CN111265506A

CN111265506A - 棉籽油酸在制备质粒接合转移抑制剂和/或抗菌药物中的应用

Info

Publication number: CN111265506A
Application number: CN202010136216.6A
Authority: CN
Inventors: 孙坚; 黄昊旻; 邹雯瑾; 江颖琳; 刁晓苑; 吉俊柔; 李龚
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-03-02
Filing date: 2020-03-02
Publication date: 2020-06-12

Abstract

本发明提供了棉籽油酸在制备质粒接合转移抑制剂和/或抗菌药物中的应用。本发明首次发现了棉籽油酸可有效抑制耐药质粒接合转移，在安全浓度范围内，棉籽油酸抗质粒接合转移效率达80％以上，并且抗质粒转移效果最好。同时，本发明研究发现棉籽油酸半数细胞毒性浓度为5.401mM，较现有技术中的其他植物油酸毒性更低、更为安全。本发明还发现了棉籽油酸有良好的抗菌活性，尤其是对革兰氏阳性菌的抗菌活性显著，具有广阔的应用前景。

Description

棉籽油酸在制备质粒接合转移抑制剂和/或抗菌药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，特别涉及棉籽油酸在制备质粒接合转移抑制剂和/或抗菌药物中的应用。

背景技术

众所周知，致病菌与人类健康和生产息息相关。流行病学调查显示，ICU重症感染中革兰阴性菌所致感染高达70％，可见革兰氏阴性菌十分肆虐。

革兰氏阴性菌有能引起肠道疾病的大肠埃希氏菌及其各类型致病株、传染病霍乱的病原体霍乱弧菌、诱发伤口感染的条件致病菌铜绿假单胞菌和鼠疫的病原体鼠疫杆菌，以及引发痢疾常见的志贺氏痢疾杆菌等等，其中不少都是人畜共患菌。革兰氏阳性杆菌感染发病率近年来有所升高。该类感染包括无芽孢革兰氏阳性菌李斯特菌、放线菌、棒状杆菌、红斑丹毒丝菌及产芽孢革兰氏阳性菌芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属细菌感染。

大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，而大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病。

想要对抗细菌感染，可以根据药敏反应，选择敏感的抗生素进行治疗，以此杀灭病原菌。抗生素被认为是人类医学史上的奇迹，自从20世纪20年代末被发现以来，抗生素拯救了无数人的生命。除了用于人类细菌感染性疾病的治疗之外，抗生素也被广泛应用于农业及畜牧养殖业，为人类社会和经济的发展作出了重要贡献。然而，时至今日，人们不得不重新审视抗生素应用所带来的负面影响——细菌耐药。

近年来，细菌耐药问题受到了全世界范围内前所未有的高度关注，新抗菌药物开发研制速度的降低，而细菌耐药性常为不可逆，抗菌药物耐药性成为需要紧急采取行动的全球性问题。

细菌耐药机制研究中，水平基因转移是人们广泛关注的热点，与细菌耐药性传播和扩散密切相关。耐药质粒是介导耐药基因水平转移的主要元件之一，通过抑制质粒接合转移，可以减少耐药基因扩散，这是目前克服细菌耐药性的一个重要方向，我们可以通过找到新的质粒接合转移抑制剂来遏制细菌耐药性的传播。

现有研究认为，部分不饱和脂肪酸可以作为质粒接合转移过程中运输ATP酶的特异性抑制剂，如亚油酸可抑制ATP酶TrwD。通过使用HTC测定，发现不饱和脂肪酸在不影响细胞生长的情况下抑制INCF和IncW质粒的接合转移。除了亚油酸，还有2-HDA,2-alkynoicfatty acids和TZAs，这些化合物使质粒转移频率降低了100倍。

这些化合物的优点是它们对动物细胞的毒性较低，且价格较为低廉，但必须达到更高的抑制率才能最大限度地发挥它们的作用。

尽管2-HDA和2-ODA很容易通过化学合成获得，并提供了重要的结构信息。然而，它们的抗真菌、抗原生动物、抗微生物和细胞毒性活性较大，排除了它们在必须维持生物多样性的自然环境中的使用，使用十分受限。另一方面，TZA-A和TZA-B，以及油酸和亚油酸，虽然毒性较低，但是可能不够稳定。

因为质粒接合抑制剂起预防分子的作用，但不会引起直接的治疗作用，它们的实际应用需要在质粒接合发生的环境中给药。因此，质粒接合转移抑制剂的毒性必须降低。综上所述，目前能够投入应用的不饱和脂肪酸少之又少，需要开发更多具有潜在应用价值的化合物。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供棉籽油酸在制备质粒接合转移抑制剂中的应用；所述的棉籽油酸可有效抑制耐药质粒接合转移，且毒性较低。

本发明的另一目的在于提供棉籽油酸在制备抗菌药物中的应用；所述的棉籽油酸对革兰氏阳性菌有显著的抗菌活性。

本发明的又一目的在于提供所述的棉籽油酸在制备抑制质粒接合转移且同时抗菌的药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

棉籽油酸在制备质粒接合转移抑制剂中的应用。

所述的棉籽油酸优选通过皂化酸解法制得。

所述的皂化酸解法的具体步骤优选为：

(1)在棉籽油中加入碱进行皂化反应，得到棉籽油脂肪酸盐；

(2)在棉籽油脂肪酸盐中加入酸液进行酸解反应，即得所述的棉籽油酸。

步骤(1)中所述的碱优选为强碱；进一步优选为氢氧化钠。

步骤(1)中所述的碱的用量优选较棉籽油过量；更优选的，所述的碱的用量优选按植物油：碱(一元碱)的摩尔比为1:1.5-1:4加入。

步骤(1)中所述的皂化反应的温度优选为65-85℃。

步骤(1)中所述的皂化反应的时间优选为2-6h。

步骤(2)中所述的酸优选为强酸，进一步优选为盐酸。

步骤(2)中所述的酸解反应的pH优选为pH＝1-2。

步骤(2)中所述的酸解反应的时间优选为30min-1h。

所述的棉籽油酸还可以进行纯化、干燥等后处理步骤，进一步得到纯化后的棉籽油酸。

所述的纯化包括萃取、洗涤等步骤。

所述的萃取优选为将步骤(2)得到的棉籽油酸用乙酸乙酯进行萃取。

所述的洗涤包括用饱和食盐水和/或水进行洗涤；更优选的，先用饱和食盐水洗涤后，再用水洗涤。

所述的用饱和食盐水洗涤的次数优选为6次。

所述的用水洗涤的次数优选为1次。

所述的干燥包括用无水MgSO₄进行干燥和/或真空干燥；更优选的，先用无水MgSO₄进行干燥，抽滤、旋蒸后，再进行真空干燥。

所述的用无水MgSO₄进行干燥的时间优选为6-48h。

所述的旋蒸的时间优选为20min-2h。

所述的真空干燥的温度优选为50-80℃；所述的真空干燥的时间优选为12-48h。

棉籽油酸在制备抗菌药物中的应用。

所述的抗菌优选为抗革兰氏阳性菌；包括金黄色葡萄球菌。

棉籽油酸在制备抑制质粒接合转移且同时抗菌的药物中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明首次发现了棉籽油酸能够有效抑制质粒接合转移，其相比于现已发现的不饱和脂肪酸(如亚麻油酸等)毒性更低、更安全，且具有良好的抗菌活性和抗质粒接合转移活性。

根据抗质粒接合转移活性评价实验所得，在安全浓度范围内，棉籽油酸抗质粒接合转移效率达80％以上，而亚麻油酸抗质粒接合转移效率仅为50％；且棉籽油酸在众多植物油酸中抗质粒转移效果最好。

根据抗菌活性评价实验所得，棉籽油酸与亚麻油酸抗菌活性相当，且不亚于其他植物油酸。

根据细胞毒性实验所得，棉籽油酸CC₅₀(半数细胞毒性浓度)为5.401mM，而先前所发现的毒性较低的亚油酸CC₅₀则为1.850mM；且棉籽油酸在众多植物油酸中的CC₅₀最高。CC₅₀越高，说明该化合物对细胞的毒性越小，显而易见，棉籽油酸毒性最低。

综上所述，棉籽油酸在具有较好的抗菌活性、抗质粒接合转移活性的同时，毒性最低、最安全，相比于其他植物油酸可能具有更好的应用前景。

附图说明

图1是扁桃仁油(a)及蓖麻油(b)的水解反应原理示意图。

图2是扁桃仁油及扁桃仁油酸的核磁共振氢谱图。

图3是棉籽油水解前后的GPC曲线结果图。

图4是蓖麻油及蓖麻油酸的红外光谱对比结果图。

图5是植物油酸抗质粒接合转移效率的结果分析图。

图6是棉籽油酸、扁桃仁油酸、亚麻油酸和蓖麻油酸对Marc-145细胞的细胞毒性的结果分析图。

图7是橄榄油酸、牡丹籽油酸和亚油酸对Marc-145细胞的细胞毒性的结果分析图。

其中，在图2～4中，英文缩写含义如下：

蓖麻油 CO 蓖麻油酸 COFA

亚麻油 LO 亚麻油酸 LOFA

橄榄油 OO 橄榄油酸 OOFA

扁桃仁油 BTRO 扁桃仁油酸 BTRFA

牡丹籽油 MDZO 牡丹籽油酸 MDZFA

棉籽油 MZO 棉籽油酸 MZOFA

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1制备植物油酸

本实施例采用植物油的皂化反应制备得到对应的植物油酸，并对植物油酸进行了结构表征研究：

1.皂化反应实验

(1)实验方法

本实验使用45g植物油作为原料进行水解，可获得20-40g对应的植物油酸。

将45g植物油和200mLNaOH水溶液(植物油：NaOH摩尔比＝1:1.5-1:4)在65-85℃，100-300rpm转速下反应2-6h，加入浓盐酸酸化至pH为1-2，继续搅拌30min-1h，降温后用乙酸乙酯进行萃取，用饱和食盐水洗涤6次，最后用无水MgSO₄干燥6-48h，抽滤，旋蒸20min-2h，50-80℃真空干燥12-48h，得到干净高纯的植物油酸。

(2)反应原理

图1展示了扁桃仁油(a)及蓖麻油(b)的水解反应原理，植物油的皂化反应实则为酯基在碱性条件下的水解反应，生成羧酸钠乳化剂，经酸化形成羧酸的过程，但由于植物油的双键的位置及数目的不确定性，所得的植物油酸也并非为单一组成。蓖麻油是三条单链均为一致的植物油，结构简单，所得的蓖麻油脂肪酸具有较好的亲水性因其脂肪链上挂有一羟基，橄榄油是三条单链均为一致的植物油，但无羟基；而扁桃仁油则属于三条链均不同的植物油，这是两种极端的情况，其余植物油则介于这两者之间，这将导致分子结构出现差异，但不会影响水解反应的进行。

2.测试表征

(1)H¹NMR

以扁桃仁油为例进行分析，图2，所用为核磁共振氢谱(1H)，取5mg样品，加入800μL的CDCl₃进行溶解配样。

各峰对应位点已经标出，扁桃仁油中的酯基氢(2，4.10-4.35ppm)经水解后已彻底消失，同时，甘油三酯结构中间位点的氢(3，5.25-5.30ppm)也完全消失，说明扁桃仁油已经完全水解，并且产物干净高纯无杂质，并无残留的甘油；1号位(5.30-5.45ppm)是顺式双键氢的出峰，水解前后位置大致相同，仅积分数值存在差别，可认为双键完整地保留下来，扁桃仁油酸的结构没有被破坏。

其余植物油及其对应的水解产物也类似于扁桃仁油及扁桃仁油酸的图谱，可认为水解已经彻底，且植物油酸较少发生变质。

(2)凝胶渗透色谱(GPC)

取5mg左右的样品，用1.5mL的四氢呋喃(THF)进行溶解配样，调节凝胶渗透色谱GPC流量为0.3mL·min^-1进行测试。

由GPC曲线(图3)可以看出，水解前的植物油分子量较大，保留时间更短，绝大多数植物油为单峰，而棉籽油为双峰，这是由于原料生产制备过程中所产生，不排除棉籽油被氧化的可能，但水解后棉籽油酸为单峰且保留时间延长，说明水解仍然彻底；水解后保留时间均增加，说明分子量变小，峰形均为单峰，结合核磁结果，进一步印证了水解完全的结论。

整体地看，大部分植物油和植物油酸的分子量相似，曲线重叠，这是由于双键数目的不同引起，而蓖麻油及蓖麻油酸的峰均偏左，这是由于其链上含有羟基，导致其分子量更大，保留时间稍短，也进一步验证两者的高纯度。

(3)红外光谱FTIR

以蓖麻油及蓖麻油酸为例，进行红外光谱分析，选用溴化钾作空白，监测波数为4000-500cm^-1的透过率。选取位于2960cm^-1的-CH₃伸缩振动为基准峰，进行水解前后的对比，结果如图4所示，事实上，水解前后大部分的官能团并无发生变化，比如，位于1730cm^-1左右的羰基伸缩吸收仍然存在，唯一的差别在于酯基和羧基的变化，从酯基的C-O-C转变为羧基的C-O-H。因此，蓖麻油酸在3000-3500cm^-1的O-H吸收增强(蓖麻油也有吸收，这是本来就含有-OH的原因)，水解后位于1250cm^-1附近的C-O-C吸收减弱，这是由于C-O-H的不对称性不如C-O-C的强，两边碳接连的是庞大的烷基基团，振动更为剧烈，说明C-O-H的出现；除此之外，出峰位置均有所右移，这是生成的-COOH形成分子内或分子间氢键使得束缚增加，振动幅度变弱所致。综上所述，蓖麻油的确发生了水解，也生成了羧基，证明蓖麻油酸的出现。

实施例2植物油酸抗质粒接合转移活性体外评价

1.实验准备

麦康凯单药板(含25μg/mL亚碲酸钠tpm)若干、麦康凯双药板(含25μg/mL亚碲酸钠tpm，250μg/mL利福平rif)若干、4mLLB试管肉汤若干、PBS、LB肉汤、二甲基甲酰胺(用作植物油酸的溶剂)、各种不饱和脂肪酸。

2.菌液培养

供体菌CSZ4LC2已在中国专利申请CN201910355278.3中公开；LB固体培养基琼脂和LB肉汤均购自环凯(HKM)。

将供体菌在含有AMP的LB固体培养基(AMP浓度为100μg/mL)上划线接种，受体菌E.coliC600在LB固体培养基上划线接种，37℃过夜培养；培养完成后在两个平板上各挑取一个单菌落加入4mLLB试管肉汤中，培养供体菌-CSZ4LC2的4mL LB试管肉汤应加入AMP(AMP浓度为100μg/mL)，将两支试管肉汤置于摇床中，37℃过夜培养；再取供体菌50μL、受体菌100μL分别加入新的4mL LB试管肉汤中，培养至生长对数期(约2.5h-3h)；将试管肉汤加入到10mL EP管，离心，加入6mL PBS涡旋，离心(重复两次)；最后加入PBS 10mL(视实验需要而定)混匀，分别得到供体菌和受体菌待用。

3.接合转移

加入250μL受体菌+250μL供体菌+490μL LB肉汤+10μL植物油酸样品(1.9mM,3.8mM,7.5mM,15mM,30mM，每个浓度都要做)于2mL EP管中，静止培养4h；注意做三个平行对照。阳性对照：每组均做阳性对照*3，即250μL受体菌+250μL供体菌+490μL LB肉汤+10μL LB肉汤；得到对应的接合转移产物。

4.稀释涂板

接合转移产物100μL+900μL倍比用PBS进行稀释，稀释至原浓度的-1、-2、-3、-4、-5、-6梯度，稀释时每个EP管都要涡旋，确保菌液均匀。

每个浓度取25μL滴板：

麦康凯单药板(该药板上会长出供体菌和成功转入荧光质粒的受体菌)：滴-6、-5、-4、-3浓度；

麦康凯双药板(该药板上会长出成功转入荧光质粒的受体菌)：滴-3、-2、-1、0浓度。静置干后倒置烘箱培养过夜，第二天计数。

5.实验结果

结果如图5所示，由图可见，棉籽油酸相比其他植物油酸，可极显著抑制质粒接合转移，效果最好。

实施例3植物油酸抗菌活性评价

1.实验准备

(1)工器具的灭菌

将配置好的MH肉汤培养基(环凯(HKM)MH肉汤)、PBS缓冲液、二甲基甲酰胺、配套枪头、离心管放入高压灭菌锅中灭菌，121℃杀菌25min。96孔板在超洁净工作台上紫外杀菌30min以上。

(2)菌悬液的配置

细菌在培养皿上划线37℃培养16h-18h，具体的，大肠杆菌ATCC25922在麦康凯培养基上进行，金黄色葡萄球菌ATCC29213在LB琼脂培养基上进行。用4mL试管挑取单菌落接菌，37℃、180rpm培养3h后稀释100倍。

2.实验步骤

以96孔板的A行为例：

第一步：A1加180μL的MH肉汤培养基A2-A12孔各加100μL的MH肉汤培养基。

第二步：在A1孔加入20μL预先用二甲基甲酰胺稀释4倍的植物油酸样品，用枪吹打30次充分混匀后，吸取100μL至A2孔……以此类推梯度稀释到A12孔后，吸取100μL弃去。

第三步：在A1-A12每孔中加入100μL步骤(3)稀释好的菌悬液。

三行一般为同一种植物油酸的三次平行试验，即A、B、C行1种植物油酸，D、E、F行1种植物油酸。

G行为阳性对照，每孔加入100μL的MH肉汤培养基+100μL菌悬液。

H行为阴性对照，每孔加入200μL空白MH肉汤培养基。

将96孔板放入37℃恒温培养箱16-20小时后，观察结果。

3.结果观察记录

(1)MIC值的判定：96孔板上横排中未有沉淀的最后一孔所对应的浓度便为该药的MIC值。

(2)观察所做的阴性对照和阳性对照结果。

(3)记录结果并将每种化合物的MIC值做成图表。

4.实验结果

表1 各化合物对不同菌种的MIC值

备注：“-”表示MIC值未测得。

结果分析：

阿米卡星是针对革兰氏阴性菌(大肠杆菌、沙门氏菌)的抗生素，利奈唑胺是针对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)的抗生素，采用这2种药物作为参照，以便我们更好地研究了解化合物(植物油酸)的抗菌活性；由于植物油酸为非水溶性物质，因此用二甲基甲酰胺作为溶剂，亦对该溶剂对菌株的影响进行了比对研究。

根据实验结果，植物油酸对革兰氏阳性菌的抗菌活性非常强，对革兰氏阴性菌基本没有抗菌活性或抗菌活性很弱。

实施例4植物油酸细胞毒性评价

此处用MTT法测定化合物对Marc-145细胞的半数细胞毒性浓度(CC₅₀)：

1.将约浓度为1.5×10⁵/mLMarc-145细胞(购自华拓生物Otwo Biotech)接种在96孔板中，每孔100μL，置37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24h；PBS洗两遍，加系列浓度的化合物，设置1、0.5、0.25、0.12、0.06、0.03V/V％这6个浓度(溶剂为细胞维持液)梯度的植物油酸组；并设仅含DMEM的空白对照组。对照组与实验组均设置6个重复。

2.在培养48h后，弃上清，用DMEM基础培养液将5mg/mL的MTT母液稀释成终浓度为0.5mg/mL的MTT溶液，加到96孔板中，每孔100μL，37℃避光孵育4h；培养终止后，弃上清，加入DMSO 150μL/孔，低速振荡器振荡10min，使甲瓒结晶充分溶解；用全波长酶标仪于波长490nm下检测其OD值，并计算细胞存活率。

细胞存活率(％)＝100×(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)

3.图表建立

使用Graph Pad Prism软件对所得各实验组的细胞存活率进行图标制作和CC₅₀的计算。

4.实验结果

结果如图6、图7所示，在3.8mM时，棉籽油酸与其他植物油酸相比依然具有较高的细胞存活率。根据实验数据，计算得到棉籽油酸、扁桃仁油酸、亚麻油酸、蓖麻油酸、橄榄油酸、牡丹籽油酸、亚油酸在Marc-145细胞中的半数细胞毒性浓度(CC₅₀)分别为5.401mM、1.064mM、1.850mM、1.161mM、1.811mM、1.129mM、0.9364mM。棉籽油酸的CC₅₀最高，代表毒性最低、最安全，有广阔的应用价值。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.棉籽油酸在制备质粒接合转移抑制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的棉籽油酸在制备质粒接合转移抑制剂中的应用，其特征在于：

所述的棉籽油酸通过皂化酸解法制得。

3.根据权利要求2所述的棉籽油酸在制备质粒接合转移抑制剂中的应用，其特征在于，所述的皂化酸解法的具体步骤为：

(1)在棉籽油中加入碱进行皂化反应，得到棉籽油脂肪酸盐；

4.根据权利要求3所述的棉籽油酸在制备质粒接合转移抑制剂中的应用，其特征在于：

所述的棉籽油酸还包括萃取、洗涤、干燥后处理步骤，进一步得到纯化后的棉籽油酸；

步骤(1)中所述的碱为强碱；

步骤(2)中所述的酸为强酸。

5.根据权利要求4所述的棉籽油酸在制备质粒接合转移抑制剂中的应用，其特征在于：

步骤(1)中所述的碱为氢氧化钠；

步骤(1)中所述的碱的用量按植物油：碱的摩尔比为1:1.5-1:4加入，所述的碱按一元碱计算；

步骤(2)中所述的酸为盐酸；

所述的萃取为将步骤(2)得到的棉籽油酸用乙酸乙酯进行萃取；

所述的洗涤包括用饱和食盐水和/或水进行洗涤；

所述的干燥包括用无水MgSO₄进行干燥和/或真空干燥。

6.根据权利要求5所述的棉籽油酸在制备质粒接合转移抑制剂中的应用，其特征在于：

步骤(1)中所述的皂化反应的温度为65-85℃；

步骤(1)中所述的皂化反应的时间为2-6h；

步骤(2)中所述的酸解反应的pH为pH＝1-2；

步骤(2)中所述的酸解反应的时间为30min-1h；

所述的干燥为先用无水MgSO₄进行干燥，抽滤、旋蒸后，再进行真空干燥；

所述的旋蒸的时间为20min-2h；

所述的真空干燥的温度为50-80℃；所述的真空干燥的时间为12-48h。

7.棉籽油酸在制备抗菌药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的棉籽油酸在制备抗菌药物中的应用，其特征在于：

所述的抗菌为抗革兰氏阳性菌。

9.根据权利要求8所述的棉籽油酸在制备抗菌药物中的应用，其特征在于：

所述的革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌。

10.棉籽油酸在制备抑制质粒接合转移且同时抗菌的药物中的应用。