CN111257459A - 一种分离纯化杀鼠灵原药样品中未知杂质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物分析领域，具体公开了一种分离纯化杀鼠灵原药样品中未知杂质的方法，至少包括以下步骤：首先称取待检测的杀鼠灵原药，加入溶剂溶解，得到杀鼠灵原药溶液；其次再将杀鼠灵原药溶液注入色谱仪中进行检测，并控制其进样量、紫外检测波长、色谱柱、柱温、流动相和流速，可将杀鼠灵原药样品中的杂质进行有效分离，本发明采用的分析方法具有分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高的优点。

Description

一种分离纯化杀鼠灵原药样品中未知杂质的方法
技术领域
本发明涉及药物分析领域，具体涉及一种分离纯化杀鼠灵原药样品中未知杂质的方法。
背景技术
制备液相色谱是以获取纯样品为目的的一种分离技术，自20世纪30年代应用于色素的分离至今，得到了长足发展。20世纪80年代高效制备液相色谱在医药工业中有了迅速的发展，90年代在蛋白的分离纯化上得到大量应用。如今，制备色谱几乎在社会生产生活的各个领域均有应用，如次生类代谢产物、天然产物、大分子化合物及某些重要的药用生物活性蛋白、生物治疗品与诊断试剂的分离纯化。
但是在现有技术中对杀鼠灵原药样品中未知杂质分离和纯化的方法较为复杂，由此研究一种精准、快速、高灵敏度、重复性高的分析方法是本领域技术人员研究的热点。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种分离纯化杀鼠灵原药样品中未知杂质的方法，至少包括以下步骤：
(1)称取待检测的杀鼠灵原药，加入溶剂溶解，得到杀鼠灵原药溶液；
(2)将杀鼠灵原药溶液注入色谱仪中进行检测，并控制其进样量、紫外检测波长、色谱柱、柱温、流动相和流速，得到结果。
作为本发明一种优选的技术方案，所述步骤(1)中的溶剂选自DMF、甲醇、乙腈、水中的一种或多种。
作为本发明一种优选的技术方案，步骤(1)中所述的溶剂为DMF和乙腈，其中DMF和乙腈的体积比为1：(2～6)。
作为本发明一种优选的技术方案，所述杀鼠灵原药溶液的浓度为150～250mg/mL；所述进样量为8～18mL。
作为本发明一种优选的技术方案，所述紫外检测波长为220nm～360nm。
作为本发明一种优选的技术方案，所述色谱柱为Waters Xbridge C18，长度为250mm，内径为30mm，粒径10μm。
作为本发明一种优选的技术方案，所述流动相选自甲醇、乙腈、水、磷酸二氢钾水溶液、磷酸二氢钠水溶液中的一种或多种。
作为本发明一种优选的技术方案，所述流动相为乙腈和磷酸二氢钠水溶液。
作为本发明一种优选的技术方案，所述流动相在0～30min内为梯度洗脱，在0min时，乙腈和磷酸二氢钠水溶液的体积比为1:9；在30min时，乙腈和磷酸二氢钠水溶液的体积比为(7:3)～(9:1)。
作为本发明一种优选的技术方案，所述流速为30-50mL/min。。
有益效果：本发明提供了一种分离纯化杀鼠灵原药样品中未知杂质的方法，本发明通过对方法的合理设计，与现有的方法技术相比，具有明显的优点：分离杂质的精确度高、纯度高，杂质的专属性、线性及范围、回收率、精密度、耐用性等试验均良好；且流动相配制简单、检测成本低等。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中鼠灵原药样品HPLC-MS预扫描的HPLC谱图。
图2为实施例1中鼠灵原药样品HPLC-MS预扫描的MS谱图。
图3为实施例1中杂质纯品的HPLC谱图。
图4为实施例1中杂质纯品的MS谱图。
图5为实施例1中杂质纯品的HNMR谱图。
图6为实施例1中杂质纯品的CNMR谱图。
具体实施方式
参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由…组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由…组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种分离纯化杀鼠灵原药样品中未知杂质的方法，至少包括以下步骤：
(1)称取待检测的杀鼠灵原药，加入溶剂溶解，得到杀鼠灵原药溶液；
(2)将杀鼠灵原药溶液注入色谱仪中进行检测，并控制其进样量、紫外检测波长、色谱柱、柱温、流动相和流速，得到结果。
在一种优选的实施方式中，所述步骤(1)中的溶剂选自DMF、甲醇、乙腈、水中的一种或多种。
在一种优选的实施方式中，步骤(1)中所述的溶剂为DMF和乙腈，其中DMF和乙腈的体积比为1：(2～6)。
在一种更优选的实施方式中，步骤(1)中所述的溶剂为DMF和乙腈，其中DMF和乙腈的体积比为1：(3～5)。
在一种最优选的实施方式中，步骤(1)中所述的溶剂为DMF和乙腈，其中DMF和乙腈的体积比为1：4。
在一种优选的实施方式中，所述杀鼠灵原药溶液的浓度为150～250mg/mL；所述进样量为8～18mL。
在一种更优选的实施方式中，所述杀鼠灵原药溶液的浓度为180～230mg/mL；所述进样量为10～15mL。
在一种最优选的实施方式中，所述杀鼠灵原药溶液的浓度为220mg/mL；所述进样量为12mL。
在一种优选的实施方式中，所述紫外检测波长为220nm～360nm。
在一种更优选的实施方式中，所述紫外检测波长为250nm～320nm。
在一种最优选的实施方式中，所述紫外检测波长为300nm。
在一种最优选的实施方式中，所述色谱柱为Waters Xbridge C18，长度为250mm，内径为30mm，粒径10μm。
在一种优选的实施方式中，所述流动相选自甲醇、乙腈、水、磷酸二氢钾水溶液、磷酸二氢钠水溶液中的一种或多种。
在一种优选的实施方式中，所述流动相为乙腈和磷酸二氢钠水溶液。
本发明所述磷酸二氢钠水溶液中磷酸二氢钠的质量分数为0.1％。
在一种更优选的实施方式中，所述流动相在0～30min内为梯度洗脱，在0min时，乙腈和磷酸二氢钠水溶液的体积比为1:9；在30min时，乙腈和磷酸二氢钠水溶液的体积比为(7:3)～(9:1)。
在一种最优选的实施方式中，所述流动相在0～30min内为梯度洗脱，在0min时，乙腈和磷酸二氢钠水溶液的体积比为1:9；在30min时，乙腈和磷酸二氢钠水溶液的体积比为9:1。
在一种优选的实施方式中，所述流速为30-50mL/min。
在一种更优选的实施方式中，所述流速为35-48mL/min。
在一种最优选的实施方式中，所述流速为45mL/min。
本发明采用制备液相色谱技术，首先对样品前处理、色谱柱、流动相等条件反复筛选，探索出了合适的分析条件。为兼顾主成分与杂质的分离要求，选择了合适的流动相溶液体系、流动相的比例等关键检测条件；为减少原药品溶液对杂质测定的干扰，对样品前处理中原药品浓度、进样量、溶剂等进行了筛选，最终确立的方法具有操作简便、安全、分离纯度高、线性范围宽、精密度高、重现性好的优点。
有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
另外，如果没有其它说明，所用原料都是市售的，购于国药化学试剂。
实施例
实施例1
实施例1提供了一种分离纯化杀鼠灵原药样品中未知杂质的方法，包括以下步骤：
(1)称取待检测的杀鼠灵原药，加入溶剂溶解，得到杀鼠灵原药溶液；
(2)将杀鼠灵原药溶液注入色谱仪中进行检测，并控制其进样量、紫外检测波长、色谱柱、柱温、流动相和流速，得到结果。
步骤(1)中所述的溶剂为DMF和乙腈，其中DMF和乙腈的体积比为1：4。
所述杀鼠灵原药溶液的浓度为220mg/mL；所述进样量为12mL。
所述紫外检测波长为300nm。
所述色谱柱为Waters Xbridge C18，长度为250mm，内径为30mm，粒径10μm。
所述流动相为乙腈和磷酸二氢钠水溶液。
所述流动相在0～30min内为梯度洗脱，在0min时，乙腈和磷酸二氢钠水溶液的体积比为1:9；在30min时，乙腈和磷酸二氢钠水溶液的体积比为9:1。
所述流速为45mL/min。
所述柱温为25℃。
实施例2
与实施例1的区别在于，所述流动相在0～30min内为梯度洗脱，在0min时，乙腈和磷酸二氢钠水溶液的体积比为1:9；在30min时，乙腈和磷酸二氢钠水溶液的体积比为7:3。
实施例3
与实施例1的区别在于，所述流动相在0～30min内为梯度洗脱，在0min时，乙腈和磷酸二氢钠水溶液的体积比为1:9；在30min时，乙腈和磷酸二氢钠水溶液的体积比为8:2。
实施例4
与实施例1的区别在于，所述流动相为乙腈和磷酸二氢钾。
实施例5
与实施例1的区别在于，所述流速为30mL/min。
实施例6
与实施例1的区别在于，所述流速为50mL/min。
实施例7
与实施例1的区别在于，步骤(1)中所述的溶剂为DMF和乙腈，其中DMF和乙腈的体积比为1：2。
实施例8
与实施例1的区别在于，步骤(1)中所述的溶剂为DMF和乙腈，其中DMF和乙腈的体积比为1：6。
性能评价
1.纯度测试：对实施例1-8所分离的杂质进行HPLC纯度测试，其结果如下表1所示。
表1
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4
纯度/％ 96.3 94.6 93.1 93.1
实施例5 实施例6 实施例7 实施例8
纯度/％ 96.2 93.3 82.2 89.1
从上表可知，当本发明对杀鼠灵原药样品进行前处理，控制其紫外检测波长为300nm、流速为1.0mL/min、流动相为乙腈和磷酸二氢钠水溶液，流动相在0～30min内为梯度洗脱，在0min时，乙腈和磷酸二氢钠水溶液的体积比为1:9；在30min时，乙腈和磷酸二氢钠水溶液的体积比为9:1，样品中杂质的分离效果最佳，纯度最高可达96.3％。
2.对实施例1中鼠灵原药样品HPLC-MS预扫描，得到HPLC谱图和MS谱图，分别为图1和图2；对实施例1所分离出的杂质纯品进行经过HPLC、MS、HNMR、CNMR定性鉴定，其谱图结果如图3、图4、图5、图6所示。
得出：该未知杂质的分子量为412.48g/mol(化学式：C27H24O4)，结构式为
Figure BDA0002390011640000071
前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。

Claims (10)

1.一种分离纯化杀鼠灵原药样品中未知杂质的方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
(1)称取待检测的杀鼠灵原药，加入溶剂溶解，得到杀鼠灵原药溶液；
(2)将杀鼠灵原药溶液注入色谱仪中进行检测，并控制其进样量、紫外检测波长、色谱柱、柱温、流动相和流速，得到结果。
2.根据权利要求1所述的分离纯化杀鼠灵原药样品中未知杂质的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的溶剂选自DMF、甲醇、乙腈、水中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的分离纯化杀鼠灵原药样品中未知杂质的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的溶剂为DMF和乙腈，其中DMF和乙腈的体积比为1：(2～6)。
4.根据权利要求1所述的分离纯化杀鼠灵原药样品中未知杂质的方法，其特征在于，所述杀鼠灵原药溶液的浓度为150～250mg/mL；所述进样量为8～18mL。
5.根据权利要求1所述的分离纯化杀鼠灵原药样品中未知杂质的方法，其特征在于，所述紫外检测波长为220nm～360nm。
6.根据权利要求1所述的分离纯化杀鼠灵原药样品中未知杂质的方法，其特征在于，所述色谱柱为Waters Xbridge C18，长度为250mm，内径为30mm，粒径10μm。
7.根据权利要求1所述的分离纯化杀鼠灵原药样品中未知杂质的方法，其特征在于，所述流动相选自甲醇、乙腈、水、磷酸二氢钾水溶液、磷酸二氢钠水溶液中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的分离纯化杀鼠灵原药样品中未知杂质的方法，其特征在于，所述流动相为乙腈和磷酸二氢钠水溶液。
9.根据权利要求8所述的分离纯化杀鼠灵原药样品中未知杂质的方法，其特征在于，所述流动相在0～30min内为梯度洗脱，在0min时，乙腈和磷酸二氢钠水溶液的体积比为1:9；在30min时，乙腈和磷酸二氢钠水溶液的体积比为(7:3)～(9:1)。
10.根据权利要求1所述的分离纯化杀鼠灵原药样品中未知杂质的方法，其特征在于，所述流速为30-50mL/min。
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