CN111235221A - 一种fap抑制剂的活性检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种FAP抑制剂的活性检测方法。该方法包括以下步骤：步骤S1：将不同浓度的FAP抑制剂和FAP蛋白混合，再与底物分子进行水解反应，得到水解产物；所述底物分子选自Gly‑Pro‑AMC、Cbz‑Gly‑Pro‑AMC、Suc‑Gly‑Pro‑AMC中的任意一种；步骤S2：对步骤S1得到的水解产物进行荧光检测。本发明提供了一种FAP抑制剂的活性检测方法，可对不同亲和力的FAP抑制剂进行活性检测，灵敏度高。

Description

一种FAP抑制剂的活性检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种FAP抑制剂的活性检测方法。
背景技术
成纤维细胞活化蛋白(FAP)是二肽酶(DPP)家族中的成员，FAP与DPP4具有相似的结构域(52％的同源性)及二肽基肽酶活性，是一种与癌症相关成纤维细胞(CAF)的标志物，对于促进肿瘤发展有重要作用。研究表明FAP既可以作为肿瘤的潜在靶点，又可以作为肿瘤、类风湿性关节炎等疾病早期诊断标志物。作为体内的蛋白，FAP可以水解多种底物，经过长时间的研究与探索，FAP的天然底物有胶原纤维蛋白、α2-抗纤维蛋白、成纤维细胞生长因子21(FGF21)等。它可以特异性地识别、分解C端的甘氨酸-脯氨酸(G-P)序列。基于此特点，多种FAP酶及其抑制剂的活性检测方法相继被报道，这些检测方法可分为体内检测法和体外检测法，其中体外检测法研究最热的是荧光探针分子。
目前，FAP的相关荧光探针多以香豆素为荧光基团。Aggarwal等运用荧光探针Ala-Pro-AFC对FAP体外酶活性进行检测，通过其水解产生的AFC(7-氨基-4-三氟甲基香豆素)(λex/em＝370/535nm)的荧光响应来反映FAP活性，并测定了Ala-Pro-AFC的水解反应速率，但由于荧光探针自身化学属性差或选择性等问题，除了可以被具有内肽酶活性的酶(如FAP)水解外，外肽酶活性的酶(如DPP4)也能水解Ala-Pro-AFC产生AFC。
有研究报道使用HEK293细胞系来表达FAP蛋白，但由于HEK293细胞系需经转染使用，操作繁琐，且生长过程中贴壁强度比较小，在实验过程中容易流失，从而影响实验结果。
也有研究人员应用人、鼠、猴血清中的游离FAP进行测试，但也存在成本高、生物样本获取难等问题，同时也无法完整发挥FAP蛋白在生物体内的酶功能。
因此，本领域亟需研发一种FAP抑制剂的活性检测方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述现有检测方法选择性差、细胞系培养缺陷、成本高等诸多问题，而提供了一种FAP抑制剂的活性检测方法。
本发明提供一种FAP抑制剂的活性检测方法，包括以下步骤：
步骤S1：将不同浓度的FAP抑制剂和FAP蛋白混合，再与底物分子进行水解反应，得到水解产物；所述底物分子选自Gly-Pro-AMC、Cbz-Gly-Pro-AMC、Suc-Gly-Pro-AMC中的任意一种；
步骤S2：对步骤S1得到的水解产物进行荧光检测。
根据本发明的方法，优选地，所述FAP蛋白由U87MG细胞系、HT1080细胞系或PC-3细胞系表达。优选U87MG细胞系，该细胞系为人恶性胶质瘤细胞系，能够高表达FAP蛋白。
进一步地，水解反应体系中，所述细胞系的细胞计数为(50～150)万/mL，优选细胞计数为100万/mL。
本发明中，选择带有AMC(7-氨基-4-甲基香豆素)荧光基团的底物分子进行检测。可通过以下方法检测底物分子与FAP蛋白的亲和力：
步骤一：将FAP蛋白和不同浓度的底物分子反应，得到水解产物；
步骤二；对步骤一得到的水解产物进行荧光检测，以底物浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标，计算Km值。
所述Km值即可反映底物分子与FAP蛋白的亲和力大小，Km值越小，亲和力越高，反之亦然。
其中，所述底物分子使用缓冲液稀释至5μM～2mM之间的8～10个浓度梯度。
根据上述方法，本发明选择Gly-Pro-AMC、Cbz-Gly-Pro-AMC、Suc-Gly-Pro-AMC中的任意一种作为底物分子，其中，Cbz-Gly-Pro-AMC中的Cbz(benzyloxycarbonyl)为保护基团，本文亦简称为Z-Gly-Pro-AMC。三种底物分子中，Suc-Gly-Pro-AMC为最优选。检测时，水解反应体系中，所述底物分子的浓度可以为5μM～2mM，优选底物分子浓度为25μM。
本发明所用的Gly-Pro-AMC、Cbz-Gly-Pro-AMC、Suc-Gly-Pro-AMC可通过商购获得，也可以通过常规合成方法制得。
根据本发明的方法，水解反应体系中，所述不同浓度的FAP抑制剂的浓度范围为500pM～2μM(例如，500pM，1nM，5nM，50nM，500nM，2μM)。
进一步地，所述水解反应的溶液选自pH 7.0～8.0PBS缓冲液或Tris-NaCl缓冲液，优选为PBS缓冲液。
由于本发明选择的荧光基团为AMC，相应地，所述荧光检测的条件包括：激发波长为380nm，发射波长为460nm。
本发明上述底物分子筛选和所述FAP抑制剂的活性检测原理如下：
由一定细胞计数的细胞系(FAP蛋白供体)水解不同浓度梯度的底物分子，释放荧光基团AMC，该基团产生的荧光强度与FAP水解底物的量成一定比例，通过酶标仪读取荧光强度，以底物浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标，计算Km值，从而判断底物分子与FAP蛋白之间的亲和力，筛选出合适的底物分子。
将不同浓度的FAP抑制剂和一定细胞计数的细胞系混合，再与一定浓度的底物分子反应，此时FAP抑制剂浓度越大，抑制水解反应的能力越强，从而荧光强度越弱，通过酶标仪读取荧光强度，经软件处理计算IC50值。IC50值越小，说明该抑制剂对FAP蛋白的抑制能力越强，从而筛选出合适的FAP抑制剂。
本发明中，Km表示酶促反应达最大速度一半时底物的浓度；IC50表示达到50％抑制效果时抑制剂的浓度。
本发明的有益效果：
1)本发明提供了一种FAP抑制剂的活性检测方法，可对不同亲和力的FAP抑制剂进行活性检测，灵敏度高。
2)本发明操作简单，所用细胞系、底物及缓冲液等物质均为实验室常规应用，来源广泛、易得，成本低。
3)本发明所采用的底物只能特异性被FAP蛋白水解，而DPP4蛋白对其不具有水解能力，选择性好。
4)因PREP为细胞质蛋白质，而本发明底物较少进入细胞，因此可近乎避免PREP的干扰，适合FAP抑制剂的活性筛选。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1为底物Suc-Gly-Pro-AMC的Km值曲线图。
图2为FAP抑制剂UAMC-1110的IC50曲线图。
图3为U87MG细胞与底物Z-Gly-Pro-AMC，Suc-Gly-Pro-AMC或底物Z-Gly-Pro-AMC，Suc-Gly-Pro-AMC加FAP抑制剂(UAMC-1110)反应90分钟的荧光值变化图。其中，图3A中，上方曲线代表Z-Gly-Pro-AMC，下方曲线代表Z-Gly-Pro-AMC+UAMC-1110，图3B中，上方曲线代表Suc-Gly-Pro-AMC，下方曲线代表Suc-Gly-Pro-AMC+UAMC-1110，图3C中，左侧柱代表Z-Gly-Pro-AMC，右侧柱代表Suc-Gly-Pro-AMC。
图4为HT1080细胞与底物Z-Gly-Pro-AMC，Suc-Gly-Pro-AMC或底物Z-Gly-Pro-AMC，Suc-Gly-Pro-AMC加FAP抑制剂(UAMC-1110)反应90分钟的荧光值变化图。其中，图4A中，上方曲线代表Z-Gly-Pro-AMC，下方曲线代表Z-Gly-Pro-AMC+UAMC-1110，图4B中，上方曲线代表Suc-Gly-Pro-AMC，下方曲线代表Suc-Gly-Pro-AMC+UAMC-1110，图4C中，左侧柱代表Z-Gly-Pro-AMC，右侧柱代表Suc-Gly-Pro-AMC。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
U87MG细胞由北京师范大学教育部重点实验室提供，HT1080细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。Gly-Pro-AMC通过商购得到，Cbz-Gly-Pro-AMC、Suc-Gly-Pro-AMC由Gly-Pro-AMC进一步制备得到，步骤如下：将Gly-Pro-AMC溶于二氯甲烷中，加入过量的三乙胺，加入氯甲酸苄酯，电磁搅拌下室温反应，反应完成经柱层析硅胶纯化得到CbZ-Gly-Pro-AMC。将Gly-Pro-AMC溶于二氯甲烷中，加入适量吡啶，加入丁二酸酐，电磁搅拌下室温反应，反应完成经反向HPLC纯化，得到Suc-Gly-Pro-AMC。
实施例中未注明具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1细胞培养
培养基：U87MG细胞采用含1％(v/v)青霉素-链霉素和10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基；PC3细胞采用含1％(v/v)青霉素-链霉素和10％(v/v)胎牛血清的RPMI 1640培养基；HT1080细胞采用含1％(v/v)青霉素-链霉素和10％(v/v)胎牛血清的MEM生长培养基。
培养条件：置于37℃、5％CO2的培养箱中，待细胞融合度达80％-90％时，使用0.25％含EDTA胰蛋白酶溶液消化后传代培养，取对数生长期的细胞用于后续的实验研究。
实施例2Km值测定
将已消化的U87MG细胞系吹匀为单个细胞的PBS混悬液，细胞计数100万/mL。将Suc-Gly-Pro-AMC用PBS缓冲液稀释成10个浓度梯度：25μM，50μM，100μM，150μM，250μM，300μM，400μM，500μM，1mM，2mM，每个浓度分成对照组和实验组。在实验组中，96孔黑板每孔加入100μL细胞，100μL底物，而对应的对照组只加入相同浓度的底物作为背景信号。37℃静置，使用酶标仪读取激发波长/发射波长为380nm/460nm处荧光强度，每2分钟检测一次。最后采用GraphPad软件处理数据，以底物浓度为横坐标，荧光数值为纵坐标，绘制Michaelis-Menten曲线并计算Km值。该底物在不同时间段的Km值为347～550μM，如图1所示，30min时Suc-Gly-Pro-AMC对应的Km值为528.7μM。
实施例3IC50值测定
将已消化的U87MG细胞系吹匀为单个细胞的PBS混悬液，细胞计数100万/mL。将Suc-Gly-Pro-AMC稀释至25μM。将FAP抑制剂UAMC-1110稀释至500pM，1nM，5nM，50nM，500nM，2μM共6个浓度梯度，然后96孔黑板每孔依次加入100μL细胞，50μL FAP抑制剂，50μL底物，另外设一组只加入100μL细胞和100μL底物，使用酶标仪37℃检测，读取60min内激发波长/发射波长为380nm/460nm处荧光强度，每15min读取一次，以时间为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制曲线，再利用GraphPad Prism 8软件进行非线性回归拟合IC50值。如图2所示，UAMC-1110的IC50值15min为40.71nM，30min为55.77nM，45min为59.07nM，60min为67.98nM。
实施例4使用不同底物筛选FAP抑制剂
对照组：底物分别为Gly-Pro-AMC、Cbz-Gly-Pro-AMC和Suc-Gly-Pro-AMC，100万/mL U87MG细胞系，底物浓度均为25μM。
实验组：底物分别为Gly-Pro-AMC、Cbz-Gly-Pro-AMC和Suc-Gly-Pro-AMC，100万/mL U87MG细胞系，1μM FAP抑制剂UAMC-1110，底物浓度均为25μM。
应用酶标仪读取60min内激发波长/发射波长为380nm/460nm处荧光强度，每15min读取一次，以时间为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制曲线。结果如图3所示，图3为U87MG细胞与底物Z-Gly-Pro-AMC，Suc-Gly-Pro-AMC或底物Z-Gly-Pro-AMC，Suc-Gly-Pro-AMC加FAP抑制剂(UAMC-1110)反应90分钟的荧光值变化图。
由图3可以看出：15分钟后加入抑制剂的Suc-Gly-Pro-AMC荧光信号明显下降，达到91.9±1.99％，该抑制率是Cbz-Gly-Pro-AMC的2.9倍，是Gly-Pro-AMC的5.2倍。因此，底物Gly-Pro-AMC、Cbz-Gly-Pro-AMC和Suc-Gly-Pro-AMC在表达FAP蛋白的体系中均能筛选FAP抑制剂，其中以Suc-Gly-Pro-AMC更优。
实施例5不同抑制剂的IC50值
将已消化的U87MG细胞系吹匀为单个细胞的PBS混悬液，细胞计数100万/mL。将Suc-Gly-Pro-AMC稀释至25μM。将各抑制剂分别稀释5-6个浓度梯度，UAMC-1110(500pM，1nM，5nM，50nM，500nM，2μM)、Ac-Gly-BoroPro(5nM，50nM，500nM，1μM，5μM，10μM)、Talabostat(5nM，50nM，100nM，500nM，1μM，2μM)、Sitagliptin(1μM，10μM，100μM，250μM，500μM)、Vildagliptin(1μM，10μM，50μM，100μM，500μM，2mM)、Alogliptin(50μM，500μM，1mM，2mM，5mM，10mM)和Saxagliptin(10μM，100μM，500μM，1mM，2.5mM，10mM)。然后96孔黑板每孔依次加入100μL细胞，50μL不同浓度抑制剂，50μL底物，37℃下孵育30分钟，使用酶标仪读取激发波长/发射波长为380nm/460nm处荧光强度，以时间为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制曲线。再利用GraphPad Prism 8软件进行非线性回归拟合IC50值。各抑制剂在30min时IC50值见表1。
表1
Figure BDA0002377955250000081
本发明检测方法包含细胞系(如U87MG)，底物(如Suc-Gly-Pro-AMC)，水解体系(如PBS缓冲液)这一体系，由表1可知，FAP抑制剂(如UAMC-1110、Ac-Gly-BoroPro、Talabostat)的IC50值处于纳摩尔水平，对本体系的水解反应有明显的抑制效果，抑制能力较强，而DPP4抑制剂(如Sitagliptin、Vildagliptin、Alogliptin和Saxagliptin)的IC50值均较高，对本体系的水解反应基本未产生抑制效果，抑制能力较弱。表1中本发明检测方法所测IC50值与文献值的活性趋势一致，数量级接近。说明本发明的方法准确可靠。
实施例6不同细胞系筛选
根据实施例4的步骤和条件筛选FAP抑制剂，不同的是，采用的细胞系为100万/mLHT1080细胞系。
结果如图4所示，图4为HT1080细胞与底物Z-Gly-Pro-AMC，Suc-Gly-Pro-AMC或底物Z-Gly-Pro-AMC，Suc-Gly-Pro-AMC加FAP抑制剂(UAMC-1110)反应90分钟的荧光值变化图。
由图4可以看出：15分钟后加入抑制剂的荧光信号明显下降。并且，底物Suc-Gly-Pro-AMC略优于Z-Gly-Pro-AMC。此外，与图3相比，采用底物Suc-Gly-Pro-AMC与U87MG细胞系的检测体系优于底物Suc-Gly-Pro-AMC与HT1080细胞系的检测体系。因此，底物Suc-Gly-Pro-AMC与U87MG细胞系的检测体系是更优选的实施方式。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims (7)

1.一种FAP抑制剂的活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：将不同浓度的FAP抑制剂和FAP蛋白混合，再与底物分子进行水解反应，得到水解产物；所述底物分子选自Gly-Pro-AMC、Cbz-Gly-Pro-AMC、Suc-Gly-Pro-AMC中的任意一种；
步骤S2：对步骤S1得到的水解产物进行荧光检测。
2.根据权利要求1所述的FAP抑制剂的活性检测方法，其特征在于，所述FAP蛋白由U87MG细胞系、HT1080细胞系或PC-3细胞系表达。
3.根据权利要求2所述的FAP抑制剂的活性检测方法，其特征在于，水解反应体系中，所述细胞系的细胞计数为(50～150)万/mL。
4.根据权利要求1所述的FAP抑制剂的活性检测方法，其特征在于，水解反应体系中，所述底物分子的浓度为5μM～2mM。
5.根据权利要求1所述的FAP抑制剂的活性检测方法，其特征在于，水解反应体系中，所述不同浓度的FAP抑制剂的浓度范围为500pM～2μM。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的FAP抑制剂的活性检测方法，其特征在于，所述水解反应的溶液选自pH 7.0～8.0的PBS缓冲液或Tris-NaCl缓冲液。
7.根据权利要求1-5中任意一项所述的FAP抑制剂的活性检测方法，其特征在于，所述荧光检测的条件包括：激发波长为380nm，发射波长为460nm。
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