CN111206080B - 基于纳米孔测序检测片段化核酸突变和甲基化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开基于纳米孔测序同时检测片段化核酸变异和甲基化的方法。本发明通过使用串联接头设计，解决了样品起始量不足的问题，可以将碎片化的核酸连接成长片段，大大提高纳米孔的利用率、有效读长和总体数据量，在检测核酸突变的同时还可进行修饰信息的获取，使得降解或片段化严重的核酸样品特别是肿瘤和液体活检样品中的DNA可以在纳米孔平台进行测序。
Description
技术领域
本发明涉及基因测序领域，具体地涉及一种基于符合纳米孔测序质控标准的串联核酸片段进行片段化核酸小分子检测的方法。
背景技术
纳米孔测序技术具有长读长、直接读取修饰信息和实时数据生产并行分析的特点，在长片段核酸检测变异(包括但不仅限于点突变、插入缺失、倒位易位、基因融合、RNA异常剪切、RNA编辑等多种核酸相关变异)和修饰信息(包括但不仅限于甲基化、乙酰化等)检测方面比二代测序或其他测序平台有更明显优势。该平台支持数据生产和分析并行的特点实现了实时变异/修饰检出和诊断，加上便携式的设计，成为床前快速诊断和监控的优势候选技术。
医学肿瘤样本核酸如cfDNA/RNA、FFPE等，核酸片段化严重(通常在200bp或以下)且通常总量偏低，单独以低起始量短片段进行建库和纳米孔测序，在有效纳米孔利用率、数据产量、数据质量和检测成本上无法体现出该平台的优势。基于纳米孔测序技术，DNA单链通过纳米孔的速度(~500bp/秒)会对测序的精度和有效性造成较大影响，短片段(<500bp)的测序质量偏低或无法有效读取，所以直接将肿瘤样品中获得的片段化DNA，特别是cfDNA(片段分布通常<200bp)建库测序会导致数据质量过低或测序失败，直接影响到该平台在片段化严重的核酸测序应用。
发明内容
针对现有技术中的至少部分技术问题，发明人提供一种基于纳米孔测序检测片段化核酸突变和甲基化的方法。具体地，本发明包括以下内容。
一种基于纳米孔测序检测片段化核酸突变和甲基化的方法，其包括以下步骤：
(1) 处理样品得到含有不同长度的非均一性片段化核酸的混合物；
(2) 通过末端修复或通过单链连接反应在所述片段化核酸的末端加串联接头，其中，所述串联接头由标签序列、酶切位点和保护碱基组成，且所述串联接头的长度为15-30bp；
(3) 使连接有所述串联接头后的核酸组成的文库直接进行平端混合串联连接，或通过酶切位点组合进行粘端有方向性的连接；和
(4) 控制连接反应条件形成具有三代测序读长的连接产物，经纯化分选，分选得到符合纳米孔测序质控标准的串联核酸片段，然后进行纳米孔建库和测序，其中，所述串联核酸片段包含线性连接的多个短片段序列和位于各短片段序列至少一个末端的串联接头。
根据本发明基于纳米孔测序检测片段化核酸突变和甲基化的方法，优选地，所述多个短片段序列各自的长度分别为50-300bp，所述串联核酸片段的长度为1Kb-1Mb。
根据本发明基于纳米孔测序检测片段化核酸突变和甲基化的方法，优选地，所述多个短片段序列具有不同的碱基序列，且各短片段序列之间通过所述串联接头连接。
根据本发明基于纳米孔测序检测片段化核酸突变和甲基化的方法，优选地，所述串联核酸片段进一步包括引物结合区，其中所述引物结合区位于所述串联核酸片段的至少一个末端，或者所述引物结合区的至少一部分位于串联接头内。
根据本发明基于纳米孔测序检测片段化核酸突变和甲基化的方法，优选地，所述串联核酸片段进一步包括单链特异序列探针，其连接至所述串联核酸片段的至少一个末端，或连接至所述串联接头的至少一个末端。
根据本发明基于纳米孔测序检测片段化核酸突变和甲基化的方法，优选地，所述多个短片段序列包括来源于第一样品的短片段序列和来源于第二样品的短片段序列，其中，来源于第一样品的短片段序列与第一串联接头连接，来源于第二样品的短片段序列与第二串联接头连接，第一串联接头和第二串联接头具有不同的标签序列。
根据本发明基于纳米孔测序检测片段化核酸突变和甲基化的方法，优选地，所述片段化核酸为来源于手术或穿刺组织的FFPE或体液的cfDNA。
根据本发明基于纳米孔测序检测片段化核酸突变和甲基化的方法，优选地，在步骤(3)和(4)之间进一步包括利用针对目标区域的探针捕获靶序列，对靶序列进行扩增，然后串联连接得到串联核酸片段。
根据本发明基于纳米孔测序检测片段化核酸突变和甲基化的方法，优选地，在步骤(3)和(4)之间进一步包括利用针对目标区域的探针捕获靶序列，使靶片段与串联接头连接，对得到的带串联接头的靶片段进行扩增，然后串联连接得到串联核酸片段。
本发明通过使用串联接头设计，解决了样品起始量不足的问题，可以将碎片化的核酸连接成长片段(>1kb)通过纳米孔，大大提高纳米孔的利用率、有效读长和总体数据量，同时获取了片段化核酸的修饰信息。使得降解或片段化严重的核酸样品，特别是肿瘤和液体活检样品中的DNA可以在纳米孔平台进行测序。数据产出后利用串联接头上的标签设计可以将多样本数据进行拆分，可以实现检测通量成数量级增加，降低单样品的检测成本，同时加上纳米孔接头自带的标签信息，利用双重标签降噪也有效降低样品间的交叉污染比率。
附图说明
图1 拆分后序列结构和各区段位置分布图。
图2 甲基化位点信号图。其为某一拆分序列(reads_00025981-8a91-48c5-9e83-e804e8184ffc)上甲基化碱基分布和修饰信号强度分布图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“%”为基于重量的百分数。
本发明中，“纳米孔测序质控标准”是指在纳米孔测序时对于样品质量控制的标准，其包括单位时间总数据产量和数据平均质量等，特别地还包括对于核酸长度的要求，其一般为1Kb以上，优选2Kb以上，更优选5Kb以上，例如1Mb。
本发明中，串联接头为用于连接多个短片段的接头，每个串联接头由标签序列、酶切位点和保护碱基组成。在一个串联核酸片段中一般包含一个以上，例如2、4、6、8、10、15、20个或以上的串联接头。每个串联核酸片段中的各串连接头可以相同，也可以不同。各串联接头的长度一般为15-30bp，优选16-28bp，更优选18-25bp。需要说明的是，该长度可根据需要而变化，在特殊情况下也可以低于15bp或高于30bp。
本发明中，串联核酸片段中的短片段可以是长度在10-500bp，例如20-300bp，50-200bp之间的任何片段。在一个串联核酸片段中短片段的数量为2以上，优选5以上，例如8、10等。各短片段为不同长度的多种片段组成的非均一性片段。短片段可以是天然产生的短片段，也可以是人工打断得到的片段。短片段的实例包括血液的cfDNA或FFPE样品的DNA/RNA等。
在某些实施方案中，本发明的串联核酸片段进一步包括引物结合区。该引物结合区优选位于串联核酸片段的至少一个末端，或者引物结合区的至少一部分位于串联接头内。更优选地，引物结合区的至少一部分位于至少串联核酸片段末端的串联接头内。
在某些实施方案中，本发明的串联核酸片段进一步包括探针结合区。该探针结合区的至少一部分位于至少一部分串联接头的内部。
在某些实施方案中，本发明的串联核酸片段包含单链特异序列引物序列，其连接至串联核酸片段的至少一个末端，或连接至串联接头的至少一个末端。
在某些实施方案中，本发明的串联核酸片段包含单链特异序列探针序列，其至少一部分序列位于所述串联接头内。
本发明的串联接头连接的串联核酸片段可用于各种短片段的三代测序中。本发明的应用也可以理解为利用串联接头得到串联核酸片段来测序的方法。本发明的应用可包括任何涉及短片段的样本测序。
在某些实施方案中，肿瘤基因检测用样品为如手术或穿刺组织FFPE、体液cfDNA样品的核酸通常片段化严重，这些短片段的平均长度在200bp以下，部分样品类型，如穿刺和血液样品等的核酸提取总量较低。使用带有标签的串联接头设计可以增加检测样品重数，降低单个样品检测成本，同时获得长度大于1kb的片段用于纳米孔测序，提高纳米孔的使用效率和总有效数据量，使得低起始量的短片段DNA/RNA序列，包括但不仅限于肿瘤组织FFPE，体液cfDNA等样品的核酸可以用于纳米孔平台测序。
在某些实施方案中，本发明的应用为检测核酸修饰如甲基化的方法学。在传统甲基化分析时，需要对核酸样品进行预处理，如重亚硫酸盐处理等，会对DNA造成片段化损伤，使得高度片段化和起始量不足的核酸样品的甲基化检测重复性和稳定性降低。利用纳米孔串联接头设计可以在读取核酸变异的基础上，直接读取核酸的修饰信息，同时通过标签串联接头的数据拆分，可以获取多重样品的总甲基化程度和甲基化富集区段信息。另外，利用纳米孔测序平台的直读修饰信号优势，该设计不仅可以对传统方法检测的5-甲基胞嘧啶信号进行解读，也同时可以对其他修饰包括6-甲基腺嘌呤，以及RNA的修饰信号等进行获取，辅助肿瘤的早筛和分子分型方面的应用。
在某些实施方案中，本发明应用于避免多样品同时测序时的交叉污染。在各测序平台上都有一定比例的交叉污染发生，在多重标签组合的串联接头设计中可以获得有效降噪。数据产出后利用串联接头上的barcode标签设计可以将多样本数据进行拆分，同时加上纳米孔接头自带的barcode标签信息，利用双重组合标签降噪也有效降低了样品间的交叉污染比率。
在某些实施方案中，为满足肿瘤检测中目标区域和序列富集的需求，串联接头可以和基于探针的捕获或则扩增式富集方案联用，达到目标序列的富集效果。基于探针捕获的设计，针对目标区域的探针设计，对带有串联接头的目标序列进行捕获富集后，再进行扩增和串联连接后建库测序。
实施例
1. 接头设计
本实施例以下述示例性结构为例说明串联接头的结构。Barcode(8-10bp)+限制性内切酶位点(4-6bp)+保护碱基(3bp)，其为最精简结构，总长度可以在20bp左右。在此设计区域基础上，还可设计5’带有磷酸基团修饰的接头，如CCGCTTAA-GGATCC-GCG，其中左侧部分为标签序列，中间部分是控制线性连接方向的酶切位点，右侧部分是保护碱基。原则上保留必要设计区域，同时减少占用过多测序数据，可以通过不同酶切位点的组合控制形成有方向性线性串联或成环设计。针对以上不同设计要点，可以在基础设计区域加入PCR结合区设计或与单链特异序列探针或引物序列联用成DNA单链oligo。
2. 实验流程
(1) 提取样品核酸，通过末端修复或通过单链连接反应加串联接头序列。
(2) 连接带标签接头后文库，直接进行平端混合串联连接，或通过酶切位点组合进行粘端有方向性的连接。
(3) 控制连接反应条件(如酶单位和反应时间等)形成平均长度在1kb以上连接产物，对长片段进行纯化分选。
(4)分选后大片段进行纳米孔建库和测序。
(5)测序后，对序列进行标签识别和数据拆分，进行后续生信分析和注释解读。
3. 实际测试数据分析注释结果和连接结构示例
(1)提取2例肿瘤FFPE样本DNA，2例血液cfDNA样本，以及两例甲基化标品DNA(打断处理到200bp左右片段模拟短片段DNA，一例为完全甲基化标品，一例为完全非甲基化标品)，连接串联接头建库(表1)。
表1. 测试样品列表和建库信息
(2)对连接接头后的肿瘤FFPE以及血液样本的DNA片段进行基于探针组的目标序列富集，进行目标序列富集测序。连接接头后的甲基化标品序列不做捕获或PCR处理，保持原有甲基化程度，准备进行甲基化直读测序。
(3)捕获和扩增后的肿瘤DNA文库和标品文库进行混合连接过夜，并对形成的1kb以上的片段进行片段筛选和胶回收。
(4)将长片段进行纳米孔接头连接建库和上机测序。
(5)通过序列比对，对序列进行注释和拆分。如果如表2和图1所示。
表2
根据接头标签拆分数据量和占比，部分非人类基因组的内参序列以及长度，测序质量或标签不完整导致无法鉴定拆分的序列被过滤到其他序列中。
图1中，深色区域为串联接头和不同标签组合，浅色区域为不同来源样品的插入片段和注释，序列的末端可能出现不完整接头，标注为暗色(D702、P0)，各区域在总平均长度1kb长片段上的位置分布信息。经过探针捕获富集和串联长片段测序，其中4个阳性文库串联片段共鉴定出308个含有融合基因片段，示例序列信息见表3，有EML4-ALK融合断点检出的区段被标注出。
表3
检出融合基因的序列示例，检出融合断点的区段用EML4-ALK标注，其他未检出融合基因的短片段只显示标签编号和接头位置信息。
对于完全甲基化和完全非甲基化标品建库的区段进行提取，并使用HDFview进行甲基化位点的信息提取，以及在序列上甲基化碱基的分布和甲基化程度的分析(图2)，获得拆分后片段甲基化的修饰信息谱。
本实施例可以根据不同的标签组合拆分出来源于不同样品的片段化DNA序列，因为长片段通过纳米孔序列，整体的测序质量和读长都符合能纳米孔测序质控标准，可以进行正常生物信息分析和甲基化修饰信息同步提取。而相比基于短片段测序的NGS技术和单独用200bp短序列直接加纳米孔接头建库和上机测序的数据，整体质量和产量常常都低于常规质控标准的情况，该设计使用串联接头技术进行长片段纳米孔测序，在保证数据产出和质量的前提下，进行数据拆分，可以分别统计捕获区域基因变异以及直读甲基化信息。一次测序同时获取基因变异和甲基化双重信息，这一个特点也是除了纳米孔测序平台外其他任何测序平台无法实现的，而串联接头的设计又使得实际临床样品中短片段DNA在纳米孔平台测序得以实现，也体现出本设计和新一代测序平台的合理组合。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
Claims (3)
1.一种基于纳米孔测序检测片段化核酸突变和甲基化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提供来源于手术或穿刺组织的FFPE样品的DNA/RNA作为片段化核酸；
(2)通过末端修复或通过单链连接反应在所述片段化核酸的末端加串联接头，其中，所述串联接头由barcode标签序列、酶切位点和保护碱基组成，且所述串联接头的长度为15-30bp；
(3)对连接串联接头后的片段化核酸进行基于探针组的目标序列富集；
(4)使富集后连接有所述串联接头后的核酸组成的文库直接进行平端混合串联连接，或通过酶切位点组合进行粘端有方向性的连接；和
(5)控制连接反应条件形成具有三代测序读长的连接产物，经纯化分选，分选得到符合纳米孔测序质控标准的串联核酸片段，然后进行纳米孔建库和测序，其中，所述串联核酸片段包含线性连接的5个以上的短片段序列和位于各短片段序列两个末端的串联接头；
短片段序列各自的长度分别为50-300bp，所述串联核酸片段的长度为1Kb-1Mb。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，各短片段序列之间通过所述串联接头连接。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，短片段序列包括来源于第一样品的短片段序列和来源于第二样品的短片段序列，其中，来源于第一样品的短片段序列与第一串联接头连接，来源于第二样品的短片段序列与第二串联接头连接，第一串联接头和第二串联接头具有不同的标签序列。
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