CN111235137A

CN111235137A - 一种l-阿拉伯糖异构酶及其应用

Info

Publication number: CN111235137A
Application number: CN202010135941.1A
Authority: CN
Inventors: 齐向辉; 张国艳; 员君华; 袁娇; 张宇飞; 王洋
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2020-03-02
Filing date: 2020-03-02
Publication date: 2020-06-05

Abstract

本发明提供了一种来源于益生菌‑青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis CICC 6178)的L‑阿拉伯糖异构酶基因、其编码酶，以及含有该基因的重组子。本发明公开的L‑阿拉伯糖异构酶BAAI具有优良的酶学特性，其最适pH为6.5，最适反应温度为55℃。本发明提供的L‑阿拉伯糖异构酶以D‑半乳糖为最佳底物，具有高效转化D‑半乳糖为D‑塔格糖的特点，转化率达到了90％，更有利于D‑塔格糖的生产，是制备功能性甜味剂D‑塔格糖的良好来源酶。

Description

一种L-阿拉伯糖异构酶及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种L-阿拉伯糖异构酶及其应用。

背景技术

D-塔格糖(D-Tagatose)是一种自然界中较为稀有的天然己酮糖，分子式为C₆H₁₂O₆，相对分子质量为180.16。纯净的D-塔格糖为白色的晶体状物质，其甜味是蔗糖的92％，且无任何不良异味和余味。在高等动物包括人体中，只有少量的D-塔格糖能被小肠吸收，产生的热量仅为1.5kcal/g，不足蔗糖的1/3，因此D-塔格糖被认定为一种低热量甜味剂。

D-塔格糖首先被发现于热带植物Sterculia(一种常青树)的树胶中，在苔藓、地衣等低等植物以及加热过的牛乳、乳粉、酸乳、干酪等乳制品中也少量存在，2001年美国食品与药物管理局(FDA)确认了D-塔格糖的食品安全性(GRAS)。D-塔格糖是一种具有低热量值、零血糖生成指数、血糖钝化作用、无龋齿性、益生元作用和抗氧化活性等优良营养特性的低热量甜味剂，并且具有改善肠道菌群、治疗Ⅱ型糖尿病、降低胆固醇、预防结肠癌等生理功效，因此被作为蔗糖的代替品应用于健康饮料及酸乳、果汁等产品中；同时还被广泛应用于糖尿病专用食品、减肥食品、口香糖、谷物食品、饮料、肉制品、糖果等工业中，并在医药行业被用于咳嗽糖浆、粉剂、起泡剂、固定假牙的豁合剂及口腔消毒剂中。

D-塔格糖作为一种稀有单糖，其理化性质和生理功能已经被证实，具有广阔的市场前景。D-塔格糖已在多个国家作为食品添加剂使用，但目前国内对于D-塔格糖的研究还未实现工业化生产，还处于实验室研究阶段，如何高效生产D-塔格糖丞待解决。

D-塔格糖由于其稀少存在的特性使得天然提取法制备D-塔格糖难以实现，因此D-塔格糖的研究普遍利用化学法和生物法两种。化学法是以乳清或乳糖为原料，在酸或乳糖水解酶的作用下被水解为D-半乳糖和D-葡萄糖，再利用可溶性碱金属盐或碱土金属盐、铝酸钾等化学催化剂将D-半乳糖异构化成D-塔格糖。此方法存在副产物多、纯化烦琐和污染大等缺点，不利于工业化生产。生物法可以有效的克服这些缺点，目前报道的生物法生产D-塔格糖按原料不同分为两种方法：第一种是由Izumori课题组提出的，以半乳糖醇为原料，利用半乳糖醇脱氢酶将其氧化成D-塔格糖；或者以D-山梨糖为原料，在D-阿洛酮糖-3-差向异构酶和D-塔格糖-3-差向异构酶的催化下生成D-塔格糖。但是半乳糖醇和D-山梨糖的价格很高，该方法的商业应用价值不大。第二种是Cheetham等在1993年提出的，利用L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinose isomerase，L-AI)将D-半乳糖转化为D-塔格糖。L-AI是将L-阿拉伯糖异构化为L-核酮糖的酶，由于D-半乳糖与L-阿拉伯糖结构上的相似性，L-AI又能将D-半乳糖异构化为D-塔格糖，因此该酶被广泛应用于制备D-塔格糖的研究。有文献报道，L-AI是目前用于生物法转化D-半乳糖生产D-塔格糖最有效的酶。其中，D-半乳糖又可经β-半乳糖苷酶水解廉价的奶制品工业废弃物乳清或乳糖获得。

目前报道的L-AI的来源菌主要是嗜热菌和乳酸菌，来源于不同菌的L-AI的性质不同，不同理化特性的L-AI使得应用于D-塔格糖时生产效率存在不同。首先，L-AI的最适温度是影响D-塔格糖的生产的一大重要因素，最适温度升高，有利于反应向产物方向进行，因此，较高的反应温度可以提高D-塔格糖的产量。然而，当反应温度高于80℃时极易发生褐变反应，这对于食品工业的应用是非常不利的。因此，极端嗜热菌来源的L-AI不利于D-塔格糖的制备。其次，D-塔格糖在pH3-7之间可稳定存在，最适pH偏碱性的L-AI不利于产物D-塔格糖的积累，可引起副产物的产生；另一方面，D-塔格糖的生产可以廉价的乳清或乳糖为底物，而乳糖水解通常在酸性条件下进行，因此，筛选适应酸性条件的L-AI可以降低D-塔格糖的生产成本，简化生产工艺。但目前所报道的L-AI大部分是以碱性为最适pH，这不利于D-塔格糖工业化生产的实现。底物特异性研究显示，目前报道的L-AI几乎均是以L-阿拉伯糖为最佳底物，这导致L-AI用于转化D-半乳糖生产D-塔格糖存在转化率不高的问题。因此，寻找一种最适温度适宜、可适应酸性环境的、且以D-半乳糖为最佳底物的L-AI对于工业化制备获得转化率高的D-塔格糖具有重要的研究意义和实际应用价值。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种L-阿拉伯糖异构酶及其应用，所述L-阿拉伯糖异构酶具有优良的酶学特性，能以D-半乳糖为最佳底物，高效转化合成D-塔格糖。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种L-阿拉伯糖异构酶BAAI，所述L-阿拉伯糖异构酶BAAI的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明提供了一种所述L-阿拉伯糖异构酶BAAI的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

优选的，本发明所述的L-阿拉伯糖异构酶BAAI来源于益生菌-青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CICC 6178。

优选的，本发明所述SEQ ID NO：2核苷酸序列由青春双歧杆菌的araA基因序列为模板，以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物扩增得到。

本发明提供了一种含有所述编码基因的重组子。

优选的，所述重组子的基础质粒为pANY1。

本发明提供了所述的L-阿拉伯糖异构酶BAAI、所述编码基因、所述重组子在合成D-塔格糖中的应用。

优选的，所述应用为L-阿拉伯糖异构酶BAAI对底物D-半乳糖进行转化反应，得到D-塔格糖。

优选的，所述转化反应的温度为50～70℃。

优选的，所述转化反应的pH值为5-7。

优选的，所述的D-半乳糖中添加有金属离子，所述金属离子优选为Mn²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺中的一种或几种。

所述Mn²⁺在底物中的浓度优选为5-8mM。

本发明提供了一种L-阿拉伯糖异构酶BAAI，本发明所提供的L-阿拉伯糖异构酶BAAI来源于青春双歧杆菌，具有优良的酶学特性，最适pH为6.5，最适反应温度为55℃，与乳糖水解生成D-半乳糖的反应pH相契合，有利于乳糖到D-塔格糖的高效低成本生产，同时酸性条件下可减少副反应的发生。而且，本发明提供的L-阿拉伯糖异构酶能够以D-半乳糖为最佳底物，具有高效转化D-半乳糖为D-塔格糖的特点，转化率达到了90％，是制备功能性甜味剂D-塔格糖的良好来源酶，更有利于D-塔格糖的工业化生产。

附图说明

图1为青春双歧杆菌的araA基因PCR扩增结果；

图2为青春双歧杆菌L-AI的表达及纯化结果；

图3为青春双歧杆菌的L-AI的进化树分析结果；

图4为青春双歧杆菌的L-AI的同源性分析结果；

图5为青春双歧杆菌L-AI的酶学性质研究结果；

其中，A为L-阿拉伯糖异构酶BAAI在不同温度下的相对酶活性；

B为L-阿拉伯糖异构酶BAAI在不同温度下的稳定性试验结果；

C为L-阿拉伯糖异构酶BAAI在不同pH值下的相对酶活性；

D为L-阿拉伯糖异构酶BAAI在不同pH下的稳定性试验结果；

E为L-阿拉伯糖异构酶BAAI在不同金属离子存在下的相对酶活性；

F为L-阿拉伯糖异构酶BAAI在不同浓度Mn²⁺存在下的相对酶活性；

G为L-阿拉伯糖异构酶BAAI针对不同底物的相对酶活性；

图6为不同底物与BAAI之间的分子模拟对接图：

其中，A为以D-半乳糖为底物时，底物与酶之间形成的氢键数；

B为以D-木糖为底物时，底物与酶具有的氢键数；

C为以L-阿拉伯糖为底物时，底物与酶之间形成的氢键数；

D为以D-葡萄糖为底物时，底物与酶分子之间的氢键数。

具体实施方式

本发明提供了一种L-阿拉伯糖异构酶BAAI，所述L-阿拉伯糖异构酶BAAI的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供的L-阿拉伯糖异构酶BAAI来源于青春双歧杆菌CICC6178，能以D-半乳糖为最佳底物生产D-塔格糖。所述L-阿拉伯糖异构酶BAAI的酶活用半胱氨酸咔唑法测定，酶活力为44.67U/mg，转化D-半乳糖生成D-塔格糖的转化率为90％。本发明中所述SEQ ID NO：1所示序列的L-阿拉伯糖异构酶BAAI分子量约为55kDa。

本发明提供了一种L-阿拉伯糖异构酶BAAI的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。在本发明中，所述L-阿拉伯糖异构酶BAAI基因优选由如下方法得到：利用PCR技术，在引物SEQ ID NO：3和引物SEQ ID NO：4的作用下，以青春双歧杆菌CICC6178的总基因组DNA为模板，扩增得到编码L-阿拉伯糖异构酶BAAI的基因序列。

优选的，本发明用于扩增所述编码基因的引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示

)；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示

所述引物对下划线部分分别为SacI和StuI酶切位点，波浪线部分为与pANY1质粒同源的上下游同源臂。

本发明提供了一种含有所述编码基因的重组子，优选的，所述重组子的基础质粒为pANY1。

本发明还提供了L-阿拉伯糖异构酶BAAI在合成D-塔格糖中的应用。上述应用中，L-阿拉伯糖异构酶BAAI对底物D-半乳糖进行转化反应生产D-塔格糖。反应体系为：L-阿拉伯糖异构酶BAAI，底物为D-半乳糖溶液。反应体系的酶浓度、添加量、底物浓度等可以调整。所述L-阿拉伯糖异构酶BAAI与所述D-半乳糖的用量比优选为(0.4-0.6)mg：(90-110)mM，更优选为0.5mg：100mM。

本发明中，所述转化反应的温度优选为50～70℃，更优选为50-60℃，最优选为55℃；转化反应的pH值优选为5-7，更优选为6.5；转化反应时间优选为9-12小时，更优选为10小时。

本发明中，所述的D-半乳糖溶液中优选添加有金属离子，其中所述金属离子优选为Mn²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺中的一种或几种。其中所述Mn²⁺在底物中的浓度优选为5-8mM，更优选为6mM。所述金属离子对本发明的L-阿拉伯糖异构酶BAAI具有激活作用，能激活L-阿拉伯糖异构酶BAAI的酶活力。

本发明中，转化反应结束后，获得产物D-塔格糖。经验证该酶能够以D-半乳糖为最佳底物生产D-塔格糖，转化率达到90％。优选的，转化率的计算方法为：转化率＝生成的D-塔格糖/初始底物D-半乳糖。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1青春双歧杆菌基因组的获得

1.将购自于中国微生物保藏中心菌株编号为CICC 6178的益生菌-青春双歧杆菌接种于TPY培养基中进行液体厌氧培养24h，TPY培养基的配方为(g/L)：水解酪蛋白10、蛋白胨5、酵母粉2、葡萄糖5、L-半胱氨酸0.5、磷酸氢二钾2、氯化镁0.5、硫酸锌0.25、氯化钙0.15、氯化铁0.001、吐温801ml；

2.将步骤1中培养获得的青春双歧杆菌利用CTAB法提取获得青春双歧杆菌基因组。

实施例2重组子E.coli BL21/pANY1-araA的构建、表达及纯化

1)以Genbank数据库公开的青春双歧杆菌的编码L-AI的araA基因序列为模板，结合载体pANY1上多克隆位点及同源臂的特征，利用生物信息学VectorNTI软件设计合成上游引物F:5’-GGGGGATCCACTAGTAGGCCTATGGCAATGGAAAAC-3’和下游引物R:5’-AGCAGCCAACTGCAGGAGCTCTCAGTGACGGTTGTT-3’；

2)以实施例1中提取得到的青春双歧杆菌基因组DNA为模板，利用NEB Q5高保真聚合酶PCR扩增目的基因araA。

所述PCR反应条件为：预变性：95℃、5min，变性：94℃、30s，退火：58℃、30s，延伸：72℃、50s，终延伸：72℃、5min，34个循环；

3)所得的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小约为1.5Kb的电泳条带，如图1所示，将PCR产物利用产物纯化试剂盒获得纯化的araA基因；

4)pANY1质粒经SacI和StuI双酶切线性化后利用切胶纯化获得线性化质粒，按照一步克隆试剂盒的方法将步骤3)中的araA基因与线性化质粒进行重组质粒构建；通过化学转化方法将重组质粒转化于E.coli中，通过PCR验证、提取质粒验证以及测序验证筛选转化成功的阳性克隆子，保存并命名为E.coli BL21/pANY1-araA。

实施例3L-阿拉伯糖异构酶BAAI的诱导表达

将重组子E.coli BL21/pANY1-araA接种于LB培养基(酵母粉10g/L、胰蛋白胨20g/L、氯化钠20g/L)中，37℃、200rpm振荡培养至OD为0.4-0.6之间，加入终浓度为1mM的IPTG诱导物，25℃、120rpm低速过夜诱导后L-AI表达，利用SDS-PAGE检测L-AI的表达情况，以不加IPTG诱导的重组菌为空白对照，然后将表达成功的L-AI利用包涵体复性试剂盒进行包涵体L-AI的复性和纯化，如图2所示，得到一条大小为55kDa的单一纯净的蛋白条带，保存纯酶样品，命名为BAAI。

实施例4L-阿拉伯糖异构酶的生物信息学分析

经PCR扩增、克隆后基因测序得知，编码青春双歧杆菌L-AI的基因大小为1515bp，其序列为：atggcaatggaaaacccatttgaaggcaaggaaatctggttcggcgtcggatcgcaggacctctacggcgaggaggcgctgcgccaggtggcccagcagaccggcgagatggtcgacttcctcaacgcgaccggcaagatcccggccaagatcgtgctcaagccgaccctgaagtcctccgacggcgtcaaggccttcatgaccgaagcctccgccaacccgaacgtcatcggcgtgatcacctggtgccacaccttctccccggccaagatgtggatccgcggcctcgaagcgctgaccaagccgctgctgcagctggccacccagcaccacaaggaaatcccgtgggagaccatcgacatggacttcatgaacctgaaccaggccgcccacggcgaccgtgagttcggctacatcgtgtcccgtctcggcattccgcgcaagatcgtcgtcggccactacaccgatccggaagtcgccgaaaaggtcggcacctgggctcgcgcctgcgccggctgggatgcctcccagaacatgaaggtcatgcgttggggcgacaacatgcgcaacgtggccgtcaccgaaggcgacaagaccgaagccgaacgcgtgttcggcgcttcgatcaacacctgggccgtcaacgacctcgtcgccgcctacgagaaggtcaaggacagccaggtcaaggacctcatcgaagactacaaggccaagtacgacgtggcccccgagctgcttgattcccgctacgatgagctgttcatcgcagccaaggaagaggccgccatggtcaacatgatgcgtgagaacggttgcaccgccggcgtcgacaacttcgaagacctcggcaccctgccgcagctgccgggcgtcggcccgcagcgcttcccgtccgagtacggctggggcttctccgccgaaggcgattggaagacctccgtgctggtgcgcatcggcgccgtgatgggctacggccttgagggtggcgcctccctgatggaggactactcctacaacttcgagccgggcaacgagctcgacatgggttcccacatgctggaagtctccccggccatcggcactatcgccaagccgaagctggcgatctacccgctgggcatcggcggcaagtccgacccggtccgcctggtgttctccggcaagccgaccgacgccgtcgtggtctccatggccgacgagcgcgaacgcttccgtctgctcatggacgaggtcaccgtcgtcgagccgcagggctccctgaagaacctgccgtgcgcccgcgccgtgtggaagccgaagccggacctgaagaccgccgtgcagtgctggatcaccgccggtggctcccaccacacctgcatgaccacgtccgttggccgtgaggcttgggaggacttcgcccgcatcgccggcgtcgaactcgccgtcatcgacgagaacaccaacgcccgccagttcgagaaggagctggagatcagcgagatgtaccaccgcctcaacaaccgtcactga；

青春双歧杆菌L-AI的基因编码504个氨基酸，其氨基酸序列为：MAMENPFEGKEIWFGVGSQDLYGEEALRQVAQQTGEMVDFLNATGKIPAKIVLKPTLKSSDGVKAFMTEASANPNVIGVITWCHTFSPAKMWIRGLEALTKPLLQLATQHHKEIPWETIDMDFMNLNQAAHGDREFGYIVSRLGIPRKIVVGHYTDPEVAEKVGTWARACAGWDASQNMKVMRWGDNMRNVAVTEGDKTEAERVFGASINTWAVNDLVAAYEKVKDSQVKDLIEDYKAKYDVAPELLDSRYDELFIAAKEEAAMVNMMRENGCTAGVDNFEDLGTLPQLPGVGPQRFPSEYGWGFSAEGDWKTSVLVRIGAVMGYGLEGGASLMEDYSYNFEPGNELDMGSHMLEVSPAIGTIAKPKLAIYPLGIGGKSDPVRLVFSGKPTDAVVVSMADERERFRLLMDEVTVVEPQGSLKNLPCARAVWKPKPDLKTAVQCWITAGGSHHTCMTTSVGREAWEDFARIAGVELAVIDENTNARQFEKELEISEMYHRLNNRH；

将BAAI的氨基酸序列进行同源性分析，构建系统发育树，如图3所示，青春双歧杆菌的L-AI与长双歧杆菌的L-AI具有较高的保守性；如图4所示，通过蛋白活性位点中心氨基酸分析，青春双歧杆菌的L-AI与目前发表的L-AI具有活性位点氨基酸残基高度保守性。

实施例5L-阿拉伯糖异构酶酶学性质研究

1.添加一定量的BAAI于0.5M D-半乳糖底物溶液中，分别于45℃，50℃，55℃，58℃，60℃，62℃，65℃，68℃，和70℃下进行1h的反应，通过测定不同温度下的酶活力，比较得出该酶最适温度；并且将BAAI于50-80℃下孵育2h后测定残余酶活力，从而获得BAAI的温度稳定性；结果如图5A所示，BAAI的最佳温度为55℃；如图5B所示，在50-65℃孵育2h仍保留大于80％的酶活力；

2.添加一定量的BAAI于不同pH(pH3-10)的0.5MD-半乳糖底物溶液中，在上述获得的最适温度条件下反应1h后测定酶活力得出该酶的最适pH；并且将BAAI于pH5-8之间孵育24h后测定其残余酶活力，得出BAAI的pH稳定性；结果如图5C所示，BAAI的最佳pH为6.5；如图5D所示，BAAI在pH6-7之间有很好的稳定性；

3.添加一定量的BAAI于加有1mM不同金属离子(FeSO₄,ZnCl₂,CoSO₄,MnCl₂,NiCl₂,CaCl₂,CuCl₂,EDTA)的0.5M D-半乳糖底物溶液中，在上述得出的最佳温度和pH条件下反应1h后通过测定酶活力得出不同离子对该酶的激活或抑制作用，得出最佳激活作用的离子种类；结果如图5E所示，可以看出，Mn²⁺对BAAI的激活作用最为显著；

4.将含有0-10mM的不同浓度Mn²⁺的0.5M D-半乳糖溶液作为底物溶液，分别添加相同量的BAAI进行反应后测定酶活力，得出具备最佳激活作用的Mn²⁺离子浓度；结果如图5F所示，6mM的Mn²⁺可最大程度的激活BAAI的酶活力；

5.配置0.4M的不同的底物溶液，分别是D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖，添加一定量的BAAI进行反应后测定酶活力，得出该酶的底物特异性；结果如图5G显示，D-半乳糖为BAAI的最佳底物；

6.分别配置0、10、20、50、100、200、300、400、500mM的一系列的D-半乳糖和L-阿拉伯糖，分别研究最适条件下的该酶的动力学常数，结果显示，当以D-半乳糖为底物时，Km,Vmax和Kcat/Km分别为22.4mM,489U/mg和9.3mM^-1min^-1；当以L-阿拉伯糖为底物时，分别为40.2mM，275.1U/mg，8.6mM^-1min^-1。由以上动力学常数可知，以D-半乳糖为底物时，该酶表现出较好的酶学特性，这与上述对于该酶的底物特异性的研究结果一致；

通过分子模拟对接软件对BAAI和不同底物之间进行蛋白-底物的模拟对接，如图6A所示，从分子层面进行分析可知，以D-半乳糖为底物时，底物与酶之间形成的氢键数为5；如图6C所示，以L-阿拉伯糖与酶之间形成的氢键数仅为3，与D-木糖为底物时具有相同的氢键数(图6B)；而以D-葡萄糖为底物时，底物与酶分子之间的氢键数较少(图6D)。以上分析从分子层面论证了该酶的最佳底物为D-半乳糖，而不是L-阿拉伯糖。

实施例6半胱氨酸咔唑法测定L-阿拉伯糖异构酶酶活

1.在实施例5中研究所得的酶的最佳条件下，以0.5M的含有6mM Mn²⁺的pH为6.5的D-半乳糖为底物溶液，加入0.5mg的BAAI，在最佳温度55℃下反应1h后向反应混合液中加入0.5M的HCl以终止反应；

2.取步骤1中反应液100ul，补加蒸馏水至1ml，加入6ml硫酸溶液后立即加入0.2ml半胱氨酸盐酸盐溶液，激烈摇匀后，加入0.2ml咔唑酒精溶液，摇匀，60℃保温10min，冷却后在560nm处测定吸光值，计算酶活力，结果显示，该BAAI在最佳酶活条件下的酶活力为44.67U/mg。

实施例7纯化的L-阿拉伯糖异构酶转化D-塔格糖的研究

配置100mM的含6mM Mn²⁺的pH6.5的D-半乳糖溶液，添加0.5mg下进行纯酶转化D-半乳糖生产D-塔格糖10h，高效液相色谱法测定反应液中D-塔格糖的浓度，计算该酶转化D-半乳糖生成D-塔格糖的转化率，结果显示为90％。由此可见，利用本发明的L-阿拉伯糖异构酶BAAI能够以D-半乳糖为最佳底物，具有高效转化D-半乳糖为D-塔格糖的特点，表达后直接纯酶转化获得的转化率达到了90％，是一种具有优势的可用于功能性甜味剂D-塔格糖的工业化生产的良好的L-AI的来源。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 江苏大学

<120> 一种L-阿拉伯糖异构酶及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 504

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

Met Ala Met Glu Asn Pro Phe Glu Gly Lys Glu Ile Trp Phe Gly Val

1 5 10 15

Gly Ser Gln Asp Leu Tyr Gly Glu Glu Ala Leu Arg Gln Val Ala Gln

20 25 30

Gln Thr Gly Glu Met Val Asp Phe Leu Asn Ala Thr Gly Lys Ile Pro

35 40 45

Ala Lys Ile Val Leu Lys Pro Thr Leu Lys Ser Ser Asp Gly Val Lys

50 55 60

Ala Phe Met Thr Glu Ala Ser Ala Asn Pro Asn Val Ile Gly Val Ile

65 70 75 80

Thr Trp Cys His Thr Phe Ser Pro Ala Lys Met Trp Ile Arg Gly Leu

85 90 95

Glu Ala Leu Thr Lys Pro Leu Leu Gln Leu Ala Thr Gln His His Lys

100 105 110

Glu Ile Pro Trp Glu Thr Ile Asp Met Asp Phe Met Asn Leu Asn Gln

115 120 125

Ala Ala His Gly Asp Arg Glu Phe Gly Tyr Ile Val Ser Arg Leu Gly

130 135 140

Ile Pro Arg Lys Ile Val Val Gly His Tyr Thr Asp Pro Glu Val Ala

145 150 155 160

Glu Lys Val Gly Thr Trp Ala Arg Ala Cys Ala Gly Trp Asp Ala Ser

165 170 175

Gln Asn Met Lys Val Met Arg Trp Gly Asp Asn Met Arg Asn Val Ala

180 185 190

Val Thr Glu Gly Asp Lys Thr Glu Ala Glu Arg Val Phe Gly Ala Ser

195 200 205

Ile Asn Thr Trp Ala Val Asn Asp Leu Val Ala Ala Tyr Glu Lys Val

210 215 220

Lys Asp Ser Gln Val Lys Asp Leu Ile Glu Asp Tyr Lys Ala Lys Tyr

225 230 235 240

Asp Val Ala Pro Glu Leu Leu Asp Ser Arg Tyr Asp Glu Leu Phe Ile

245 250 255

Ala Ala Lys Glu Glu Ala Ala Met Val Asn Met Met Arg Glu Asn Gly

260 265 270

Cys Thr Ala Gly Val Asp Asn Phe Glu Asp Leu Gly Thr Leu Pro Gln

275 280 285

Leu Pro Gly Val Gly Pro Gln Arg Phe Pro Ser Glu Tyr Gly Trp Gly

290 295 300

Phe Ser Ala Glu Gly Asp Trp Lys Thr Ser Val Leu Val Arg Ile Gly

305 310 315 320

Ala Val Met Gly Tyr Gly Leu Glu Gly Gly Ala Ser Leu Met Glu Asp

325 330 335

Tyr Ser Tyr Asn Phe Glu Pro Gly Asn Glu Leu Asp Met Gly Ser His

340 345 350

Met Leu Glu Val Ser Pro Ala Ile Gly Thr Ile Ala Lys Pro Lys Leu

355 360 365

Ala Ile Tyr Pro Leu Gly Ile Gly Gly Lys Ser Asp Pro Val Arg Leu

370 375 380

Val Phe Ser Gly Lys Pro Thr Asp Ala Val Val Val Ser Met Ala Asp

385 390 395 400

Glu Arg Glu Arg Phe Arg Leu Leu Met Asp Glu Val Thr Val Val Glu

405 410 415

Pro Gln Gly Ser Leu Lys Asn Leu Pro Cys Ala Arg Ala Val Trp Lys

420 425 430

Pro Lys Pro Asp Leu Lys Thr Ala Val Gln Cys Trp Ile Thr Ala Gly

435 440 445

Gly Ser His His Thr Cys Met Thr Thr Ser Val Gly Arg Glu Ala Trp

450 455 460

Glu Asp Phe Ala Arg Ile Ala Gly Val Glu Leu Ala Val Ile Asp Glu

465 470 475 480

Asn Thr Asn Ala Arg Gln Phe Glu Lys Glu Leu Glu Ile Ser Glu Met

485 490 495

Tyr His Arg Leu Asn Asn Arg His

500

<210> 2

<211> 1515

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

atggcaatgg aaaacccatt tgaaggcaag gaaatctggt tcggcgtcgg atcgcaggac 60

ctctacggcg aggaggcgct gcgccaggtg gcccagcaga ccggcgagat ggtcgacttc 120

ctcaacgcga ccggcaagat cccggccaag atcgtgctca agccgaccct gaagtcctcc 180

gacggcgtca aggccttcat gaccgaagcc tccgccaacc cgaacgtcat cggcgtgatc 240

acctggtgcc acaccttctc cccggccaag atgtggatcc gcggcctcga agcgctgacc 300

aagccgctgc tgcagctggc cacccagcac cacaaggaaa tcccgtggga gaccatcgac 360

atggacttca tgaacctgaa ccaggccgcc cacggcgacc gtgagttcgg ctacatcgtg 420

tcccgtctcg gcattccgcg caagatcgtc gtcggccact acaccgatcc ggaagtcgcc 480

gaaaaggtcg gcacctgggc tcgcgcctgc gccggctggg atgcctccca gaacatgaag 540

gtcatgcgtt ggggcgacaa catgcgcaac gtggccgtca ccgaaggcga caagaccgaa 600

gccgaacgcg tgttcggcgc ttcgatcaac acctgggccg tcaacgacct cgtcgccgcc 660

tacgagaagg tcaaggacag ccaggtcaag gacctcatcg aagactacaa ggccaagtac 720

gacgtggccc ccgagctgct tgattcccgc tacgatgagc tgttcatcgc agccaaggaa 780

gaggccgcca tggtcaacat gatgcgtgag aacggttgca ccgccggcgt cgacaacttc 840

gaagacctcg gcaccctgcc gcagctgccg ggcgtcggcc cgcagcgctt cccgtccgag 900

tacggctggg gcttctccgc cgaaggcgat tggaagacct ccgtgctggt gcgcatcggc 960

gccgtgatgg gctacggcct tgagggtggc gcctccctga tggaggacta ctcctacaac 1020

ttcgagccgg gcaacgagct cgacatgggt tcccacatgc tggaagtctc cccggccatc 1080

ggcactatcg ccaagccgaa gctggcgatc tacccgctgg gcatcggcgg caagtccgac 1140

ccggtccgcc tggtgttctc cggcaagccg accgacgccg tcgtggtctc catggccgac 1200

gagcgcgaac gcttccgtct gctcatggac gaggtcaccg tcgtcgagcc gcagggctcc 1260

ctgaagaacc tgccgtgcgc ccgcgccgtg tggaagccga agccggacct gaagaccgcc 1320

gtgcagtgct ggatcaccgc cggtggctcc caccacacct gcatgaccac gtccgttggc 1380

cgtgaggctt gggaggactt cgcccgcatc gccggcgtcg aactcgccgt catcgacgag 1440

aacaccaacg cccgccagtt cgagaaggag ctggagatca gcgagatgta ccaccgcctc 1500

aacaaccgtc actga 1515

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggggatcca ctagtaggcc tatggcaatg gaaaac 36

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agcagccaac tgcaggagct ctcagtgacg gttgtt 36

Claims

1.一种L-阿拉伯糖异构酶BAAI，其特征在于：所述L-阿拉伯糖异构酶BAAI的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的L-阿拉伯糖异构酶BAAI，其特征在于：所述L-阿拉伯糖异构酶BAAI来源于益生菌-青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CICC 6178。

3.一种权利要求1所述L-阿拉伯糖异构酶BAAI的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述SEQ ID NO：2核苷酸序列由青春双歧杆菌CICC 6178的araA基因序列为模板，以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物扩增得到。

5.一种含有权利要求3所述编码基因的重组子。

6.根据权利要求5所述重组子，其特征在于，所述重组子的基础质粒为pANY1。

7.权利要求1所述的L-阿拉伯糖异构酶BAAI、权利要求3所述编码基因、权利要求5所述重组子在合成D-塔格糖中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述L-阿拉伯糖异构酶BAAI对底物D-半乳糖进行转化反应，得到D-塔格糖，所述转化反应的温度为50～70℃，所述转化反应的pH值为5-7。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的D-半乳糖中添加有金属离子，所述金属离子为Mn²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺中的一种或几种。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述Mn²⁺在底物中的浓度为5-8mM。