CN111239134B - 研究高频电磁辐射对体外可兴奋细胞生物电效应的系统及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明研究高频电磁辐射对体外可兴奋细胞生物电效应的系统及方法,针对贴壁生长的培养细胞、利用电生理记录系统和显微镜观察系统,设计构建了太赫兹波自上而下,可以实现对贴壁生长的体外培养神经元及其它可兴奋细胞实时辐照太赫兹及其电生理特征的同步检测,系统操作简单,可重复性强。一方面我们将太赫兹源整合入电生理记录系统中,固定在电动三维显微操纵器上,实现自由、精确移动太赫兹源。同时,将肉眼不可见的太赫兹波和可见光激光定位瞄准器结合,确定太赫兹波照射位置。另一方面,通过控制电生理记录小室即培养皿的液面高度,减少太赫兹波在液体中的衰减程度,实现对神经元的实时照射并实时记录电生理学指标。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域,具体为研究高频电磁辐射对体外可兴奋细胞生物电效应的系统及方法。
背景技术
太赫兹(Terahertz,THz)波是指频率范围在0.1~10THz,波长在3mm~30μm,介于毫米波和红外光之间的电磁波谱区域。它是目前电磁波谱中唯一没有获得全面研究并很好加以利用的最后一个波谱区间,是人类目前尚未完全开发的电磁波谱“空白”区。从能量上看,太赫兹波介于光子和电子之间,它具有很多独特的性质:①高透性,THz对许多介电材料和非极性物质具有良好的穿透性,比如陶瓷、碳板、塑料等;②低能性,THz光子能量为4.1meV(毫电子伏特),仅为X射线光子能量的107~108分之一,该值低于各种化学键的键能,因此不容易破坏被检物质;③指纹谱性,THz波段包含了丰富的物理和化学信息,大多数极性分子和生物大分子的振-转能级跃迁都处在THz波段。根据这些特性,太赫兹在安检、通信、生物医学等方面的发展潜力不可小觑。
可兴奋细胞是指受刺激能够产生动作电位的细胞,包括神经元、肌细胞和内分泌腺细胞。这些细胞是机体适应外界环境关键的因素。例如,神经系统是包括人类在内的生物体最重要也是最复杂的系统。人类的意识、认知等高级脑功能也依赖于神经系统的正常运转。信息在神经系统传递的主要的方式是神经元上产生的动作电位和突触后电位等生物电信号,本质上也具有电磁特性。但是,目前对太赫兹技术的研究主要集中在太赫兹辐射源、太赫兹探测设备、太赫兹通信和太赫兹成像等方面,对于太赫兹在能够发放生物电的可兴奋细胞的生物效应,研究尚处于起步阶段。生物体内环境复杂,难以控制。因此,研究的样品通常采用离体原代培养的细胞——既保持了细胞基本的结构(如突触连接)和功能(动作电位发放能力),又能相对于简化外界影响因素。这是研究太赫兹对整个可兴奋组织系统效应的必要阶段和环节。但现仍缺乏用于研究太赫兹即时照射及同步检测对体外培养可兴奋细胞生物电效应的系统及方法,亟需开发。
而对于太赫兹即时照射离体培养可兴奋细胞并同时研究其生物电效应,存在以下困难:(1)如何将太赫兹照射系统有机整合入电生理记录系统中,确保太赫兹照射系统能够从时间、幅度等方面可控照射离体神经元,而电生理记录系统又能够正常工作,获得生物电信号;(2)太赫兹波肉眼不可见,而能够用于检测太赫兹波空间分布的设备复杂,现有检测细胞生物电效应设备内空间有限,两者很难整合,如何确保太赫兹波照射到指定位置,便于电生理记录;(3)太赫兹波不能透过水,而离体培养细胞的存活又依赖于液体环境,如何尽可能保证太赫兹波能更多照射到细胞上。
发明内容
针对现有技术中存在的问题,本发明提供一种研究高频电磁辐射对体外可兴奋细胞生物电效应的系统及方法,可以实现对贴壁生长的体外培养神经元及其它可兴奋细胞(如心肌细胞、骨骼肌细胞和内分泌腺细胞)实时辐照太赫兹及其电生理特征的同步检测,系统操作简单,可重复性强。
本发明是通过以下技术方案来实现:
研究高频电磁辐射对体外可兴奋细胞生物电效应的系统,包括细胞体外维持和显微镜观察系统、电生理记录系统、THz发射系统和THz源可视化位移控制系统;
细胞体外维持和显微镜观察系统包括细胞体外维持系统和显微镜观察系统;细胞体外维持系统包括培养皿和灌流系统,培养皿通过管道和灌流系统连通;显微镜观察系统包括显微镜、显微镜样品台、摄像头和监视器,摄像头置于显微镜上方,并与监视器连接;显微镜样品台位于显微镜镜头下方,其上放置培养皿;
THz发射系统包括THz源和与THz源连接的脉冲电流源;
THz源可视化位移控制系统包括电动三维微操纵器、固定在电动三维微操纵器微操臂上的激光定位瞄准器、以及用确定太赫兹波照射位置的红外辐射观察卡;
所述的THz源固定设置在电动三维微操纵器上,THz源发出的太赫兹波与激光定位瞄准器发出的激光汇聚在显微镜样品台的同一个平面上,且该平面为电生理记录系统的生物电信号采集探头的探测平面。
优选的,所述的培养皿呈盒体状,盒体内部注入人工脑脊液,盒体上表面设置有椭圆开孔,椭圆开孔两侧设置有入液口和出液口;所述的入液口和出液口分别与灌流系统的出口和进口相连通。
进一步,所述的培养皿的高度为0.3cm,椭圆开孔的长径为3cm,短径为2cm。
优选的,所述的电生理记录系统还包括用于控制生物电信号采集探头精确位移的采集探头电动微操、与生物电信号采集探头连接且用于放大和存储生物电信号的放大器和数据采集系统、用于显示和分析电信号的电生理数据采集模块。
研究高频电磁辐射对体外可兴奋细胞生物电效应的方法,基于上述任意一项系统,包括如下步骤,
步骤1,确定太赫兹波照射的位点;
将实验所需的THz源固定在电动三维显微操纵器上,将激光定位瞄准器固定在电动三维显微操纵器的微操臂上,打开脉冲电流源,用红外辐射观察卡确定太赫兹波照射的位置并通过移动电动三维显微操纵器将太赫兹波照射位置移动到显微镜视野下;
步骤2,确定太赫兹照射的位置;
通过调整激光定位瞄准器的位置,将激光光点与显微镜视野下的太赫兹波在红外辐射观察卡上的照射位置重合;此时,红色光点所在位置即为太赫兹照射的位置;
步骤3,对体外可兴奋细胞进行实时照射并记录电生理指标变化;
关闭脉冲电流源,将长有贴壁可兴奋细胞的玻璃爬片放入培养皿内并放置在显微镜样品台上,通过监视器观察激光照射范围内可兴奋细胞的状态,选取健康的可兴奋细胞作为被照射记录细胞进行膜片钳记录;
获得稳定的电生理记录后,通过灌流系统精确控制培养皿的液面高度;通过移动电生理记录系统中的生物电信号采集探头采集生物电信号,将采集到的生物电信号作为获得照射前的基础数据采集到电生理记录系统中;再打开脉冲电流源,确定照射的频率、电压和脉宽参数后对激光光斑所在位置的细胞进行实时照射。
优选的,步骤3中,通过操纵采集探头电动微操来控制生物电信号采集探头的移动,将采集到的生物电信号通过放大器和数据采集系统进行放大和储存,再在电生理数据采集模块中观察可兴奋细胞的电生理特性和指标,获得照射前的基础数据。
优选的,对于被照射记录细胞的记录,选择实时记录被照射记录细胞的电生理指标的变化,或者选择完成规定时程的照射后停止照射再观察可兴奋细胞的电生理指标。
与现有技术相比,本发明具有以下有益的技术效果:
本发明针对贴壁生长的培养细胞、利用电生理记录系统和显微镜观察系统,设计构建了太赫兹波自上而下,实时辐照细胞及同步电生理记录的系统与方法。一方面我们将太赫兹源整合入电生理记录系统中,固定在电动三维显微操纵器上,实现自由、精确移动太赫兹源。同时,将肉眼不可见的太赫兹波和可见光激光定位瞄准器结合,确定太赫兹波照射位置。另一方面,通过控制电生理记录小室即培养皿的液面高度,减少太赫兹波在液体中的衰减程度,实现对神经元的实时照射并实时记录电生理学指标。具体的本发明具有以下优点:
1)可重复性:通过控制太赫兹源的位置和角度,将太赫兹照射和激光定标结合实现太赫兹可视化,精确控制电生理记录小室液面高度,确定太赫兹照射参数等措施,实现太赫兹波照射细胞各种参数指标的可重复性。
2)即时性:通过该系统,可以研究太赫兹波实时照射细胞后细胞产生的电生理指标的即时效应和变化,与太赫兹长期慢性照射引起的效应相互比较和验证。
3)便捷性:系统操作简单,具有电生理记录经验的科研人员经过简单的培训即可学会整个操作流程。
附图说明
图1为本发明实例中所述研究高频电磁辐射对体外可兴奋细胞生物电效应的系统示意图。
图2为本发明实例中所述太赫兹波照射位点确定示意图。
图3为本发明实例中所述培养皿的连接及结构示意图。
图中:脉冲电流源1,电动三维显微操纵器2,THz源3,激光定位瞄准器4,红外辐射观察卡5,培养皿6,显微镜7,摄像头8,生物电信号采集探头9,采集探头电动微操10,监视器11,被照射记录细胞12,电生理数据采集模块13,放大器和采集系统14,灌流系统15,显微镜样品台16。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明,所述是对本发明的解释而不是限定。
如图1所示,本发明研究高频电磁辐射对体外可兴奋细胞生物电效应的系统由以下四部分构成,能够实现太赫兹实时照射及体外培养神经元电生理同步记录。
THz发射系统,包括给THz源供电的脉冲电流源1及THz源3,其中THz源3的THz辐照参数由脉冲电流源1控制;
THz源可视化位移控制系统,包括电动三维微操纵器2、激光定位瞄准器4和红外辐射观察卡5,用于实现精确控制THz源3的位置、标定THz照射范围;
细胞体外维持系统和显微镜观察系统,包括培养皿6、灌流系统15、显微镜7、显微镜样品台16、摄像头8、监视器11,用于维持细胞存活并观察培养皿中的细胞;
电生理记录系统,包括生物电信号采集探头9、用于控制生物电信号采集探头9精确位移的采集探头电动微操10、用于放大和存储生物电信号的放大器和数据采集系统14、用于显示和分析电信号的电生理数据采集模块13,对照射的细胞进行实时电生理记录和分析。
该系统组成和具体技术方案如下:
首先,为了将太赫兹源3和电生理记录系统进行整合,将实验所需的太赫兹源3固定在电生理实验所用的电动三维显微操纵器2上,这样可以精确地、可重复地移动太赫兹源3到指定的位置,便于后期确保太赫兹波照射的位置相对固定。需要注意的是,这种方案仅适用于体积相对较小的太赫兹高频电磁源;
第二步,确定太赫兹波照射的位点:操作如图2中所示的1、2、3和4的过程;尽管太赫兹波肉眼不可见,但接近其波长的红外辐射观察卡5可以感应并呈色。为此,我们将发出红色激光的激光定位瞄准器4固定在手动三维微操作器上,手动三维微操作器则固定在电动三维显微操纵器2的微操臂上,用红外辐射观察卡5确定太赫兹波照射的位置并通过移动电动三维显微操纵器2将太赫兹波照射位置移动到显微镜7视野下。这时,通过调整激光定位瞄准器4的位置,将红色激光光点与太赫兹波在红外辐射观察卡5上的照射位置重合。此时,红色光点所在位置即为太赫兹照射的位置;
第三步,将长有贴壁细胞的玻璃爬片放入电生理记录小室即培养皿6内,观察红色激光照射范围内细胞的状态,选取健康的细胞进行膜片钳记录。获得稳定的电生理记录后,通过灌流系统15精确控制培养皿6的液面高度(培养皿6的体积和高度已知,灌流系统15的流速已知,通过灌流系统15中的蠕动泵控制已吸走的液体体积,从而可知培养皿6剩余液体的体积和高度,培养皿的连接及结构示意如图3所示。通过操纵采集探头电动微操10来控制生物电信号采集探头9的移动,将采集到的生物电信号通过放大器和数据采集系统14进行放大和储存,再在电生理数据采集模块13中观察神经元等可兴奋细胞的电生理特性和指标,获得照射前的基础数据。然后打开太赫兹电流源即脉冲电流源1,确定照射的频率、电压、脉宽等参数后对激光光斑所在位置的细胞进行实时照射。
其中,对于被照射记录细胞12的记录,可以有两种选择:第一,实时记录被照射记录细胞12的电生理指标的变化;第二,完成规定时程的照射后停止照射,再观察神经元的电生理指标。
其中,如图3所示,培养皿6的容积计算公式为:(л×3×2/4)×0.3=1.4ml;液面高度和小室液体体积的对应关系为:3mm=1.4ml;2mm=0.9ml;1mm=0.5ml;0.5mm=0.2ml;0.2mm=0.1ml。
该系统除了适用于培养可兴奋细胞,如神经元的电生理指标的记录外,还可以与动态荧光成像结合,观察实时照射情况下细胞内特定离子浓度的变化,如钙离子浓度的动态变化。
在实际应用中的操作步骤,即本发明所述的方法如下:
1.THz源的照射参数设置
打开脉冲电流源1,设置参数,设置电源(PCX-7420型号)输出参数为5KHz,脉宽2μs,电流2.2A,并通过开启钥匙和开关为太赫兹源3供电,在太赫兹源3的出口处采用红外辐射观察卡5观察光斑出现与否或用THz功率计测量输出功率。
2.THz源辐照范围标定
通过控制电动三维显微操纵器2移动THz源3到靠近显微镜样品台16中心位置。在给THz源3供电状态下,将红外辐射观察卡5放在THz源3照射范围内,观察红外辐射观察卡5上出现的光斑的位置和大小。小心调节激光定位瞄准器4,将红色激光照射到红外辐射观察卡5出现THz光斑的位置。将培养皿6放置在显微镜样品台16上,移动培养皿6,使其中心位于红色激光照射范围内。
3.培养可兴奋细胞的THz辐照和电生理同步记录
将长有贴壁细胞的玻璃爬片放入电生理记录小室,即培养皿6中,打开激光定位瞄准器4的开关,确定激光照射的范围后关闭激光定位瞄准器4。通过摄像头8和监视器11在显微镜7下找到刚才激光照射范围内形态健康的细胞,进行标准的膜片钳记录操作。记录到电信号后再次打开激光定位瞄准器4开关,通过观察监视器11确认被照射记录细胞12在激光照射范围内。进行标准的细胞内的电刺激,观察诱发的细胞电流和电压反应,作为THz波辐照前的基础值。
打开脉冲电流源1供电输出开关,记录THz源辐照的时程,同时对被照射记录细胞12进行电刺激,记录得到的电流和电压反应,与照射前进行比较,观察THz辐照的即时效应。也可以进行一定时间的THz辐照(如5min或10min),然后进行电生理记录,观察短时程辐照后细胞的电生理指标发生了何种变化。
本系统适用于研究包括神经元在内的多种贴壁生长的可兴奋细胞的THz波实时辐照的即时生物电效应及其机制的研究。实验完毕的细胞可以通过固定后染色,对相关的蛋白分子进行观察。该系统为探讨THz波的细胞生物学电效应和机理提供重要的研究方法和平台。
此外,本系统和方法也可以用于研究观察THz波对钙离子等第二信使的实时变化。比如,记录神经元的细胞内钙离子浓度变化,可以采用以下方法:前期将需要照射的神经元进行钙敏感荧光染料的预染,或者前期通过慢病毒在神经元内转染转基因的荧光钙指示蛋白。经过细胞电刺激或化学刺激的神经元细胞内钙浓度将发生变化,荧光强度会发生变化,这种变化可以通过显微镜7和摄像头8进行观察和记录。进行THz辐照的同时可以观察神经元的荧光强度是否发生变化;或者在辐照后给予相同的电刺激或化学刺激,观察细胞的荧光变化与辐照前是否有所不同。
Claims (7)
1.研究高频电磁辐射对体外可兴奋细胞生物电效应的系统,其特征在于:包括细胞体外维持和显微镜观察系统、电生理记录系统、THz发射系统和THz源可视化位移控制系统;
细胞体外维持和显微镜观察系统包括细胞体外维持系统和显微镜观察系统;细胞体外维持系统包括培养皿(6)和灌流系统(15),培养皿(6)通过管道和灌流系统(15)连通;显微镜观察系统包括显微镜(7)、显微镜样品台(16)、摄像头(8)和监视器(11),摄像头(8)置于显微镜(7)上方,并与监视器(11)连接;显微镜样品台(16)位于显微镜(7)镜头下方,其上放置培养皿(6);
THz发射系统包括THz源(3)和与THz源(3)连接的脉冲电流源(1);
THz源可视化位移控制系统包括电动三维微操纵器(2)、固定在电动三维微操纵器(2)微操臂上的激光定位瞄准器(4)、以及用确定太赫兹波照射位置的红外辐射观察卡(5);
所述的THz源(3)固定设置在电动三维微操纵器(2)上,THz源(3)发出的太赫兹波与激光定位瞄准器(4)发出的激光汇聚在显微镜样品台(16)的同一个平面上,且该平面为电生理记录系统的生物电信号采集探头(9)的探测平面。
2.根据权利要求1所述的研究高频电磁辐射对体外可兴奋细胞生物电效应的系统,其特征在于:所述的培养皿(6)呈盒体状,盒体内部注入人工脑脊液,盒体上表面设置有椭圆开孔,椭圆开孔两侧设置有入液口和出液口;所述的入液口和出液口分别与灌流系统(15)的出口和进口相连通。
3.根据权利要求2所述的研究高频电磁辐射对体外可兴奋细胞生物电效应的系统,其特征在于:所述的培养皿(6)的高度为0.3cm,椭圆开孔的长径为3cm,短径为2cm。
4.根据权利要求1所述的研究高频电磁辐射对体外可兴奋细胞生物电效应的系统,其特征在于:所述的电生理记录系统还包括用于控制生物电信号采集探头(9)精确位移的采集探头电动微操(10)、与生物电信号采集探头(9)连接且用于放大和存储生物电信号的放大器和数据采集系统(14)、用于显示和分析电信号的电生理数据采集模块(13)。
5.研究高频电磁辐射对体外可兴奋细胞生物电效应的方法,基于权利要求1-4所述的任意一项系统,其特征在于:包括如下步骤,
步骤1,确定太赫兹波照射的位点;
将实验所需的THz源(3)固定在电动三维显微操纵器(2)上,将激光定位瞄准器(4)固定在电动三维显微操纵器(2)的微操臂上,打开脉冲电流源(1),用红外辐射观察卡(5)确定太赫兹波照射的位置并通过移动电动三维显微操纵器(2)将太赫兹波照射位置移动到显微镜(7)视野下;
步骤2,确定太赫兹照射的位置;
通过调整激光定位瞄准器(4)的位置,将激光光点与显微镜视野下的太赫兹波在红外辐射观察卡(5)上的照射位置重合;此时,红色光点所在位置即为太赫兹照射的位置;
步骤3,对体外可兴奋细胞进行实时照射并记录电生理指标变化;
关闭脉冲电流源(1),将长有贴壁可兴奋细胞的玻璃爬片放入培养皿(6)内并放置在显微镜样品台(16)上,通过监视器(11)观察激光照射范围内可兴奋细胞的状态,选取健康的可兴奋细胞作为被照射记录细胞(12)进行膜片钳记录;
获得稳定的电生理记录后,通过灌流系统(15)精确控制培养皿(6)的液面高度;通过移动电生理记录系统中的生物电信号采集探头(9)采集生物电信号,将采集到的生物电信号作为获得照射前的基础数据采集到电生理记录系统中;再打开脉冲电流源(1),确定照射的频率、电压和脉宽参数后对激光光斑所在位置的细胞进行实时照射。
6.根据权利要求5所述的研究高频电磁辐射对体外可兴奋细胞生物电效应的方法,其特征在于:步骤3中,通过操纵采集探头电动微操(10)来控制生物电信号采集探头(9)的移动,将采集到的生物电信号通过放大器和数据采集系统(14)进行放大和储存,再在电生理数据采集模块(13)中观察可兴奋细胞的电生理特性和指标,获得照射前的基础数据。
7.根据权利要求5所述的研究高频电磁辐射对体外可兴奋细胞生物电效应的方法,其特征在于:对于被照射记录细胞(12)的记录,选择实时记录被照射记录细胞(12)的电生理指标的变化,或者选择完成规定时程的照射后停止照射再观察可兴奋细胞的电生理指标。
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