖凝胶，步骤为：
a.将购买的TAE溶液与蒸馏水混合，终浓度为含有1％的TAE溶液；
b.用天平秤量琼脂糖粉末，与1％TAE溶液混合后加热溶解，溶解后加入购买的染料混匀后将溶液倒入制胶板中，冷却后得到琼脂糖凝胶。
胶回收采用DNA凝胶回收试剂盒,步骤为：
a.将PCR产物与等体积的膜结合液颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合，12000rpm离心分1钟，倒掉收集管中的废液；
b.加入700μl的漂洗液(含乙醇)于离心纯化柱中，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液；
c.重复步骤b；
d.12000rpm离心3分钟；
e.将离心纯化柱置于新的离心管中；
f.加入30μl超纯水，在室温下静置5分钟；
g.12000rpm离心1分钟，管底溶液即为纯化过的目的基因PCR产物。使用由NewEngland Biolabs(Beijing)LTD购买的SalI和MluI限制性内切酶对AAVS1载体质粒和PCR反应产物荧光素酶基因片段进行酶切；
(5)对酶切后的产物AAVS1-1载体质粒和荧光素酶-1基因片段电泳和胶回收，用T4连接酶连接酶切后的产物AAVS1-1载体质粒和荧光素酶-1基因片段，得到重组AAVS1-荧光素酶基因质粒；
(6)将多能干细胞消化成单细胞，再将重组AAVS1-荧光素酶基因质粒与单细胞混合后进行电转；测定核转后的多能干细胞基因序列,确定是否含有荧光素酶基因；电转产物中筛选出荧光素酶标记的细胞，用玻璃针将带有荧光素酶标记的细胞挑出转移到新的培养基中培养，多次传代扩大培养；
(7)麻醉食蟹猴后，将携带荧光素酶基因的多能干细胞消化成单细胞静脉注射进体内后；再注射荧光素底物，如图4所示，将食蟹猴放入小动物活体成像仪体内进行荧光成像。
优选的，所述引物对荧光素酶-F、荧光素酶-R序列为：
荧光素酶-F:5'-ACGCGTCGACGCCACCATGGAGGACGCCA-3'，
荧光素酶-R:5'-CGACGCGTTCACACGGCGATCTTGCCGT-3'。
优选的，所述PCR反应体积为50μl，扩增程序为:95℃ 3min；(95℃ 30s,65℃ 30s,72℃ 60s)×40；72℃ 5min，反应产物保存温度为4℃。
优选的，所述重组AAVS1-荧光素酶基因质粒转化到多能干细胞中方法如下：
(1)重组AAVS1-荧光素酶基因质粒与多能干细胞混合，冰浴5min，42度热激60秒；
(2)快速放入冰浴中2min后加入无抗的LB液体培养基；
(3)含有多能干细胞的菌液加到对应抗性的LB平板上，均匀涂开培养。
优选的，所述LB液体培养基加入量为200ul，所述培养温度及时间为37℃过夜培养。
优选的，所述筛选荧光素酶标记细胞采用嘌呤霉素(1ug/ml)。
优选的，所述荧光底物为TokeOni(≥75nmol/g，MERK)，食蟹猴注射单细胞浓度为(2*105/ul，细胞总量≥1000个)。
实施例1
AAVS1供体质粒购于Addgene，荧光素酶片段购于武汉淼灵生物科技有限公司，限制性内切酶SalI、MluI和T4连接酶购自NEB公司；DNA凝胶回收试剂盒、无内毒素质粒大提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。Lonza 4D核转仪购自LONZA公司；小动物活体成像仪购自珀金埃尔默。通过食蟹猴皮肤建立纤维细胞系，通过重编程小因子对成纤维细胞进行重编程，获得食蟹猴诱导多能干细胞；设计引物包含荧光素酶片段,上游引物为荧光素酶-F:5'-ACGCGTCGACGCCACCATGGAGGACGCCA-3',下游引物为荧光素酶-R:5'-CGACGCGTTCACACGGCGATCTTGCCGT-3'。荧光素酶基因与引物对荧光素酶-F、荧光素酶-R进行PCR反应，PCR反应体系50μl；反应条件:95℃ 3min；(95℃ 30s,65℃ 30s,72℃ 60s)×40；72℃ 5min；保存4℃。琼脂糖凝胶电泳获得目的片段，片段大小为1653bp；DNA凝胶回收试剂盒进行胶回收。SalI和MluI限制性内切酶对AAVS1载体质粒和PCR产物进行酶切，37度水浴酶切3-4小时或酶切过夜，对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1。胶回收后，-20℃保存。将多能干细胞消化成单细胞，重组AAVS1-荧光素酶基因质粒与单细胞混合，冰浴5min，42度热激60秒。加200ul无抗的LB液体培养基，将多能干细胞的菌液加到对应抗性的LB平板上，均匀涂开，37度过夜培养。从板内挑取菌落8个分别装于收纳管中振荡培养后测序,确定是否含有目的基因克隆。将细胞转移至电转仪提供的电转杯中进行电转，48小时后用嘌呤霉素(1ug/ml)筛选出荧光标记的细胞，多次传代扩大培养。在进行食蟹猴活体成像前，先使用硫酸阿托品注射液(H41021257,遂成药业股份有限公司,河南)0.2mL；盐酸氯胺酮(H35020148,古田药业有限公司,福建)0.2mL麻醉食蟹猴，再将细胞(2*105/ul)静脉注射进体内后按照剂量注射荧光素底物TokeOni(75nmol/g，MERK)。最后将食蟹猴放入小动物活体成像仪体内进行荧光成像，结果如图2所示。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
Claims (5)
1.一种用于荧光示踪的食蟹猴干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)通过食蟹猴皮肤建立纤维细胞系，通过重编程小因子对成纤维细胞进行重编程，获得食蟹猴诱导多能干细胞；
(2)根据荧光素酶基因设计引物对荧光素酶-F、荧光素酶-R；
(3)荧光素酶基因与引物对荧光素酶-F、荧光素酶-R进行PCR反应；
(4)PCR反应产物进行电泳获得荧光素酶基因片段，然后进行胶回收；使用SalI和MluI限制性内切酶对AAVS1载体质粒和PCR反应产物荧光素酶基因片段进行酶切；
(5)对酶切后的产物AAVS1-1载体质粒和荧光素酶基因片段电泳和胶回收，用T4连接酶连接酶切后的产物AAVS1-1载体质粒和荧光素酶-1基因片段，得到重组AAVS1-荧光素酶基因质粒；
(6)将多能干细胞消化成单细胞，再将重组AAVS1-荧光素酶基因质粒与单细胞混合后进行电转；测定核转后的多能干细胞基因序列,确定是否含有荧光素酶基因；电转产物中筛选出荧光素酶标记的细胞，用玻璃针将带有荧光素酶标记的细胞挑出转移到新的培养基中培养，多次传代扩大培养；
所述引物对荧光素酶-F、荧光素酶-R序列为：
荧光素酶-F:5'-ACGCGTCGACGCCACCATGGAGGACGCCA-3'，
荧光素酶-R:5'-CGACGCGTTCACACGGCGATCTTGCCGT-3'。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR反应体积为50μl，扩增程序为:95℃3min；(95℃30s,65℃30s,72℃60s)×40；72℃5min，反应产物保存温度为4℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组AAVS1-荧光素酶基因质粒转化到多能干细胞中方法如下：
(1)重组AAVS1-荧光素酶基因质粒与多能干细胞混合，冰浴5min，42度热激60秒；
(2)快速放入冰浴中2min后加入无抗的LB液体培养基；
(3)将含有多能干细胞的菌液加到对应抗性的LB平板上，均匀涂开培养。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述LB液体培养基加入量为200ul，所述培养温度及时间为37℃过夜培养。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述筛选荧光素酶标记细胞采用嘌呤霉素。
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| Improving Cell Survival in Injected Embryos Allows Primed Pluripotent Stem Cells to Generate Chimeric Cynomolgus Monkeys;Yu Kang等;《Cell Reports》;20181127;第25卷;第2576.e6页第1-4段 * |
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