CN111202050A - 一种常温机械器官灌注液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种常温机械器官灌注液及其制备方法，基于每1000mL的总体积，其由以下物质和余量水组成：基于每1g的硫氧还蛋白过氧化物酶II，其包括：聚合血红蛋白4～5g；硫氧还蛋白过氧化物酶II 1g；肝素钠3000～5000u；葡萄糖1～2g；氯化钠0.8～1.5g；头孢西丁钠0.25～0.3g；碳酸氢钠0.15～0.25g；10％复方氨基酸注射液6～10mL；和注射用12种复合维生素0.025～0.03mL。该器官灌注液中，聚合血红蛋白通过与硫氧还蛋白过氧化物酶的协同配合，显著降低了聚合血红蛋白的降解速率，显著增强了聚合血红蛋白的稳定性，从而显著延长了离体器官的保存时间。
Description
技术领域
本发明涉及医疗器械领域，具体涉及一种常温机械器官灌注液及其制备方法。
背景技术
人类很多的疾病来自细胞、组织、器官坏死，从而导致功能丧失，引发人体残疾，甚至死亡，随着现代医学的发展，器官移植技术日趋成熟，单从手术角度来说，器官移植技术已很完美，换头手术都不是大问题。而事实上，器官移植目前仍面临种种困难，对离体器官的保存就是其中之一。器官移植必需移植活的器官，因此，供移植用的器官，从切离供者体内之时起直到其主要血管与受者血管接通期间，始终保持着完整的解剖结构和活性，是移植成功的一个前提。但是，任何器官一旦失去血液供应，细胞得不到所必需的氧和养料，在常温下于短期内即会死亡，能耐受的时间是极短的，如心、肝仅10-15分钟，肾约在45-60分钟，若超过上述时限，移植后就很难恢复功能。在临床实际工作中，则要求常温下的缺血时间越短越好，最好不超过3-5分钟，最长不超过7-8分钟。但是，根本不可能在如此短促的时间内完成移植手术。因此，必需设法使离体器官的活性能长时间维持。
为延长对离体器官的保存时间，科学家探讨了多种方法，其中，低温保存是现在较常用的一种方法，其虽然可以有效延长器官的保存时间，但低温保存对细胞的损伤也很明显，正常情况下，细胞浸浴在高钠低钾的细胞外液内，细胞膜内的Na-K ATP酶(Na泵)细胞内外钠、钾比，钠、钾交换由氧化磷酸化供能。当代谢被抑制，Na泵得不到ATP供给，细胞内蛋白产生胶体渗透压致细胞水肿。细胞内蛋白质与非透过性阴离子产生渗透拉力大约110-140mOsm/kg。低温缺血、Na泵活性受到抑制时，细胞膜电位降低。继而Na和Cl因浓度梯度而进入细胞内，为维持半透膜内外侧水平衡，所以细胞内水聚积致使细胞水肿。
再者，采用灌注的方式延长离体器官的保存也是较为常用的方法，目前常用的灌注液有Krebs-Henseleit液、St ThomasⅡ液，UW液和Celsior液等，但这些灌注液都缺少携氧剂，使灌注的器官始终处理缺氧状态。体外灌注液若不能向离体器官有效供氧，组织和细胞就会因缺氧而增加无氧酵解，造成酸中毒和溶酶体酶激活不良后果。保证氧的供应、维持最低能量代谢和排除代谢废物是器官体外保存中亟待解决的问题。
同时，在缺氧的条件下保存的器官，在其移植再灌注中会造成显著的二次损伤,恢复血流加重保存器官损害的机理尚不完全明了，一般认为与氧自由基损害作用有关，正常情况下，ATP的代谢产物次黄嘌呤被黄嘌呤氧化酶(XOD)迅速地转变为嘌呤进而转变为中产物尿酸。然而，在缺氧严重的情况下，高能键很快耗尽，次黄嘌呤含量增加，XOD转变为一种能产生过氧化物的酶。同时，缺氧也使内源性抗氧化剂如过氧化物歧化酶(SOD)失活或耗尽，当血循环重建氧供，就会产生过量的自由基损伤细胞。
所以，在器官灌注液中加入携氧剂显得尤为重要。红细胞是动物体内天然的氧载体，曾有人将其直接用于器官体外灌注保存。然而，红细胞容易发生破裂，膜内氨基磷脂、内毒素、血型糖蛋白和胞内酶的外渗都可能损伤血管内皮及心肌细胞并造成毛细血管阻塞。
因此，采用无基质血红蛋白代替红细胞是一条新思路。血红蛋白是红细胞中具有载氧功能的蛋白，呈球形结构，分子量为64.5kKD。经过Pemtz等人的多年研究，目前对血红蛋白的结构和功能已经有了较为透彻的了解。血红蛋白由四条多肽链(亚基)组成，它们以非共价键相互作用结合在一起。人全血中主要成分为血红蛋白A，结构为α2β2，其中α链含有141个氨基酸残基，而β链含146个氨基酸残基，α链和β链以较紧密的方式结合成二聚体，2个αβ二聚体以较为松散的结合方式形成了血红蛋白分子。血红蛋白在体内的主要功能是运送氧气，部分二氧化碳和氢离子。四个亚基中每一条链都含有一个可以以可逆方式结合氧的血红素辅基。一个Hb四聚体共可以结合四个氧分子。四个血红素的位置处于贴近分子表面的裂隙内，除了两个组氨酸残基外，围绕血红素的几乎都是非极性残基。血红素中的铁原子在血红素的平面中心和原卟啉环的四个氧原子结合，在血红素平面的两侧，铁原子还能形成两个结合键，这成为第五和第六配位。血红素中铁原子的第五配位键和位于血红素平面一侧F8组氨酸残基(在α链中是87位His，在β链是92位His)结合，这F8His就是近心His。另一组氨基酸残基E7His(在α链中是58位His，在β链是67位His)处于血红素平面的另一侧铁原子的第六配位附近，即远心His，E7His并没有和铁原子结合，E7His和铁原子之间的空隙就是氧气结合的位置，在脱氧血红蛋白相应位置空着，O2能扩散进入到此空间，结合到铁原子的第六配位，而E7His则与氧气可通过氢键相连。血红蛋白中的血红素铁，可以有Fe2+和Fe3 +，只有Fe2+才能结合氧，以Fe3+存在的血红蛋白称为高铁血红蛋白，没有结合O2的功能。
血红蛋白分子中各个结合O2的位点之间有协同作用，一个亚基上结合O2后能促进这个四聚体的其余亚基与O2的结合，反之，氧合血红蛋白的一个亚基释放的O2能促进其余亚基释放出O2，这种协同效应称为希尔效应。在成熟的红细胞中，氧合血红蛋白的相互作用可以用氧解离曲线来描述，在标准条件下，总血红蛋白饱和度为50％时的氧分压为P50。在正常生理条件下，全血P50大约为26Torr。当血红蛋白的氧亲和力上升使氧分子难以从血红蛋白上解离时，氧合曲线左移且P50下降，即50％血红蛋白被氧饱和所需要的氧气减少，但氧气更难从血红蛋白上解离。
2，3-二磷酸甘油酸(2，3-DPG)能够显著影响血红蛋白的氧亲和力，它在人体和其他许多动物的红细胞中存在，浓度大约与血红蛋白相同。在没有2，3-DPG存在时，血红蛋白对氧的亲和力很高，P50很低。2，3-DPG是一个高极性分子，分子量并不大，却带有5个负电荷，是代谢中间物中一个少有的荷电密度高的分子，它与血红蛋白以1：1的比例结合，结合于血红蛋白分子轴对称的中心空穴，正好填满原有的空隙。2，3-DPG是通过与脱氧血红蛋白的结合来影响血红蛋白的氧亲和力的。血红蛋白氧合过程中，2，3-DPG通过影响血红蛋白的构象，使血红蛋白趋向于紧张态(T态)，降低对O2的亲和力。
从红细胞中分离纯化出的游离血红蛋白由于失去了2，3-DPG，所以氧亲和力较高，在组织中难于将结合的氧分子释放。同时，游离的血红蛋白由于失去了红细胞膜和细胞内还原酶系统(如超氧化物歧化酶、硫氧还蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧还蛋白过氧化物酶等)的保护，会迅速解离成为二聚体，且被氧化成高铁血红蛋白，然后经肾脏排出体外，引起血红蛋白尿，严重的还会造成肾功能衰竭。另外，游离的血红蛋白还会施加额外的胶体渗透压，在正常的生理渗透压下，血红蛋白的浓度仅为7g/dL，携氧能力大大降低。因此，脱离了红细胞后的游离血红蛋白，由于具有对氧亲和力过强、稳定性差以及携氧能力过低等缺点，不能直接作为红细胞代用品进行应用。
为了增加血红蛋白的稳定性，防止游离的血红蛋白四聚体的快速解离，以消除肾毒性，同时降低氧亲和力，20世纪60年代前后在国外兴起了人工聚合血红蛋白的研究和开发。血红蛋白经过分子内交联、分子间聚合、共价连接大分子等化学修饰手段形成了各种血红蛋白衍生物，使血红蛋白大分子化，以达到增加稳定性、提高携氧力，降低胶体渗透压的目的。
本公司之前通过戊二醛聚合的方式获得了高活性的携氧聚合血红蛋白(申请号：201910846580.9)，并加入到器官灌注液中以满足器官常温代谢需求的氧气，解决了因器官缺氧而不可以常温长时间保存的问题，提高了器官的常温保存时间，但有时还是不能满足实际的临床保存时间的需要，例如捐献者和接受捐赠的患者在距离较远的不同城市，捐赠者与接受捐赠者时间上不一致等，那么器官很可能因为失活而无法用于移植，这个时间限制，成为供体器官短缺危机的一大原因，让很多患者难以等到移植。
因此，还需进一步提高离体器官的常温保存时间。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
戊二醛聚合血红蛋白作为一种红细胞代用品，其稳定性极其重要。若其作为一种药物，在临床医学上使用，稳定性就更加重要。因此，戊二醛聚合血红蛋白的稳定性(即防止聚合血红蛋白降解为游离血红蛋白)是研制红细胞代用品首先要解决的问题。
为了解决上述问题，发明人通过大量的实验探索后发现，在本申请的器官灌注液中，聚合血红蛋白通过与硫氧还蛋白过氧化物酶的协同配合，显著降低了聚合血红蛋白的降解速率，显著增强了聚合血红蛋白的稳定性，从而显著延长了聚合血红蛋白发挥携氧作用的时间，显著延长了离体器官的保存时间。另外，灌注液中硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ通过与聚合血红蛋白的协同配合，还对组织中一氧化氮的生产与清除具有重要的调控作用，这些特性有效地中和了聚合血红蛋白在这方面的副作用，可以更长时间的维持NO、ET-1等器官活性指标在正常范围内。
特别需要说明的是，虽然现有技术中有部分研究初步证明，在人红细胞内，硫氧还蛋白过氧化物酶可能在多种复杂因素(如pH、盐浓度等)的影响下通过构象变化与血红蛋白进行结合，从而防止血红蛋白的氧化损伤；然而，
其一，目前的研究尚不深入，两者究竟是如何相结合，作用力强度如何，尚没有定
论；
其二，红细胞内和红细胞外(体外)是截然不同的两种环境，失去了细胞膜的保护
且脱离了红细胞内复杂环境的辅助后，在体外环境下，游离血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化
物酶是否还能相互结合，完全是一个未知数；
其三，聚合血红蛋白相比于游离血红蛋白，空间结构以及反应位点均已发生显著
的改变，在此前提下，在体外环境中时，硫氧还蛋白过氧化物酶是否还能与聚合血红蛋白相
互结合并作用，根本无法预知；
其四，现有技术的研究仅仅表明，在红细胞内时，硫氧还蛋白过氧化物酶可以与游
离的血红蛋白相结合，从而防止血红蛋白的氧化损伤，但是，在本申请的器官灌注液中，硫
氧还蛋白过氧化物酶是否能与相比游离血红蛋白结构差异巨大的聚合血红蛋白协同作用，
从而发挥与常规抗氧化作用显著不同的新功能—即防止聚合血红蛋白降解为游离血红蛋
白，增强聚合血红蛋白的稳定性，更是完全无法预知；
其五，发明人发现，其他同属于红细胞内还原酶系统的超氧化物歧化酶或者硫氧
还蛋白，在与聚合血红蛋白进行组合后，相比于仅添加聚合血红蛋白的灌注液，器官保存时
间几乎没有延长，而本申请的灌注液中，聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶可以有效
地协同配合，显著延长了离体器官的保存时间。
由此可知，本申请的离体器官灌注液相比于现有技术，具有非显而易见性，且取得
了预料不到的技术效果，对现有技术做出了实质性贡献。
为此，在本发明的第一方面，本发明提供了一种离体器官灌注液，基于每1000mL的总体积，其由以下物质组成：
聚合血红蛋白20～40g，如25g、30g或35g；
硫氧还蛋白过氧化物酶4～10g，如6g、6.7g或8g；
肝素钠20000～30000u，如23000u、25000u或27000u；
葡萄糖8～10g，如8.5g、9g或9.5g；
氯化钠6～8g，如6.5g、7g或7.5g；
头孢西丁钠1～3g，如1.5g、2g或2.5g；
碳酸氢钠1～1.5g，如1g、1.25g或1.5g；
10％复方氨基酸注射液40～60mL，如45mL、50mL或55mL；
注射用12种复合维生素0.1～0.3mL，如0.15mL、0.2mL或0.25mL；和
余量水；
其中，所述聚合血红蛋白是通过如下方法获得的：
利用60μm的深层过滤器过滤血液，获得红细胞；利用0.65μm中空纤维膜洗涤所述红细胞；利用低渗液裂解所述洗涤后的所述红细胞，获得裂解产物；通过100KD超滤所述裂解产物获得粗纯血红蛋白；利用阴离子交换层析纯化所述粗纯血红蛋白，获得精纯血红蛋白；将戊二醛以雾化的方式与所述精纯血红蛋白进行聚合反应；利用硼氢化钠终止所述聚合反应，并进行30KD超滤换液，获得所述聚合血红蛋白。
在一些实施方案中，基于每1g的硫氧还蛋白过氧化物酶，所述离体器官灌注液包括：
聚合血红蛋白4～5g，如4.3g、4.5g或4.7g；
硫氧还蛋白过氧化物酶1g；
肝素钠3000～5000u，如3500u、3700u、4000u、4500u或4700u；
葡萄糖1～2g，如1.3g、1.5g或1.7g；
氯化钠0.8～1.5g，如1.0g、1.2g或1.4g；
头孢西丁钠0.25～0.3g，如0.26g、0.27g、0.28g或0.29g；
碳酸氢钠0.15～0.25g，如0.17g、0.18g、0.19g、0.20g、0.21g、0.22g或0.23g；
10％复方氨基酸注射液6～10mL，如7.5mL、8mL、8.5mL、9mL或9.5mL；
注射用12种复合维生素0.025～0.03mL，如0.026mL、0.027mL、0.028mL或0.029mL。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
聚合血红蛋白30g，
硫氧还蛋白过氧化物酶6.7g，
肝素钠25000u，
葡萄糖9g，
氯化钠7g，
头孢西丁钠2g，
碳酸氢钠1.25g，
10％复方氨基酸注射液50mL，
注射用12种复合维生素0.2mL，和
余量水。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
聚合血红蛋白40g，
硫氧还蛋白过氧化物酶10g，
肝素钠30000u，
葡萄糖10g，
氯化钠8g，
头孢西丁钠3g，
碳酸氢钠1.5g，
10％复方氨基酸注射液60mL，
注射用12种复合维生素0.3mL，和
余量水。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
聚合血红蛋白20g，
硫氧还蛋白过氧化物酶4g，
肝素钠20000u，
葡萄糖8g，
氯化钠6g，
头孢西丁钠1g，
碳酸氢钠1g，
10％复方氨基酸注射液40mL，
注射用12种复合维生素0.1mL，和
余量水。
在一些实施方案中，所述硫氧还蛋白过氧化物酶为硫氧还蛋白过氧化物酶II。
在一些实施方案中，所述头孢西丁钠为注射用头孢西丁钠。
在一些实施方案中，所述10％复方氨基酸注射液为辰欣药业生产的10％复方氨基酸注射液。
在一些实施方案中，所述注射用12种复合维生素为山西普德药业股份有限公司生产的“注射用12种复合维生素”。
在一些实施方案中，所述水为注射水。
在一些实施方案中，所述离体器官为心脏、肝脏、肾脏或肺脏。
在一些实施方案中，所述离体器官为哺乳动物的离体器官。
在一些实施方案中，所述哺乳动物为人、狗、大鼠或猪。
在一些实施方案中，所述聚合血红蛋白是通过如下方法获得的：
采集新鲜血液，用0.5～1倍所述血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液进行稀释；
用60μm的深层过滤器过滤所述稀释后的所述血液，并用6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗60μm的深层过滤器上的残留物直至通过所述过滤器的血红蛋白达到95％以上；
将上述通过60μm的深层过滤器的物质置于0.65μm中空纤维膜上，使用5～8倍于初始血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗0.65μm中空纤维膜上的物质使得小于0.65μm的物质通过0.65μm中空纤维膜；
向被0.65μm中空纤维膜截留的物质按1:1～2于初始血液体积加入注射水以裂解红细胞，用100KD滤膜超滤裂解的红细胞，透过端为所需的血红蛋白，同时依据透过速率加入注射用水以保持恒定的超滤体积，直至血红蛋白的收率≥95％，停止100KD超滤；
用30KD膜包浓缩前述经100KD滤膜纯化的血红蛋白至其浓度为血红蛋白浓度10～14g/dl；
将上述浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白经阴离子层析纯化(20mM tris的溶液平衡柱子→40min上完样品→3倍于浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白体积的29Mmtris溶液洗杂→4-5倍于浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白体积的50mM tris溶液洗脱)以得到精纯的血红蛋白；
将上述获得的精纯的血红蛋白置于30KD滤膜上，用3倍于精纯的血红蛋白体积的50mM磷酸氢二钠缓冲换液；
然后通入惰性气体脱氧至氧合血红蛋白小于5％，按1g血红蛋白35～45mg戊二醛的比例以雾化的方法加入戊二醛(具体见已有专利：201910846580.9)，接着按1g的血红蛋白13～18mg的硼氢化钠终止聚合反应；
接着将获得的聚合血红蛋白浓缩至6-7g/dL，将浓缩至6-7g/dL的聚合血红蛋白置于30KD的超滤膜包上，使用5～8倍于6-7g/dL的聚合血红蛋白的体积的乳酸林格氏液(氯化钠6.73g/L、氯化钾0.3g/L、二水氯化钙0.2g/L、40％乳酸钠3.07g/L、N-乙酰-L-半胱氨酸22g/L)换液得到聚合血红蛋白，通入惰性气体进行脱氧至氧合血红蛋白含量≤5％，0.2um过滤除菌，获得所述聚合血红蛋白。
在上述的实施方案中，在所述离体器官灌注液中还可以加入160-200U胰岛素，例如万邦金桥制药公司生产的胰岛素；优选，180U胰岛素，例如万邦金桥制药公司生产的胰岛素。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种保存移植用离体器官的方法，所述器官为从循环系统分离获得的器官，其包括：利用前述的离体器官灌注液灌注所述移植用离体器官。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括：将灌注后的所述移植用离体器官浸没在前述的离体器官灌注液中。
在一些实施方案中，所述灌注和/或所述浸没是在温度为2～40℃(如2℃、4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃)的条件下进行的。
在一些实施方案中，所述灌注和/或所述浸没是在温度为10～30℃(如10℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、25℃或30℃)的条件下进行的。
在一些实施方案中，所述灌注和/或所述浸没是在温度为16-20℃(如18℃)的条件下进行的。
在一些实施方案中，所述离体器官为心脏、肝脏、肾脏或肺脏。
在一些实施方案中，所述离体器官为哺乳动物的离体器官。
在一些实施方案中，所述哺乳动物为人、狗、大鼠或猪。
在本发明的第三方面，本发明提供了前述的离体器官灌注液在制备药物中的用途，所述药物用于保存移植用离体器官，所述器官为从循环系统分离获得的器官；
或者，所述药物用于减轻或修复移植用离体器官功能障碍。
在一些实施方案中，所述保存、所述减轻或所述修复在2～40℃(如2℃、4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃)进行。
在一些实施方案中，所述保存、所述减轻或所述修复在4～37℃(如4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃)进行。
在一些实施方案中，所述保存、所述减轻或所述修复在10～30℃(如10℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、25℃或30℃)进行。
在一些实施方案中，所述保存、所述减轻或所述修复在16-20℃(如18℃)进行。
在一些实施方案中，所述离体器官为心脏、肝脏、肾脏或肺脏。
在一些实施方案中，所述离体器官为哺乳动物的离体器官。
在一些实施方案中，所述哺乳动物为人、狗、大鼠或猪。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种组合物，其包括：
聚合血红蛋白；和硫氧还原蛋白过氧化物酶。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述组合物包括：
聚合血红蛋白20～40g，如25g、30g或35g；
硫氧还蛋白过氧化物酶4～10g，如6g、6.7g或8g。
在一些实施方案中，所述聚合血红蛋白与所述硫氧还原蛋白过氧化物酶的重量比为4：1～5：1，如为4.3：1、4.5：1或4.7：1。
在一些实施方案中，所述组合物进一步包括：
肝素钠；
葡萄糖；
氯化钠；
头孢西丁钠；
碳酸氢钠；
10％复方氨基酸注射液；和
注射用12种复合维生素。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述组合物进一步包括：
肝素钠20000～30000u，如23000u、25000u或27000u；
葡萄糖8～10g，如8.5g、9g或9.5g；
氯化钠6～8g，如6.5g、7g或7.5g；
头孢西丁钠1～3g，如1.5g、2g或2.5g；
碳酸氢钠1～1.5g，如1.0g、1.25g或1.5g；
10％复方氨基酸注射液40～60mL，如45mL、50mL或55mL；
注射用12种复合维生素0.1～0.3mL，如0.15mL、0.2mL或0.25mL。
在一些实施方案中，基于每1g的硫氧还蛋白过氧化物酶，所述组合物包括：
聚合血红蛋白4～5g，如4.3g、4.5g或4.7g；
硫氧还蛋白过氧化物酶1g；
肝素钠3000～5000u，如3500u、3700u、4000u、4500u或4700u；
葡萄糖1～2g，如1.3g、1.5g或1.7g；
氯化钠0.8～1.5g，如1.0g、1.2g或1.4g；
头孢西丁钠0.25～0.3g，如0.26g、0.27g、0.28g或0.29g；
碳酸氢钠0.15～0.25g，如0.17g、0.18g、0.19g、0.20g、0.21g、0.22g或0.23g；
10％复方氨基酸注射液6～10mL，如7.5mL、8mL、8.5mL、9mL或9.5mL；
注射用12种复合维生素0.025～0.03mL，如0.026mL、0.027mL、0.028mL或0.029mL。
在上述的实施方案中，在所述组合物中还可以加入160-200U胰岛素，例如万邦金桥制药公司生产的胰岛素；优选，180U胰岛素，例如万邦金桥制药公司生产的胰岛素。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述组合物由以下物质组成：
聚合血红蛋白20～40g；
硫氧还蛋白过氧化物酶4～10g；
肝素钠20000～30000u；
葡萄糖8～10g；
氯化钠6～8g；
头孢西丁钠1～3g；
碳酸氢钠1～1.5g；
10％复方氨基酸注射液40～60mL；
注射用12种复合维生素0.1～0.3mL；和
余量水。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述组合物由以下物质组成：
聚合血红蛋白30g，
硫氧还蛋白过氧化物酶6.7g，
肝素钠25000u，
葡萄糖9g，
氯化钠7g，
头孢西丁钠2g，
碳酸氢钠1.25g
10％复方氨基酸注射液50mL，
注射用12种复合维生素0.2mL，和
余量水。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述组合物由以下物质组成：
聚合血红蛋白40g，
硫氧还蛋白过氧化物酶10g，
肝素钠30000u，
葡萄糖10g，
氯化钠8g，
头孢西丁钠3g，
碳酸氢钠1.5g,
10％复方氨基酸注射液60mL，
注射用12种复合维生素0.3mL，和
余量水。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述组合物由以下物质组成：
聚合血红蛋白20g，
硫氧还蛋白过氧化物酶4g，
肝素钠20000u，
葡萄糖8g，
氯化钠6g，
头孢西丁钠1g，
碳酸氢钠1g,
10％复方氨基酸注射液40mL，
注射用12种复合维生素0.1mL，和
余量水。
在一些实施方案中，所述硫氧还蛋白过氧化物酶为硫氧还蛋白过氧化物酶II。
在一些实施方案中，所述头孢西丁钠为注射用头孢西丁钠。
在一些实施方案中，所述水为注射水。
在一些实施方案中，所述10％复方氨基酸注射液为辰欣药业生产的10％复方氨基酸注射液。
在一些实施方案中，所述注射用12种复合维生素为山西普德药业股份有限公司生产的“注射用12种复合维生素”。
在一些实施方案中，所述聚合血红蛋白是通过如下方法获得的：
利用60μm的深层过滤器过滤血液，获得红细胞；利用0.65μm中空纤维膜洗涤所述红细胞；利用低渗液裂解所述洗涤后的所述红细胞，获得裂解产物；通过100KD超滤所述裂解产物获得粗纯血红蛋白；利用阴离子交换层析纯化所述粗纯血红蛋白，获得精纯血红蛋白；将戊二醛以雾化的方式与所述精纯血红蛋白进行聚合反应；利用硼氢化钠终止所述聚合反应，并进行30KD超滤换液，获得所述聚合血红蛋白。
在一些实施方案中，所述聚合血红蛋白是通过如下方法获得的：
采集新鲜血液，用0.5～1倍所述血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液进行稀释；
用60μm的深层过滤器过滤所述稀释后的所述血液，并用6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗60μm的深层过滤器上的残留物直至通过所述过滤器的血红蛋白达到95％以上；
将上述通过60μm的深层过滤器的物质置于0.65μm中空纤维膜上，使用5～8倍于初始血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗0.65μm中空纤维膜上的物质使得小于0.65μm的物质通过0.65μm中空纤维膜；
向被0.65μm中空纤维膜截留的物质按1:1～2于初始血液体积加入注射水以裂解红细胞，用100KD滤膜超滤裂解的红细胞，透过端为所需的血红蛋白，同时依据透过速率加入注射用水以保持恒定的超滤体积，直至血红蛋白的收率≥95％，停止100KD超滤；
用30KD膜包浓缩前述经100KD滤膜纯化的血红蛋白至其浓度为血红蛋白浓度10～14g/dl；
将上述浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白经阴离子层析纯化(20mM tris的溶液平衡柱子→40min上完样品→3倍于浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白体积的29Mmtris溶液洗杂→4-5倍于浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白体积的50mM tris溶液洗脱)以得到精纯的血红蛋白；
将上述获得的精纯的血红蛋白置于30KD滤膜上，用3倍于精纯的血红蛋白体积的50mM磷酸氢二钠缓冲换液；
然后通入惰性气体脱氧至氧合血红蛋白小于5％，按1g血红蛋白35～45mg戊二醛的比例以雾化的方法加入戊二醛(具体见已有专利：201910846580.9)，接着按1g的血红蛋白13～18mg的硼氢化钠终止聚合反应；
接着将获得的聚合血红蛋白浓缩至6-7g/dL，将浓缩至6-7g/dL的聚合血红蛋白置于30KD的超滤膜包上，使用5～8倍于6-7g/dL的聚合血红蛋白的体积的乳酸林格氏液(氯化钠6.73g/L、氯化钾0.3g/L、二水氯化钙0.2g/L、40％乳酸钠3.07g/L、N-乙酰-L-半胱氨酸22g/L)换液得到聚合血红蛋白，通入惰性气体进行脱氧至氧合血红蛋白含量≤5％，0.2um过滤除菌，获得所述聚合血红蛋白。
在上述的实施方案中，在所述组合物中还可以加入160-200U胰岛素，例如万邦金桥制药公司生产的胰岛素；优选，180U胰岛素，例如万邦金桥制药公司生产的胰岛素。
需要说明的是，本发明的组合物可用作灌注液或保存液。作为灌注液，将其灌注入器官的脉管系统以保护所述器官组织和细胞。作为保存液，其用作将器官浸没于其中的浴液。优选地，用本发明的组合物灌注器官并将器官浸没在其中。此外，当局部缺血或缺氧后对器官恢复血流或氧供时，本发明的组合物也可用作再灌注溶液，用于保护局部缺血或缺氧的器官免受进一步损伤。
为此，在本发明的第五方面，本发明提供了一种离体器官保存液、灌注液和/或再灌注液，其包含前述的组合物。
在一些实施方案中，所述离体器官为心脏、肝脏、肾脏或肺脏。
在一些实施方案中，所述离体器官为哺乳动物的离体器官。
在一些实施方案中，所述哺乳动物为人、狗、大鼠或猪。
在本发明的第六方面，本发明提供了一种保存移植用离体器官的方法，所述器官为从循环系统分离获得的器官，其包括：利用前所述的组合物灌注所述器官。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括：将灌注后的所述器官浸没在前述的组合物中。
在一些实施方案中，所述灌注和/或所述浸没是在温度为2～40℃(如2℃、4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃)的条件下进行的。
在一些实施方案中，所述灌注和/或所述浸没在温度为4～37℃(如4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃)的条件下进行。
在一些实施方案中，所述灌注和/或所述浸没是在温度为10～30℃(如10℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、25℃或30℃)的条件下进行的。在一些实施方案中，所述灌注和/或所述浸没是在温度为16-20℃(如18℃)的条件下进行的。
在一些实施方案中，所述离体器官为心脏、肝脏、肾脏或肺脏。
在一些实施方案中，所述离体器官为哺乳动物的离体器官。
在一些实施方案中，所述哺乳动物为人、狗、大鼠或猪。
在本发明的第七方面，本发明提供了前述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于保存移植用离体器官，所述器官为从循环系统分离获得的器官。
在一些实施方案中，所述保存在2～40℃(如2℃、4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃)进行。
在一些实施方案中，所述保存在4～37℃(如4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃)进行。
在一些实施方案中，所述保存在10～30℃(如10℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、25℃或30℃)进行。
在一些实施方案中，所述保存在16-20℃(如18℃)下进行。
在一些实施方案中，所述离体器官为心脏、肝脏、肾脏或肺脏。
在一些实施方案中，所述离体器官为哺乳动物的离体器官。
在一些实施方案中，所述哺乳动物为人、狗、大鼠或猪。
在本发明的第八方面，本发明提供了一种保护移植用缺血和/或缺氧的离体器官免受进一步损伤的方法，其包括：利用前述的组合物灌注所述缺血和/或缺氧的离体器官。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括：将灌注后的所述缺血和/或缺氧的离体器官浸没在前述的组合物中。
在一些实施方案中，所述灌注和/或所述浸没是在温度为2～40℃(如2℃、4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃)的条件下进行的。
在一些实施方案中，所述灌注和/或所述浸没是在温度为4～37℃(如4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃)的条件下进行的。
在一些实施方案中，所述灌注和/或所述浸没是在温度为10～30℃(如10℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、25℃或30℃)的条件下进行的。
在一些实施方案中，所述灌注和/或所述浸没是在温度为16-20℃(如18℃)的条件下进行的。
在一些实施方案中，所述离体器官为心脏、肝脏、肾脏或肺脏。
在一些实施方案中，所述离体器官为哺乳动物的离体器官。
在一些实施方案中，所述哺乳动物为人、狗、大鼠或猪。
在本发明的第九方面，本发明提供了前述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于保护移植用缺血和/或缺氧的离体器官免受进一步损伤。
在一些实施方案中，所述保护是在温度为2～40℃(如2℃、4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃)的条件下进行的。
在一些实施方案中，所述保护在温度为4～37℃(如4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃)的条件下进行。
在一些实施方案中，所述保护是在温度为10～30℃(如10℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、25℃或30℃)的条件下进行的。
在一些实施方案中，所述保护在16-20℃(如18℃)下进行。
在一些实施方案中，所述离体器官为心脏、肝脏、肾脏或肺脏。
在一些实施方案中，所述离体器官为哺乳动物的离体器官。
在一些实施方案中，所述哺乳动物为人、狗、大鼠或猪。
在本发明的第十方面，本发明提供了一种减轻或修复移植用(缺血和/或缺氧的)离体器官功能障碍的方法，其包括：利用前述的组合物灌注所述(缺血和/或缺氧的)离体器官。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括：将灌注后的所述(缺血和/或缺氧的)离体器官浸没在前述的组合物中。
在一些实施方案中，所述灌注和/或所述浸没是在温度为2～40℃(如2℃、4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃)的条件下进行的。
在一些实施方案中，所述灌注和/或所述浸没是在温度为4～37℃(如4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃)的条件下进行。
在一些实施方案中，所述灌注和/或所述浸没是在温度为10～30℃(如10℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、25℃或30℃)的条件下进行的。
在一些实施方案中，所述灌注和/或所述浸没是在温度为16-20℃(如18℃)的条件下进行的。
在一些实施方案中，所述离体器官为心脏、肝脏、肾脏或肺脏。
在一些实施方案中，所述离体器官为哺乳动物的离体器官。
在一些实施方案中，所述哺乳动物为人、狗、大鼠或猪。
在本发明的第十一方面，本发明提供了前述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于减轻或修复移植用(缺血和/或缺氧的)离体器官功能障碍。
在一些实施方案中，所述减轻或所述修复是在温度为2～40℃(如2℃、4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃)的条件下进行的。
在一些实施方案中，所述减轻或所述修复在温度为4～37℃(如4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃)的条件下进行。
在一些实施方案中，所述减轻或所述修复是在温度为10～30℃(如10℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、25℃或30℃)的条件下进行的。
在一些实施方案中，所述减轻或所述修复在16-20℃(如18℃)下进行。
在一些实施方案中，所述离体器官为心脏、肝脏、肾脏或肺脏。
在一些实施方案中，所述离体器官为哺乳动物的离体器官。
在一些实施方案中，所述哺乳动物为人、狗、大鼠或猪。
在本发明的第十二方面，本发明提供了一种药物，其包括前述的组合物，所述药物用于保存移植用从循环系统分离获得的离体器官、保护移植用缺血和/或缺氧的离体器官免受进一步损伤或者减轻或修复移植用(缺血和/或缺氧的)离体器官功能障碍的至少之一。
在本发明中，常温是指2～40℃，优选4～37℃，还优选10～30℃，更优选16-20℃(如18℃)。
有益效果
1、加入的硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ与聚合血红蛋白在灌注液中的相互协同作用，降低了聚合血红蛋白的降解速率，使聚合血红蛋白更长时间的发挥携氧作用。另外，灌注液中硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ通过与聚合血红蛋白的协同配合，还对组织中一氧化氮的生产与清除具有重要的调控作用，这些特性有效的中和了聚合血红蛋白在这方面的副作用，可以更长时间的维持NO、ET-1等器官活性指标在正常范围内；
2、本发明通过硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ与聚合血红蛋白的联合使用极大的延长了体外器官保存的时间，为因供体与受体的错配时间差、异地移植等问题提供了充分的解决时间，减少了因保存时间短造成的器官浪费现象，提高了移植器官的利用率；
3、本发明提供的在常温下携氧灌注液，解决了在缺氧的条件下保存的器官，在其移植再灌注中会造成显著的二次损伤的问题。
4、随着器官移植的逐年增加及不可预料的对长时间器官保存的需求，本发明具有重要的临床应用价值，具有可推广性。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明的目的在于提供一种既能在常温下达到对离体器官的灌注保存的要求，又能显著延长安全器官保存时间的常温机械灌注液。
本发明的另一目的在于提供上述常温机械器官灌注液的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述常温器官灌注液中自制血红蛋白的制备方法。
本发明的目的是这样实现的：一种器官灌注液，其主要由聚合血红蛋白20～40g，硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ4～10g，肝素钠20000～30000u，葡萄糖8～10g，氯化钠6～8g，注射用头孢西丁钠1～3g，碳酸氢钠1.0～1.5g，10％复方氨基酸注射液40～60ml，注射用12种复合维生素0.1～0.3ml，加注射水至1000mL，通入惰性气体进行脱氧，直到氧合血红蛋白含量<5％，密封隔氧保存。
上述各组分的含量优选为：聚合血红蛋白30g，硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ6.7g，肝素钠25000u，葡萄糖9g，氯化钠7g，注射用头孢西丁钠2g，碳酸氢钠1.25g，10％复方氨基酸注射液50ml，注射用12种复合维生素0.2ml，加注射水至1000mL。
本发明的另一目的是这样实现的：上述常温机械器官灌注液的制备方法，其中：在无菌条件下，将所述聚合血红蛋白、硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ、肝素钠、葡萄糖、氯化钠、注射用头孢西丁钠，加注射水至1000mL，混合均匀，脱氧，隔氧塑料袋密封保存。
本发明的再一目的是这样实现的：自制血红蛋白的制备方法，其中：60μm深层血液过滤，0.65um中空纤维膜洗涤红细胞，加入低渗液裂解红细胞，通过100KD超滤得粗纯血红蛋白，上样阴离子交换层析得精纯血红蛋白，戊二醛交联血红蛋白，硼氢化钠终止聚合反应，30KD超滤换液得到自制聚合血红蛋白，其指标要求为：MW≤32,000(游离血红蛋白)≤5％，高铁血红蛋白<5％，氧合血红蛋白<5％。
本发明产品制得后，请即刻使用；本发明的产品经过除菌后，性能稳定，能够保存1～2年。本发明产品的pH值为7.0～8.0。
本发明产品可应用于离体器官的常温器官灌注保存，在安全保存期限内，可有效保证器官的生物活性，依据个体和器官区别，每次使用量为100～1000mL。
具体使用方法为：
肝脏：修整获取肝脏，修整肝门区多余组织，剔清肝门淋巴结，门静脉采用流量恒定模式进行灌注，流量设定为0.5mL/min/g(肝重)，肝动脉采用压力控制模式进行灌注，压力为80/60mmHg，开始常温灌注；心脏：修整获得的心脏，检查后开启离体心脏灌注系统，流量约15ml/min。显微器械提起主动脉，将灌注管道插入，置于主动脉瓣及冠状动脉开口上方，无创血管夹固定，丝线打结固定，取下血管夹，开始常温灌注；肾脏：修正获得的肾脏，连接灌注仪，肾动脉压设置为50～70mmHg进行灌注。
下面将结合具体实施例对本发明进行进一步的解释说明。
实施例1牛血聚合血红蛋白的制备
采集新鲜牛血(自养牛)1L，用0.5～1倍于血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液进行稀释；
用60μm的深层过滤器过滤所述稀释后的所述血液，并用6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗60μm的深层过滤器上的残留物直至通过所述过滤器的血红蛋白达到95％以上；
将上述通过60μm的深层过滤器的物质置于0.65μm中空纤维膜上，使用5～8倍于初始血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗0.65μm中空纤维膜上的物质使得小于0.65μm的物质通过0.65μm中空纤维膜；
向被0.65μm中空纤维膜截留的物质按1:1～2于初始血液体积加入注射水以裂解红细胞，用100KD滤膜超滤裂解的红细胞，透过端为所需的血红蛋白，同时依据透过速率加入注射用水以保持恒定的超滤体积，直至血红蛋白的收率≥95％，停止100KD超滤；
用30KD膜包浓缩前述经100KD滤膜纯化的血红蛋白至其浓度为血红蛋白浓度10～14g/dl；
将上述浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白经阴离子层析纯化(20mM tris的溶液平衡柱子→40min上完样品→3倍于浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白体积的29Mmtris溶液洗杂→4-5倍于浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白体积的50mM tris溶液洗脱)以得到精纯的血红蛋白；
将上述获得的精纯的血红蛋白置于30KD滤膜上，用3倍于精纯的血红蛋白体积的50mM磷酸氢二钠缓冲换液；
然后通入惰性气体脱氧至氧合血红蛋白小于5％，按1g血红蛋白35～45mg戊二醛的比例以雾化的方法加入戊二醛(具体见已有专利：201910846580.9)，接着按1g的血红蛋白13～18mg的硼氢化钠终止聚合反应；
接着将获得的聚合血红蛋白浓缩至6-7g/dL，将浓缩至6-7g/dL的聚合血红蛋白置于30KD的超滤膜包上，使用5～8倍于6-7g/dL的聚合血红蛋白的体积的乳酸林格氏液(氯化钠6.73g/L、氯化钾0.3g/L、二水氯化钙0.2g/L、40％乳酸钠3.07g/L、N-乙酰-L-半胱氨酸22g/L)换液得到聚合血红蛋白，通入惰性气体进行脱氧至氧合血红蛋白含量≤5％，0.2um过滤除菌，获得所述聚合血红蛋白。
用Thermo的HPLC(ULTMATE3000)进行分子量分布分析，所用分子筛柱AgilentAdvance BioSEC2.7um,7.8×300mm，所用流动相为：750mM氯化镁、50mM Tris、0.1mM EDTA，取上述交联的血红蛋白制备样品进行上样，每针上样交联血红蛋白20ug，其MW≤32,000(游离血红蛋白)≤5％为合格；用ABL90FLEX血气分析仪上样60um上述脱氧聚合血红蛋白进行血气值检测，其高铁血红蛋白<5％、氧合血红蛋白<5％为合格。
实施例2猪血聚合血红蛋白的制备
采集新鲜猪血(自养猪)1L，之后的制备过程同实施例1。
实施例3器官灌注液的制备
按每1000ml器官灌注液的配制比例称量各组分：
聚合血红蛋白(实施例1的方法制备)30g
葡萄糖(α-D-葡萄糖，阿拉丁试剂公司)9g
硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ(Thioredoxin peroxidaseⅡ，ProSpec公司)6.7g
肝素钠(heparin sodium，阿拉丁试剂公司)25000u
氯化钠(sodium chloride，国药试剂公司)7g
注射用头孢西丁钠(Cefoxitin Sodium for Injection，信立泰药业)2g
碳酸氢钠(sodium bicarbonate，国药试剂公司)1.25g
10％复方氨基酸注射液(辰欣药业)50ml
注射用12种复合维生素(山西普德药业股份有限公司)0.2ml
无菌条件下，按上述量依次加入葡萄糖、硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ、氯化钠、肝素钠、注射用头孢西丁钠、碳酸氢钠，加注射水至200ml，搅拌至溶解，再加入10％复方氨基酸注射液、注射用12种复合维生素、聚合血红蛋白，注射水定容至1000ml，通入氮气脱氧，直到氧合血红蛋白含量<5％，0.2um过滤除菌，无菌无氧环境下灌装到隔氧塑料袋，热塑封口，即得实施例3灌注液。
实施例4器官灌注液的制备
按每1000ml器官灌注液的配制比例称量各组分：
聚合血红蛋白(实施例2的方法制备)40g
葡萄糖(α-D-葡萄糖，阿拉丁试剂公司)10g
硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ(Thioredoxin peroxidaseⅡ，ProSpec公司)10g
肝素钠(heparin sodium，阿拉丁试剂公司)30000u
氯化钠(sodium chloride，国药试剂公司)8g
注射用头孢西丁钠(Cefoxitin Sodium for Injection，信立泰药业)3g
碳酸氢钠(sodium bicarbonate，国药试剂公司)1.5g
10％复方氨基酸注射液(辰欣药业)60ml
注射用12种复合维生素(山西普德药业股份有限公司)0.3ml
无菌条件下，按上述量依次加入葡萄糖、硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ、氯化钠、肝素钠、注射用头孢西丁钠、碳酸氢钠，加注射水至200ml，搅拌至溶解，再加入10％复方氨基酸注射液、注射用12种复合维生素、聚合血红蛋白，注射水定容至1000ml，通入氮气脱氧，直到氧合血红蛋白含量<5％，0.2um过滤除菌，无菌无氧环境下灌装到隔氧塑料袋，热塑封口，即得实施例4灌注液。
实施例5器官灌注液的制备
按每1000ml器官灌注液的配制比例称量各组分：
聚合血红蛋白(实施例1的方法制备)20g
葡萄糖(α-D-葡萄糖，阿拉丁试剂公司)8g
硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ(Thioredoxin peroxidaseⅡ，自ProSpec公司)4g
肝素钠(heparin sodium，阿拉丁试剂公司)20000u
氯化钠(sodium chloride，国药试剂公司)6g
注射用头孢西丁钠(Cefoxitin Sodium for Injection，信立泰药业)1g
碳酸氢钠(sodium bicarbonate，国药试剂公司)1.0g
10％复方氨基酸注射液(辰欣药业)40ml
注射用12种复合维生素(山西普德药业股份有限公司)0.1ml
无菌条件下，按上述量依次加入葡萄糖、硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ、氯化钠、肝素钠、注射用头孢西丁钠、碳酸氢钠，加注射水至200ml，搅拌至溶解，再加入10％复方氨基酸注射液、注射用12种复合维生素、聚合血红蛋白，注射水定容至1000ml，通入氮气脱氧，直到氧合血红蛋白含量<5％，0.2um过滤除菌，无菌无氧环境下灌装到隔氧塑料袋，热塑封口，即得实施例5灌注液。
实施例6离体猪肝脏在本发明不同浓度配方下的灌注实验
实验猪(巴马小型猪、10-12月龄、20-28kg，购自北京实创世纪小型猪养殖基地)术前禁食12h，禁水6h，麻醉，仰卧固定于手术台上，腹部中线切口进腹，切口上抵胸骨剑突，下达耻骨联合，松解膈下左右三角韧带，结扎胆总管和胰腺分支，肝脏游离、获取在保护第一肝门的情况下，离断肝脏周围的韧带于胸主动脉结扎处上方切断胸主动脉，切断肝上下腔静脉，以切断的胸主动脉作为牵引，将肝脏从后腹壁游离，紧贴脊柱向上游离、剪开肝周后腹膜组织及膈肌，游离主动脉至肝动脉分支以下，并于肝动脉分支以下1cm处切断腹主动脉，获取肝脏，修整肝脏修整肝门区多余组织，剔清肝门淋巴结。连接灌注机，门静脉采用流量恒定模式进行灌注，流量设定为0.5mL/min/g(肝重)，肝动脉采用压力控制模式进行灌注，压力为80/60mmHg，开始18℃灌注。将获得的肝脏分为四组：第一组为乳酸林格液；第二组为本发明实施例3配方；第三组为本发明实施例4配方；第四组为本发明实施例5配方。
各组灌注脏器在0h-1h内每隔20min，1h-72h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中AST(谷草转氨酶)、ALT(谷丙转氨酶)、TBIL(总胆红素)、ET-1(内皮素1)及聚合血红蛋白半衰期(指灌注液中血红蛋白浓度减低到二分之一所花费的时间，为本领域的常规术语)的变化水平；
组织中NO(一氧化氮)的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果表明：经上述不同灌注液对灌注肝脏都有保护作用，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以AST的含量不大于40U/L、ALT的含量不大于40U/L、TBIL的含量不大于20.5umol/L、ET-1的含量不大于20ng/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为40min、30h、32h、28h。上述第二、三、四组灌注液中聚合血红蛋白的半衰期依次为30h、34h、27h。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于1.80umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察,以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示在各灌注液安全时限内，肝小叶轮廓清楚，小叶内的肝窦状隙呈放射状排列，并相互吻合成网，相邻肝小叶间有广泛吻合，并可见到汇管区内的小叶间动脉和小叶间静脉，肝动脉的终末支沿着肝小叶的周边不断汇入肝窦状隙。
综合上述，在常温机械灌注下，第一组、第二组、第三组、第四组上述各指标维持的安全时限分别为40min、30h、32h、28h，表明在本发明的浓度范围内，都可以有效延长离体肝脏灌注保存时间。
实施例7离体大鼠心脏在本发明不同浓度灌注液下的灌注实验
取大鼠(Wistar、9-11周、雌性220-240g、雄性300-350g，购自北京实验动物中心)，麻醉，置于动物台上并固定。剪开腹部皮肤，沿腹白线开腹，至剑突。提出肠道置于一侧，暴露下腔静脉，经下腔静脉注射肝素生理盐水，1min后充分肝素化，剪开腹腔血管放血。迅速开胸，剪去胸腺组织，充分暴露心脏及大血管。游离主动脉无名动脉远端，并剪断，迅速剪断其余大血管，取出心脏，简单修剪。开启离体心脏灌注系统，流量约15ml/min。显微器械提起主动脉，将灌注管道插入，置于主动脉瓣及冠状动脉开口上方，无创血管夹固定，丝线打结固定，取下血管夹，开始18℃灌注。将获得的心脏分为四组：第一组为乳酸林格液；第二组为本发明实施例3配方；第三组为本发明实施例4配方；第四组为本发明实施例5配方。
各组灌注脏器在0h-1h内每隔10min，1h-72h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中的CTN(肌钙蛋白)、CK-MB(肌酸激酶同工酶)、ANP(血心纳肽)及聚合血红蛋白半衰期的变化水平；
组织中NO的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果表明：经上述不同灌注液对灌注心脏都有保护作用，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以CTN的含量不大于0.13ug/L、CK-MB的含量不大于16U/L、ANP的含量不大于54pmol/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为50min、32h、34h、30h。上述第二、三、四组灌注液中聚合血红蛋白的半衰期依次为32h、35h、28h。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于2.30umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察,以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示在各灌注液安全时限内，心肌间质网络呈现密集蜂巢状，肌细胞位于肌细胞鞘内，肌细胞鞘呈现出圆形或椭圆形结构，鞘外表面的胶原纤维呈网状排列，肌细胞鞘外表面胶原纤维的走向不一致，呈现出网状结构，胶原纤维直径粗细不等，都呈现正常状态。
综合上述，在常温机械灌注下，第一组、第二组、第三组、第四组上述各指标维持的安全时限分别为50min、32h、34h、30h，表明在本发明的浓度范围内，都可以有效延长离体心脏灌注保存时间。
实施例8离体狗肾脏在本发明不同浓度灌注液下的灌注实验
取实验狗(成年比格犬、7-10kg、购自北京实验动物中心)，麻醉，呈正中仰卧位固定，开腹后分离组织，暴露并切取肾脏，修整，连接灌注仪，肾动脉压设置为55mmHg进行18℃灌注。将获得的肾脏分为四组：第一组为乳酸林格液；第二组为本发实施例3配方；第三组为本发明实施例4配方；第四组为本发明实施例5配方。
各组灌注脏器在0h-120h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中的Scr(肌酐)、BUN(尿素氮)、ET-1(内皮素1)及聚合血红蛋白半衰期的变化水平；
组织中NO的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果表明：经上述不同灌注液对灌注肾脏都有保护作用，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以Scr的含量不大于120μmol/L、BUN的含量不大于7.0mmol/L、ET-1的含量不大于20ng/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为2h、108h、113h、102h。上述第二、三、四组灌注液中聚合血红蛋白的半衰期依次为78h、86h、72h。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果都为不低于3.40umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察,以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示在各灌注液安全时限内，核型大致正常，核质分布均匀，线粒体轻微肿胀，但嵴排列尚良好，个别嵴膜间隙略增宽。内质网亦有轻度肿胀。近曲小管上皮细胞微绒毛水肿、增粗，个别脱落。毛细血管内皮与滤过膜内皮细胞轻微水肿，结构尚清，呈现正常状态。
综合上述，在常温机械灌注下，第一组、第二组、第三组、第四组上述各指标维持的安全时限分别为2h、108h、113h、102h，表明在本发明的浓度范围内，都可以有效延长离体肾脏灌注保存时间。
实施例9废弃人肝在本发明不同浓度灌注液下的灌注实验
从医院获取废弃人肝脏，修整肝脏修整肝门区多余组织，剔清肝门淋巴结。连接灌注仪，门静脉采用流量恒定模式进行灌注，流量设定为0.5mL/min/g(肝重)，肝动脉采用压力控制模式进行灌注，压力为80/60mmHg，开始18℃灌注。将获得的肝脏分为四组：第一组为乳酸林格液；第二组为本发明实施例3配方；第三组为本发明实施例4配方；第四组为本发明实施例5配方。
各组灌注脏器在0h-1h内每隔20min，1h-72h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中的AST、ALT、TBIL、ET-1及聚合血红蛋白半衰期的变化水平；
组织中NO的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果表明：经上述不同灌注液对灌注肝脏都有保护作用，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以AST的含量不大于40U/L、ALT的含量不大于40U/L、TBIL的含量不大于20.5umol/L、ET-1的含量不大于20ng/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为40min、30h、32h、28h。上述第二、三、四组灌注液中聚合血红蛋白的半衰期依次为30h、34h、27h。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于1.80umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察,以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示在各灌注液安全时限内，肝小叶轮廓清楚，小叶内的肝窦状隙呈放射状排列，并相互吻合成网，相邻肝小叶间有广泛吻合，并可见到汇管区内的小叶间动脉和小叶间静脉，肝动脉的终末支沿着肝小叶的周边不断汇入肝窦状隙。
综合上述，在常温机械灌注下，第一组、第二组、第三组、第四组上述各指标维持的安全时限分别为40min、30h、32h、28h，表明在本发明的浓度范围内，都可以有效延长离体人肝脏灌注保存时间。
实施例10离体猪肝脏在不同温度下的灌注实验
实验猪(巴马小型猪、10-12月龄、20-28kg，购自北京实创世纪小型猪养殖基地)术前禁食12h，禁水6h，麻醉，仰卧固定于手术台上，腹部中线切口进腹，切口上抵胸骨剑突，下达耻骨联合，松解膈下左右三角韧带，结扎胆总管和胰腺分支，肝脏游离、获取在保护第一肝门的情况下，离断肝脏周围的韧带于胸主动脉结扎处上方切断胸主动脉，切断肝上下腔静脉，以切断的胸主动脉作为牵引，将肝脏从后腹壁游离，紧贴脊柱向上游离、剪开肝周后腹膜组织及膈肌，游离主动脉至肝动脉分支以下，并于肝动脉分支以下1cm处切断腹主动脉，获取肝脏，修整肝脏修整肝门区多余组织，剔清肝门淋巴结。连接灌注机，门静脉采用流量恒定模式进行灌注，流量设定为0.5mL/min/g(肝重)，肝动脉采用压力控制模式进行灌注，压力为80/60mmHg，开始不同温度灌注。将获得的肝脏分为三组：第一组为本发明实施例3配方4℃灌注；第二组为本发明实施例3配方18℃灌注；第三组为本发明实施例3配方37℃灌注。
各组灌注脏器在0h-1h内每隔20min，1h-72h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中的AST、ALT、TBIL、ET-1及聚合血红蛋白的半衰期的变化水平；
组织中NO的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果表明：经上述不同灌注液对灌注肝脏都有保护作用，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以AST的含量不大于40U/L、ALT的含量不大于40U/L、TBIL的含量不大于20.5umol/L、ET-1的含量不大于20ng/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为35h、30h、27h。上述各组灌注液聚合血红蛋白的半衰期依次为42h、38h、32h。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于1.80umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察,以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示在各灌注液安全时限内，肝小叶轮廓清楚，小叶内的肝窦状隙呈放射状排列，并相互吻合成网，相邻肝小叶间有广泛吻合，并可见到汇管区内的小叶间动脉和小叶间静脉，肝动脉的终末支沿着肝小叶的周边不断汇入肝窦状隙。
综合上述，在不同温度机械灌注下，第一组、第二组、第三组上述各指标维持的安全时限分别为35h、30h、27h，表明在不同的温度灌注范围，都可以有效延长离体肝脏灌注保存时间。
实施例11离体大鼠心脏在不同温度下的灌注实验
取大鼠(Wistar、9-11周、雌性220-240g、雄性300-350g，购自北京实验动物中心)，麻醉，置于动物台上并固定。剪开腹部皮肤，沿腹白线开腹，至剑突。提出肠道置于一侧，暴露下腔静脉，经下腔静脉注射肝素生理盐水，1min后充分肝素化，剪开腹腔血管放血。迅速开胸，剪去胸腺组织，充分暴露心脏及大血管。游离主动脉无名动脉远端，并剪断，迅速剪断其余大血管，取出心脏，简单修剪。开启离体心脏灌注系统，流量约15ml/min。显微器械提起主动脉，将灌注管道插入，置于主动脉瓣及冠状动脉开口上方，无创血管夹固定，丝线打结固定，取下血管夹，开始常温灌注。将获得的心脏分为三组：第一组为本发明实施例3配方4℃灌注；第二组为本发明实施例3配方18℃灌注；第三组为本发明实施例3配方37℃灌注。
各组灌注脏器在0h-1h内每隔10min，1h-72h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中的CTN、CK-MB、ANP及聚合血红蛋白半衰期的变化水平；
组织中NO的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果表明：经上述不同灌注液对灌注心脏都有保护作用，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以CTN的含量不大于0.13ug/L、CK-MB的含量不大于16U/L、ANP的含量不大于54pmol/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为37h、32h、28h。上述各组灌注液聚合血红蛋白的半衰期依次为46h、42h、35h。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于2.30umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察,以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示在各灌注液安全时限内，心肌间质网络呈现密集蜂巢状，肌细胞位于肌细胞鞘内，肌细胞鞘呈现出圆形或椭圆形结构，鞘外表面的胶原纤维呈网状排列，肌细胞鞘外表面胶原纤维的走向不一致，呈现出网状结构，胶原纤维直径粗细不等，都呈现正常状态。
综合上述，在常温机械灌注下，第一组、第二组、第三组、第四组上述各指标维持的安全时限分别为37h、32h、28h，表明在本发明不同灌注温度下，都可以有效延长离体心脏灌注保存时间。
对比例1离体猪肝脏不同配方灌注液灌注实验结果对比
实验猪(巴马小型猪、10-12月龄、20-28kg，购自北京实创世纪小型猪养殖基地)术前禁食12h，禁水6h，麻醉，仰卧固定于手术台上，腹部中线切口进腹，切口上抵胸骨剑突，下达耻骨联合，松解膈下左右三角韧带，结扎胆总管和胰腺分支，肝脏游离、获取在保护第一肝门的情况下，离断肝脏周围的韧带于胸主动脉结扎处上方切断胸主动脉，切断肝上下腔静脉，以切断的胸主动脉作为牵引，将肝脏从后腹壁游离，紧贴脊柱向上游离、剪开肝周后腹膜组织及膈肌，游离主动脉至肝动脉分支以下，并于肝动脉分支以下1cm处切断腹主动脉，获取肝脏，修整肝脏修整肝门区多余组织，剔清肝门淋巴结。连接灌注机，门静脉采用流量恒定模式进行灌注，流量设定为0.5mL/min/g(肝重)，肝动脉采用压力控制模式进行灌注，压力为80/60mmHg，开始18℃灌注。将获得的肝脏分为六组：第一组为乳酸林格液；第二组为本发明实施例3配方中去掉硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ的灌注液；第三组为本发明实施例3配方；第四组为本发明实施例3配方中用硫氧还蛋白(Thioredoxin购自sigma公司)替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ；第五组为本发明实施例3配方中用超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase购自sigma公司)替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ；第六组为本发明实施例3配方中去掉聚合血红蛋白的灌注液。
各组灌注脏器在0h-1h内每隔20min，1h-72h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中AST、ALT、TBIL、ET-1及聚合血红蛋白半衰期的变化水平；
组织中NO(一氧化氮)的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果表明：经上述不同灌注液对灌注肝脏都有保护作用，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以AST的含量不大于40U/L、ALT的含量不大于40U/L、TBIL的含量不大于20.5umol/L、ET-1的含量不大于20ng/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为40min、18h、30h、18h、18h、40min。上述第二、三、四、五组的聚合血红蛋白的半衰期依次为20h、30h、20h、20h。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于1.80umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察,以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示在各灌注液安全时限内，肝小叶轮廓清楚，小叶内的肝窦状隙呈放射状排列，并相互吻合成网，相邻肝小叶间有广泛吻合，并可见到汇管区内的小叶间动脉和小叶间静脉，肝动脉的终末支沿着肝小叶的周边不断汇入肝窦状隙。
结果分析：
在常温机械灌注下，上述第二、三、四、五组的聚合血红蛋白的半衰期依次为20h、30h、20h、20h(如下表1所示)，从第二组单独使用聚合血红蛋白和第三组本发明的半衰期结果对比可以看出，聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ联合使用，可以明显延长聚合血红蛋白的半衰期，显著降低了聚合血红蛋白的降解速率，显著增强了聚合血红蛋白的稳定性。第四组用硫氧还蛋白(Thioredoxin，abcam中国)替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ，并不能延长聚合血红蛋白的半衰期，第五组使用超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，ProSpec公司)代替硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ，也不能延长聚合血红蛋白的半衰期，说明本发明聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ在器官灌注液中的协同作用具有特异性。
在常温机械灌注下，第一组、第二组、第三组、第四组、第五组、第六组上述各指标维持的安全时限分别为40min、18h、30h、18h、18h、40min(如下表1所示)，从第三组本发明可以看出聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ联合使用，可以明显延长肝脏的保存时间。第四组用硫氧还蛋白(Thioredoxin，abcam中国)替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ并不能延长肝脏的保存时间，第五组使用超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，ProSpec公司)代替硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ也不能延长肝脏的保存时间，第二组、第六组单独使用硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ或聚合血红蛋白都不能有效延长肝脏的保存时间，说明本发明聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ在器官灌注液中的协同作用具有特异性。
表1：离体猪肝脏不同配方灌注液灌注实验结果对比
对比例2离体大鼠心脏不同配方灌注液灌注实验结果对比
取大鼠(Wistar、9-11周、雌性220-240g、雄性300-350g，购自北京实验动物中心)，麻醉，置于动物台上并固定。剪开腹部皮肤，沿腹白线开腹，至剑突。提出肠道置于一侧，暴露下腔静脉，经下腔静脉注射肝素生理盐水，1min后充分肝素化，剪开腹腔血管放血。迅速开胸，剪去胸腺组织，充分暴露心脏及大血管。游离主动脉无名动脉远端，并剪断，迅速剪断其余大血管，取出心脏，简单修剪。开启离体心脏灌注系统，流量约15ml/min。显微器械提起主动脉，将灌注管道插入，置于主动脉瓣及冠状动脉开口上方，无创血管夹固定，丝线打结固定，取下血管夹，开始18℃灌注。将获得的心脏分为五组：第一组为乳酸林格液；第二组为本发明实施例3配方中去掉硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ的灌注液；第三组为本发明实施例3配方；第四组为本发明实施例3配方中用硫氧还蛋白替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ；第五组为本发明实施例3配方中用超氧化物歧化酶替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ；第六组为本发明实施例3配方中去掉聚合血红蛋白的灌注液。
各组灌注脏器在0h-1h内每隔10min，1h-72h每隔1小时八个主要时间点采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液CTN、CK-MB、ANP及聚合血红蛋白半衰期的变化水平；
组织中NO(一氧化氮)的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果表明：经上述不同灌注液对灌注心脏都有保护作用，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以CTN的含量不大于0.13ug/L、CK-MB的含量不大于16U/L、ANP的含量不大于54pmol/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为50min、20h、32h、20h、20h、50min。上述第二、三、四、五组的聚合血红蛋白的半衰期依次为24h、32h、24h、24h。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于2.30umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察,以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示在各灌注液安全时限内，心肌间质网络呈现密集蜂巢状，肌细胞位于肌细胞鞘内，肌细胞鞘呈现出圆形或椭圆形结构，鞘外表面的胶原纤维呈网状排列，肌细胞鞘外表面胶原纤维的走向不一致，呈现出网状结构，胶原纤维直径粗细不等，结果呈现正常状态。
结果分析：
在常温机械灌注下，上述第二、三、四、五组的聚合血红蛋白的半衰期依次为24h、32h、24h、24h(如下表2所示)，从第二组单独使用聚合血红蛋白和第三组本发明的半衰期结果对比可以看出，聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ联合使用，可以明显延长聚合血红蛋白的半衰期，显著降低了聚合血红蛋白的降解速率，显著增强了聚合血红蛋白的稳定性。第四组用硫氧还蛋白(Thioredoxin，abcam中国)替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ，并不能延长聚合血红蛋白的半衰期，第五组使用超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，ProSpec公司)代替硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ，也不能延长聚合血红蛋白的半衰期，说明本发明聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ在器官灌注液中的协同作用具有特异性。
在常温机械灌注下，第一组、第二组、第三组、第四组、第五组、第六组上述各指标维持的安全时限分别为50min、20h、32h、20h、20h、50min(如下表2所示)，从第三组本发明可以看出聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ联合使用，可以明显延长心脏的保存时间。第四组用硫氧还蛋白替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ并不能延长心脏的保存时间，第五组使用超氧化物歧化酶代替硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ也不能延长心脏的保存时间，第二组、第六组单独使用硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ或聚合血红蛋白都不能有效延长心脏的保存时间，说明本发明聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ在器官灌注液中的协同作用具有特异性。
表2：离体大鼠心脏不同配方灌注液灌注实验结果对比
对比例3离体狗肾脏不同配方灌注液灌注实验结果对比
取实验狗(成年比格犬、7-10kg、购自北京实验动物中心)，麻醉，呈正中仰卧位固定，开腹后分离组织，暴露并切取肾脏，修整，连接灌注仪，肾动脉压设置为55mmHg进行18℃灌注。将获得的肾脏分为六组：第一组为乳酸林格液；第二组为本发明实施例3配方中去掉硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ的灌注液；第三组为本发明实施例3配方；第四组为本发明实施例3配方中用硫氧还蛋白替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ；第五组为本发明实施例3配方中用超氧化物歧化酶替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ；第六组为本发明实施例3配方中去掉聚合血红蛋白的灌注液。
各组灌注脏器在0h-120h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中Scr、BUN、ET-1及聚合血红蛋白半衰期的变化水平；
组织中NO(一氧化氮)的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果表明：经上述不同灌注液对灌注肾脏都有保护作用，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以Scr的含量不大于120μmol/L、BUN的含量不大于7.0mmol/L、ET-1的含量不大于20ng/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为2h、72h、108h、72h、72h、2h。上述第二、三、四、五组的聚合血红蛋白的半衰期依次为36h、78h、36h、36h。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于3.40umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察,以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示在各灌注液安全时限内，核型大致正常，核质分布均匀，线粒体轻微肿胀，但嵴排列尚良好，个别嵴膜间隙略增宽。内质网亦有轻度肿胀。近曲小管上皮细胞微绒毛水肿、增粗，个别脱落。毛细血管内皮与滤过膜内皮细胞轻微水肿，结构尚清，呈现正常状态。
结果分析：
在常温机械灌注下，上述第二、三、四、五组的聚合血红蛋白的半衰期依次为36h、78h、36h、36h(如下表3所示)，从第二组单独使用聚合血红蛋白和第三组本发明的半衰期结果对比可以看出，聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ联合使用，可以明显延长聚合血红蛋白的半衰期，显著降低了聚合血红蛋白的降解速率，显著增强了聚合血红蛋白的稳定性。第四组用硫氧还蛋白(Thioredoxin，abcam中国)替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ，并不能延长聚合血红蛋白的半衰期，第五组使用超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，ProSpec公司)代替硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ，也不能延长聚合血红蛋白的半衰期，说明本发明聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ在器官灌注液中的协同作用具有特异性。
在常温机械灌注下，第一组、第二组、第三组、第四组、第五组、第六组上述各指标维持的安全时限分别为2h、72h、108h、72h、72h、2h(如下表3所示)，从第三组本发明可以看出聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ联合使用，可以明显延长肾脏的保存时间。第四组用硫氧还蛋白替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ并不能延长肾脏的保存时间，第五组使用超氧化物歧化酶代替硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ也不能延长肾脏的保存时间，第二组、第六组单独使用硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ或聚合血红蛋白都不能有效延长肾脏的保存时间，说明本发明聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ在器官灌注液中的协同作用具有特异性。
表3：离体狗肾脏不同配方灌注液灌注实验结果对比
对比例4废弃人肝不同配方灌注液灌注实验结果对比
从医院获取废弃人肝脏，修整肝脏修整肝门区多余组织，剔清肝门淋巴结。连接灌注仪，门静脉采用流量恒定模式进行灌注，流量设定为0.5mL/min/g(肝重)，肝动脉采用压力控制模式进行灌注，压力为80/60mmHg，开始18℃灌注。将获得的肝脏分为六组：第一组为乳酸林格液；第二组为本发明实施例3配方中去掉硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ的灌注液；第三组为本发明实施例3配方；第四组为本发明实施例3配方中用硫氧还蛋白替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ；第五组为本发明实施例3配方中用超氧化物歧化酶替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ；第六组为本发明实施例3配方中去掉聚合血红蛋白的灌注液。
各组灌注脏器在0h-1h内每隔20min，1h-72h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中AST(谷草转氨酶)、ALT(谷丙转氨酶)、TBIL(总胆红素)、ET-1(内皮素1)及聚合血红蛋白半衰期的变化水平
组织中NO(一氧化氮)的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果表明：经上述不同灌注液对灌注肝脏都有保护作用，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以AST的含量不大于40U/L、ALT的含量不大于40U/L、TBIL的含量不大于20.5umol/L、ET-1的含量不大于20ng/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为40min、18h、30h、18h、18h、40min。上述第二、三、四、五组的聚合血红蛋白的半衰期依次为20h、30h、20h、20h。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于1.80umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察,以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示在各灌注液安全时限内，肝小叶轮廓清楚，小叶内的肝窦状隙呈放射状排列，并相互吻合成网，相邻肝小叶间有广泛吻合，并可见到汇管区内的小叶间动脉和小叶间静脉，肝动脉的终末支沿着肝小叶的周边不断汇入肝窦状隙。
结果分析：
在常温机械灌注下，上述第二、三、四、五组的聚合血红蛋白的半衰期依次为20h、30h、20h、20h(如下表4所示)，从第二组单独使用聚合血红蛋白和第三组本发明的半衰期结果对比可以看出，聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ联合使用，可以明显延长聚合血红蛋白的半衰期，显著降低了聚合血红蛋白的降解速率，显著增强了聚合血红蛋白的稳定性。第四组用硫氧还蛋白(Thioredoxin，abcam中国)替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ，并不能延长聚合血红蛋白的半衰期，第五组使用超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，ProSpec公司)代替硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ，也不能延长聚合血红蛋白的半衰期，说明本发明聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ在器官灌注液中的协同作用具有特异性。
在常温机械灌注下，第一组、第二组、第三组、第四组、第五组、第六组上述各指标维持的安全时限分别为40min、18h、30h、18h、18h、40min(如下表4所示)，从第三组本发明可以看出聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ联合使用，可以明显延长肝脏的保存时间。第四组用硫氧还蛋白替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ并不能延长肝脏的保存时间，第五组使用超氧化物歧化酶代替硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ也不能延长肝脏的保存时间，第二组、第六组单独使用硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ或聚合血红蛋白都不能有效延长肝脏的保存时间，说明本发明聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ在器官灌注液中的协同作用具有特异性。
表4：废弃人肝不同配方灌注液灌注实验结果对比
需要说明的是，在下面的对比例5～8中，在用林格氏液灌注靶器官制备损伤模型时，靶器官的损伤并非是由于该林格氏液对器官有损伤作用而形成的，而是靶器官在缺氧条件下造成的损伤，其会分泌损伤标志物。在后续损伤修复实验中，更换新的林格氏液也需要一定的分泌时间才可使损伤标志物达到安全上限。
对比例5离体猪肝脏损伤修复的灌注试验比较
实验猪(巴马小型猪、10-12月龄、20-28kg，购自北京实创世纪小型猪养殖基地)术前禁食12h，禁水6h，麻醉，仰卧固定于手术台上，腹部中线切口进腹，切口上抵胸骨剑突，下达耻骨联合，松解膈下左右三角韧带，结扎胆总管和胰腺分支，肝脏游离、获取在保护第一肝门的情况下，离断肝脏周围的韧带于胸主动脉结扎处上方切断胸主动脉，切断肝上下腔静脉，以切断的胸主动脉作为牵引，将肝脏从后腹壁游离，紧贴脊柱向上游离、剪开肝周后腹膜组织及膈肌，游离主动脉至肝动脉分支以下，并于肝动脉分支以下1cm处切断腹主动脉，获取肝脏，修整肝脏修整肝门区多余组织，剔清肝门淋巴结。连接灌注机，门静脉采用流量恒定模式进行灌注，流量设定为0.5mL/min/g(肝重)，肝动脉采用压力控制模式进行灌注，压力为80/60mmHg，开始18℃灌注。首先用乳酸林格氏液灌注，当灌注液中的AST的含量大于40U/L、ALT的含量大于40U/L、TBIL的含量大于20.5umol/L、ET-1的含量大于20ng/L时，再将其分为四组：第一组为林格氏液；第二组为本发明实施例3配方中去掉硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ的灌注液；第三组为本发明实施例3配方；第四组为本发明实施例3配方中去掉聚合血红蛋白的灌注液。
各组灌注脏器在0h-1h内每隔5min，1h-72h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中AST、ALT、TBIL、ET-1及聚合血红蛋白半衰期的变化水平；
组织中NO(一氧化氮)的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果表明：在用林格氏液灌注肝脏制备的损伤模型中(其标准为：当灌注液中的AST的含量大于40U/L、ALT的含量大于40U/L、TBIL的含量大于20.5umol/L、ET-1的含量大于20ng/L，电镜结果显示：肝小叶轮廓不清楚，难以分辨汇管区内的小叶间动脉和小叶间静脉等具有明显的损伤特征判为合格模型)，用上述四种灌注液进行损伤恢复灌注，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以AST的含量不大于40U/L、ALT的含量不大于40U/L、TBIL的含量不大于20.5umol/L、ET-1的含量不大于20ng/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为25min、8h、15h、25min。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于1.80umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察,以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示第一组和第四组无器官损伤恢复作用，灌注后其肝小叶轮廓还是不清楚，还是难以分辨汇管区内的小叶间动脉和小叶间静脉等明显的损伤特征。第二组和第三组具有器官损伤恢复作用，电镜显示肝小叶又恢复到轮廓清楚，小叶内的肝窦状隙呈放射状排列，并相互吻合成网，相邻肝小叶间有广泛吻合，并又恢复到可见到汇管区内的小叶间动脉和小叶间静脉，肝动脉的终末支沿着肝小叶的周边不断汇入肝窦状隙，但从轮廓恢复度和规整度看第三组的恢复比第二组的更优。
结果分析：
在常温机械灌注下，第一组、第二组、第三组、第四组上述各指标维持的安全时限分别为25min、8h、15h、25min(如下表5所示)，从第三组本发明可以看出聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ联合使用，可以明显延长肝脏的保存时间并对损伤的器官有明显的恢复作用。第二组单独使用聚合血红蛋白也可恢复损伤的器官，但效果不如第三组的本发明灌注液。第一、四组不使用硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ和聚合血红蛋白或单独使用硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ都不能有效恢复损伤的器官，说明本发明聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ在器官灌注液具有良好的协同作用，具有更优的损伤器官恢复作用。
表5：离体猪肝脏损伤修复灌注试验结果对比
对比例6离体大鼠心脏损伤修复的灌注试验比较
取大鼠(Wistar、9-11周、雌性220-240g、雄性300-350g，购自北京实验动物中心)，麻醉，置于动物台上并固定。剪开腹部皮肤，沿腹白线开腹，至剑突。提出肠道置于一侧，暴露下腔静脉，经下腔静脉注射肝素生理盐水，1min后充分肝素化，剪开腹腔血管放血。迅速开胸，剪去胸腺组织，充分暴露心脏及大血管。游离主动脉无名动脉远端，并剪断，迅速剪断其余大血管，取出心脏，简单修剪。开启离体心脏灌注系统，流量约15ml/min。显微器械提起主动脉，将灌注管道插入，置于主动脉瓣及冠状动脉开口上方，无创血管夹固定，丝线打结固定，取下血管夹，开始18℃灌注。首先用乳酸林格氏液灌注，当灌注液中的CTN的含量大于0.13ug/L、CK-MB的含量大16U/L、ANP的含量大于54pmol/L时，再将其分为四组：第一组为林格氏液；第二组为本发明实施例3配方中去掉硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ的灌注液；第三组为本发明实施例3配方；第四组为本发明实施例3配方中去掉聚合血红蛋白的灌注液。
各组灌注脏器在0h-1h内每隔10min，1h-72h每隔1小时八个主要时间点采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液CTN、CK-MB、ANP及聚合血红蛋白半衰期的变化水平；
组织中NO(一氧化氮)的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果表明：在用林格氏液灌注肝脏制备的损伤模型中(其标准为：当灌注液中的CTN的含量大于0.13ug/L、CK-MB的含量大16U/L、ANP的含量大于54pmol/L，电镜结果显示：心肌间质网络呈现不清晰的密集蜂巢状，肌细胞位于肌细胞鞘内，肌细胞鞘呈现出不规则的圆形或椭圆形结构，鞘外表面的胶原纤维呈模糊的网状排列等具有明显的损伤特征判为合格模型)，用上述四种灌注液进行损伤恢复灌注，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以CTN的含量不大于0.13ug/L、CK-MB的含量不大于16U/L、ANP的含量不大于54pmol/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为30min、9h、16h、30min。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于2.30umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察,以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示第一组和第四组无器官损伤恢复作用，心肌间质网络还是呈现不清晰的密集蜂巢状，肌细胞位于肌细胞鞘内，肌细胞鞘还是呈现出不规则的圆形或椭圆形结构，鞘外表面的胶原纤维还是呈模糊的网状排列等明显的损伤特征。第二组和第三组具有器官损伤恢复作用，心肌间质网络又呈现清晰的密集蜂巢状，肌细胞位于肌细胞鞘内，肌细胞鞘又呈现出规则的圆形或椭圆形结构，鞘外表面的胶原纤维又呈清晰的网状排列，肌细胞鞘外表面胶原纤维的走向不一致，又呈现出清晰的网状结构，胶原纤维直径粗细不等，结果恢复到正常状态，但从轮廓恢复度和细胞形态恢复度看第三组的恢复比第二组的更优。
结果分析：
在常温机械灌注下，第一组、第二组、第三组、第四组上述各指标维持的安全时限分别为30min、9h、16h、30min(如下表6所示)，从第三组本发明可以看出聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ联合使用，可以明显延长心脏的保存时间并对损伤的器官有明显的恢复作用。第二组单独使用聚合血红蛋白也可恢复损伤的器官，但效果不如第三组的本发明灌注液。第一、四组不使用硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ和聚合血红蛋白或单独使用硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ都不能有效恢复损伤的器官，说明本发明聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ在器官灌注液具有良好的协同作用，具有更优的损伤器官恢复作用。
表6：离体大鼠心脏损伤修复灌注试验结果对比
对比例7离体狗肾脏损伤修复的灌注试验比较
取实验狗(成年比格犬、7-10kg、购自北京实验动物中心)，麻醉，呈正中仰卧位固定，开腹后分离组织，暴露并切取肾脏，修整，连接灌注仪，肾动脉压设置为55mmHg进行18℃灌注。首先用乳酸林格氏液灌注，当灌注液中的Scr的含量大于120μmol/L、BUN的含量大于7.0mmol/L、ET-1的含量大于20ng/L时，再将其分为四组：第一组为林格氏液；第二组为本发明实施例3配方中去掉硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ的灌注液；第三组为本发明实施例3配方；第四组为本发明实施例3配方中去掉聚合血红蛋白的灌注液。
各组灌注脏器在0h-1h内每隔10min，1h-120h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中Scr、BUN、ET-1及聚合血红蛋白半衰期的变化水平；
组织中NO(一氧化氮)的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果表明：在用林格氏液灌注肝脏制备的损伤模型中(其标准为：Scr的含量大于120μmol/L、BUN的含量大于7.0mmol/L、ET-1的含量大于20ng/L，电镜结果显示：核型大致正常，核质分布不均匀，线粒体轻严重肿胀，但嵴排列较差，个别嵴膜间隙略增宽。内质网亦有严重肿胀。近曲小管上皮细胞微绒毛水肿、增粗，较多的脱落。毛细血管内皮与滤过膜内皮细胞严重水肿，结构不清等具有明显的损伤特征判为合格模型)，用上述四种灌注液进行损伤恢复灌注，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以Scr的含量不大于120μmol/L、BUN的含量不大于7.0mmol/L、ET-1的含量不大于20ng/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为50min、28h、46h、50min。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于3.40umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察,以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示第一组和第四组无器官损伤恢复作用，核型大致正常，核质分布不均匀，线粒体轻严重肿胀，但嵴排列较差，个别嵴膜间隙略增宽。内质网亦有严重肿胀。近曲小管上皮细胞微绒毛水肿、增粗，较多的脱落。毛细血管内皮与滤过膜内皮细胞严重水肿，结构不清等明显的损伤特征。第二组和第三组具有器官损伤恢复作用，核型大致正常，核质分布恢复到均匀，线粒体恢复到轻微肿胀，嵴排列良好，个别嵴膜间隙略增宽。内质网亦恢复到轻度肿胀。近曲小管上皮细胞微绒毛恢复到轻微水肿、增粗，个别脱落。毛细血管内皮与滤过膜内皮细胞恢复到轻微水肿，结构较清，呈现正常状态，但从轮廓恢复度和细胞形态恢复度看第三组的恢复比第二组的更优。
结果分析：
在常温机械灌注下，第一组、第二组、第三组、第四组上述各指标维持的安全时限分别为50min、28h、46h、50min(如下表7所示)，从第三组本发明可以看出聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ联合使用，可以明显延长肾脏的保存时间并对损伤的器官有明显的恢复作用。第二组单独使用聚合血红蛋白也可恢复损伤的器官，但效果不如第三组的本发明灌注液。第一、四组不使用硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ和聚合血红蛋白或单独使用硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ都不能有效恢复损伤的器官，说明本发明聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ在器官灌注液具有良好的协同作用，具有更优的损伤器官恢复作用。
表7：离体狗肾脏损伤修复灌注试验结果对比
对比例8废弃人肝损伤修复的灌注试验比较
从医院获取废弃人肝脏，修整肝脏修整肝门区多余组织，剔清肝门淋巴结。连接灌注仪，门静脉采用流量恒定模式进行灌注，流量设定为0.5mL/min/g(肝重)，肝动脉采用压力控制模式进行灌注，压力为80/60mmHg，开始18℃灌注。首先用乳酸林格氏液灌注，当灌注液中的AST的含量大于40U/L、ALT的含量大于40U/L、TBIL的含量大于20.5umol/L、ET-1的含量大于20ng/L时，再将其分为四组：第一组为林格氏液；第二组为本发明实施例3配方中去掉硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ的灌注液；第三组为本发明实施例3配方；第四组为本发明实施例3配方中去掉聚合血红蛋白的灌注液。
各组灌注脏器在0h-1h内每隔5min，1h-72h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中AST、ALT、TBIL、ET-1及聚合血红蛋白半衰期的变化水平；
组织中NO(一氧化氮)的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果表明：在用林格氏液灌注肝脏制备的损伤模型中(其标准为：当灌注液中的AST的含量大于40U/L、ALT的含量大于40U/L、TBIL的含量大于20.5umol/L、ET-1的含量大于20ng/L，电镜结果显示：肝小叶轮廓不清楚，难以分辨汇管区内的小叶间动脉和小叶间静脉等具有明显的损伤特征判为合格模型)，用上述四种灌注液进行损伤恢复灌注，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以AST的含量不大于40U/L、ALT的含量不大于40U/L、TBIL的含量不大于20.5umol/L、ET-1的含量不大于20ng/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为25min、8h、15h、25min。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于1.80umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察,以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示第一组和第四组无器官损伤恢复作用，灌注后其肝小叶轮廓还是不清楚，还是难以分辨汇管区内的小叶间动脉和小叶间静脉等明显的损伤特征。第二组和第三组具有器官损伤恢复作用，电镜显示肝小叶又恢复到轮廓清楚，小叶内的肝窦状隙呈放射状排列，并相互吻合成网，相邻肝小叶间有广泛吻合，并又恢复到可见到汇管区内的小叶间动脉和小叶间静脉，肝动脉的终末支沿着肝小叶的周边不断汇入肝窦状隙，但从轮廓恢复度和规整度看第三组的恢复比第二组的更优。
结果分析：
在常温机械灌注下，第一组、第二组、第三组、第四组上述各指标维持的安全时限分别为25min、8h、15h、25min(如下表8所示)，从第三组本发明可以看出聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ联合使用，可以明显延长肝脏的保存时间并对损伤的器官有明显的恢复作用。第二组单独使用聚合血红蛋白也可恢复损伤的器官，但效果不如第三组的本发明灌注液。第一、四组不使用硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ和聚合血红蛋白或单独使用硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ都不能有效恢复损伤的器官，说明本发明聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ在器官灌注液具有良好的协同作用，具有更优的损伤器官恢复作用。
表8：废弃人肝损伤修复灌注试验结果对比
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种离体器官灌注液，基于每1000mL的总体积，其由以下物质组成：
基于每1g的硫氧还蛋白过氧化物酶II，其包括：
聚合血红蛋白4～5g；
硫氧还蛋白过氧化物酶II 1g；
肝素钠3000～5000u；
葡萄糖1～2g；
氯化钠0.8～1.5g；
头孢西丁钠0.25～0.3g；
碳酸氢钠0.15～0.25g；
10％复方氨基酸注射液6～10mL；
注射用12种复合维生素0.025～0.03mL；
和余量水；
其中，所述聚合血红蛋白通过如下方法获得：
采集新鲜血液，用0.5～1倍所述血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液进行稀释；
用60μm的深层过滤器过滤所述稀释后的所述血液，并用6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗60μm的深层过滤器上的残留物直至通过所述过滤器的血红蛋白达到95％以上；
将上述通过60μm的深层过滤器的物质置于0.65μm中空纤维膜上，使用5～8倍于初始血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗0.65μm中空纤维膜上的物质使得小于0.65μm的物质通过0.65μm中空纤维膜；
向被0.65μm中空纤维膜截留的物质按1:1～2于初始血液体积加入注射水以裂解红细胞，用100KD滤膜超滤裂解的红细胞，透过端为所需的血红蛋白，同时依据透过速率加入注射用水以保持恒定的超滤体积，直至血红蛋白的收率≥95％，停止100KD超滤；
用30KD膜包浓缩前述经100KD滤膜纯化的血红蛋白至其浓度为血红蛋白浓度10～14g/dl；
将上述浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白经阴离子层析纯化(20mM tris的溶液平衡柱子→40min上完样品→3倍于浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白体积的29Mmtris溶液洗杂→4-5倍于浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白体积的50mM tris溶液洗脱)以得到精纯的血红蛋白；
将上述获得的精纯的血红蛋白置于30KD滤膜上，用3倍于精纯的血红蛋白体积的50mM磷酸氢二钠缓冲换液；
然后通入惰性气体脱氧至氧合血红蛋白小于5％，按1g血红蛋白35～45mg戊二醛的比例以雾化的方法加入戊二醛(具体见已有专利：201910846580.9)，接着按1g的血红蛋白13～18mg的硼氢化钠终止聚合反应；
接着将获得的聚合血红蛋白浓缩至6-7g/dL，将浓缩至6-7g/dL的聚合血红蛋白置于30KD的超滤膜包上，使用5～8倍于6-7g/dL的聚合血红蛋白的体积的乳酸林格氏液(氯化钠6.73g/L、氯化钾0.3g/L、二水氯化钙0.2g/L、40％乳酸钠3.07g/L、N-乙酰-L-半胱氨酸22g/L)换液得到聚合血红蛋白，通入惰性气体进行脱氧至氧合血红蛋白含量≤5％，0.2um过滤除菌，获得所述聚合血红蛋白。
2.权利要求1所述的离体器官灌注液，基于每1000mL的总体积，其由以下物质组成：
聚合血红蛋白30g，
硫氧还蛋白过氧化物酶II 6.7g，
肝素钠25000u，
葡萄糖9g，
氯化钠7g，
头孢西丁钠2g，
碳酸氢钠1.25g，
10％复方氨基酸注射液50mL，
注射用12种复合维生素0.2mL，和
余量水；
或者
聚合血红蛋白40g，
硫氧还蛋白过氧化物酶II 10g，
肝素钠30000u，
葡萄糖10g，
氯化钠8g，
头孢西丁钠3g，
碳酸氢钠1.5g，
10％复方氨基酸注射液60mL，
注射用12种复合维生素0.3mL，和
余量水；
或者
聚合血红蛋白20g，
硫氧还蛋白过氧化物酶II 4g，
肝素钠20000u，
葡萄糖8g，
氯化钠6g，
头孢西丁钠1g，
碳酸氢钠1g，
10％复方氨基酸注射液40mL，
注射用12种复合维生素0.1mL，和
余量水。
3.权利要求1～2任一项所述的离体器官灌注液，其中，所述头孢西丁钠为注射用头孢西丁钠；或者
所述水为注射水；或者
所述10％复方氨基酸注射液为辰欣药业生产的10％复方氨基酸注射液；或者
所述注射用12种复合维生素为山西普德药业股份有限公司生产的“注射用12种复合维生素”；或者
所述离体器官为心脏、肝脏、肾脏或肺脏；
优选地，所述离体器官为人、狗、大鼠或猪的离体器官。
4.权利要求1～3任一项所述的离体器官灌注液在制备药物中的用途，所述药物用于保存移植用离体器官，所述器官为从循环系统分离获得的器官；
或者，所述药物用于减轻或修复移植用离体器官功能障碍。
5.权利要求4所述的用途，其中，所述保存、所述减轻或所述修复在2～40℃、优选4～37℃、还优选10～30℃、更优选16～20℃、最优选18℃下进行；或者
所述离体器官为心脏、肝脏、肾脏或肺脏；
优选地，所述离体器官为人、狗、大鼠或猪的离体器官。
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