CN111257084A - 一种不脱钙骨组织塑料包埋超薄制片方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种不脱钙骨组织塑料包埋超薄制片方法，包括依次进行的固定、脱水、浸透、包埋、切片和染色步骤，所述固定、脱水、浸透和包埋步骤均在4℃条件下进行。与传统塑料包埋制片法相比，本发明制得的塑料包埋块的硬度降低，切片厚度由传统塑料磨片的厚度50～70μm降低至2～5μm，大大提高了骨组织制片质量，骨组织结构显示更清晰。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种不脱钙骨组织塑料包埋超薄制片方法。
背景技术
形态学及组织学是研究骨组织行为及骨修复重建过程的重要手段之一。常规石蜡包埋技术必须进行骨组织脱钙，脱钙处理严重破坏了骨组织的固有结构，导致无法区分矿化骨质和未钙化的类骨质，不能准确地评价新骨形成情况，尤其是带有植入体的骨组织标本，需取出植入体后才可进行石蜡组织包埋及切片，因此无法准确地观察植入体与周围新骨的结合情况。
塑料包埋是指采用甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙二醇-400、N-N二甲基苯胺、过氧化苯甲酰的混合试剂作为包埋剂，用于替代石蜡，制备切片。用塑料包埋剂制作的切片与石蜡切片相比，具有细胞收缩小，结构清晰，分辨率高等优点；传统的不脱钙骨组织塑料块采用磨片的方法制片，与传统的磨片相比，具有厚度降低，细胞组织结构清晰、细胞形态明确、分辨率高等优点。
CN101430261A公开了一种塑料包埋制片方法，但是该方法得到的切片厚度为50～70μm，严重制约了组织的观察，长期以来是组织学领域的一个难以解决的困难。对于急需观察骨组织结构及骨细胞形态的患者来说，骨磨片厚度太大、染色困难、观察效果太差，从而限制了骨代谢性疾病的病例形态观察及研究。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种不脱钙骨组织塑料包埋超薄制片方法，与传统塑料包埋制片法相比，塑料硬度降低，切片厚度明显变薄，约为3μm。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术手段：
一种不脱钙骨组织塑料包埋超薄制片方法，包括依次进行的固定、脱水、浸透、包埋、切片和染色步骤；所述固定、脱水、浸透和包埋步骤均在4℃条件下进行。
进一步地，所述固定步骤是采用升汞、重铬酸钾、甲醛混合固定液固定组织标本，固定时间为24h～72h、温度为4℃、压强为0.1MPa。
进一步地，所述组织标本大小为：直径0.5cm，长1.5cm～2.5cm。
进一步地，所述脱水步骤是对组织标本进行梯度脱水，具体是分别用60％v/v乙醇脱水120min、70％v/v乙醇脱水120min、80％v/v乙醇脱水120min、95％v/v乙醇脱水120min、100％v/v乙醇脱水120min、100％v/v乙醇脱水120min，脱水温度为4℃、压强为0.1MPa，然后用4℃预冷的纯丙酮吸附组织标本中残留乙醇。
进一步地，所述浸透步骤是用甲基丙烯酸羟乙脂作浸透液浸透脱水后组织标本，浸透的温度为4℃、压强0.1MPa、时间48～60h；在浸透进行到一半时，更换一次浸透液甲基丙烯酸羟乙脂，继续浸透。
进一步地，所述包埋步骤是从浸透液取出组织标本，放入包埋盒内，然后在包埋盒内加入包埋液后密封，将包埋盒在4℃冷藏24～36h、压强0.1MPa，取出后置于25℃放置72h、压强0.1MPa，然后去掉包埋盒，得到包埋块。
进一步地，所述包埋液是由甲液和乙液按体积比100∶2～100∶4混合而成；其中甲液由甲基丙烯酸羟乙脂、聚乙二醇400和过氧化苯甲酰按体积比950：80：7混合而成，乙液由聚乙二醇400和N，N-二甲基苯胺按体积比20：1混合而成。
进一步地，所述切片步骤是用钢锉磨去包埋块底部，暴露出组织切面，然后用切片机将组织切面切成3～5μm薄片，并在60～80℃电热板上充分烤1.5-2.5h。
进一步地，所述染色步骤是用苏木素-姬娒萨-伊红将薄片染色，然后用中性树胶封片。
在本发明的方法中，通过控制固定、脱水、浸透和包埋的温度为4℃，减速分子运动，使生物组织的水分子缓慢被有机溶剂替代出来，减慢有机溶剂、浸透液(HEMA)浸透到生物组织内。由于分子运动缓慢，减慢了组织与各种试剂的反应，使整个操作程序在适当的时间内缓慢完成。
采用本发明的方法，塑料包埋块的硬度降低，切片厚度由传统塑料磨片的厚度50～70μm降低至2～5μm厚，大大降低制片厚度，提高了制片质量，观察结果显示细胞组织结构更清晰、细胞形态更明确、分辨率更高等优点，为骨疾病的研究提供了更好的工具。
附图说明
图1为实施例1制得的骨切片。
图2为骨磨片法制得的骨磨片。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
本发明提供的一种不脱钙骨组织塑料包埋超薄制片方法，包括依次进行的固定、脱水、浸透、包埋、切片和染色步骤；并控制固定、脱水、浸透、包埋的温度，从而降低分子运动、减慢聚合过程，从而降低塑料块硬度。
实施例1
本塑料包埋制片方法在4度下，采用下述工艺步骤，
1、固定：用升汞、重铬酸钾、甲醛混合固定液(PCF)固定组织标本，标本大小：直径：0.5cm，长：1.5cm～2.5cm。固定时间60h～72h，温度：4度，压强：0.1MPa。
2、脱水：梯度脱水，对组织标本脱水，用体积分数60％乙醇脱水120min、70％乙醇脱水120min、80％乙醇脱水120min、95％乙醇脱水120min、100％乙醇脱水120min(2次)，纯丙酮吸附组织标本中残留乙醇15min，所有试剂在4度预冷。以上均为温度：4度，压强：0.1MPa。
3、浸透：浸透液选用甲基丙烯酸羟乙脂(HEMA)，浸透的温度：4度，压强：0.1MPa，时间：48～60h；浸透脱水后组织标本，在浸透进行到一半时，用甲基丙烯酸羟乙脂更换一次甲基丙烯酸羟乙脂，继续浸透。
4、包埋：从浸透液最后一步液体中取出组织标本，用滤纸吸取多余浸透液；放入包埋盒内，然后在包埋盒内加入包埋液后密封，将包埋盒放入4度冰箱内冷藏，时间24～36h、压强：0.1MPa。取出后放入室温(25度)72h、压强：0.1MPa，变硬后即可去掉包埋盒。
包埋液是由甲液和乙液按体积比100∶2～100∶4混合而成；其中甲液由甲基丙烯酸羟乙脂、聚乙二醇400和过氧化苯甲酰按体积比950：80：7混合而成，乙液由聚乙二醇400和N，N-二甲基苯胺按体积比20：1混合而成。
5、切片：用钢锉磨去包埋块底部，暴露出组织切面，用切片机将组织切片3～5um，并在60～80度电热板上充分烤1.5-2.5h。此过程需3h左右。
6、染色：用苏木素-姬娒萨-伊红(H-Giemsa-E)染色，然后用中性树胶封片，即可得到塑料包埋制片。
图1为本实施例制得的切片，可清晰可见骨组织结构HE×400平行排列的骨板。而图2中，骨磨片显示的骨组织结构HE×200中央染色深的圆形结构为中央管(↑)，骨陷窝周围的骨小管不明显。
本塑料包埋制片方法与传统塑料包埋制片法相比，塑料硬度降低，切片厚度明显变薄，约为3μm。大大提高了骨组织制片质量，骨组织结构显示更清晰。本发明的方法为检验临床样本中骨结构、不同骨细胞的形态、及骨胶原等提供了新的染色方案及工具。
Claims (9)
1.一种不脱钙骨组织塑料包埋超薄制片方法，包括依次进行的固定、脱水、浸透、包埋、切片和染色步骤，其特征在于：所述固定、脱水、浸透和包埋步骤均在4℃条件下进行。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述固定步骤是采用升汞、重铬酸钾、甲醛混合固定液固定组织标本，固定时间为24h～72h、温度为4℃、压强为0.1MPa。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述组织标本大小为：直径0.5cm，长1.5cm～2.5cm。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述脱水步骤是对组织标本进行梯度脱水，具体是分别用60％v/v乙醇脱水120min、70％v/v乙醇脱水120min、80％v/v乙醇脱水120min、95％v/v乙醇脱水120min、100％v/v乙醇脱水120min、100％v/v乙醇脱水120min，脱水温度为4℃、压强为0.1MPa，然后用4℃预冷的纯丙酮吸附组织标本中残留乙醇。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述浸透步骤是用甲基丙烯酸羟乙脂作浸透液浸透脱水后组织标本，浸透的温度为4℃、压强0.1MPa、时间48～60h；在浸透进行到一半时，更换一次浸透液甲基丙烯酸羟乙脂，继续浸透。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述包埋步骤是从浸透液取出组织标本，放入包埋盒内，然后在包埋盒内加入包埋液后密封，将包埋盒在4℃冷藏24～36h、压强0.1MPa，取出后置于25℃放置72h、压强0.1MPa，然后去掉包埋盒，得到包埋块。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述包埋液是由甲液和乙液按体积比100∶2～100∶4混合而成；其中甲液由甲基丙烯酸羟乙脂、聚乙二醇400和过氧化苯甲酰按体积比950：80：7混合而成，乙液由聚乙二醇400和N，N-二甲基苯胺按体积比20：1混合而成。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述切片步骤是用钢锉磨去包埋块底部，暴露出组织切面，然后用切片机将组织切面切成3～5μm薄片，并在60～80℃电热板上充分烤1.5-2.5h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述染色步骤是用苏木素-姬娒萨-伊红将薄片染色，然后用中性树胶封片。
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